胆道闭锁异常肝组织蛋白筛查及预后相关性研究

目的 初步鉴定胆道闭锁肝组织异常蛋白表达情况,寻找与胆道闭锁发病和预后有关的差异表达蛋白.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离胆道闭锁和正常肝脏组织总蛋白,银染显色,Melanie3.02 2D图像分析软件分析,对部分蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定,查询数据库鉴定差异蛋白质.结果 获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,蛋白质匹配率达800%以上.胆道闭锁和正常组比较发现表达量变化达2倍以上的蛋白点有33个,表达量变化达4倍以上者有8个.胆道闭锁预后较好者和预后不好者比较发现表达量变化达4倍以上的蛋白点有22个,表达量变化达5倍以上者有18个.质谱鉴定其中15个点,其中7个点鉴定成功,分别是Viperin、SARM1、GPC3、APC、THUM2、MIA3和KIAA0649.结论 本研究成功鉴定出部分与胆道闭锁发病和预后有关的蛋白质,为进一步研究胆道闭锁致病机制和提高手术预后提供了新的研究方向,有进一步研究的价值.

Abstract：

Objective To investigate the expression of hepatic protein in patients with biliary atresia(BA), and find the relationship between the significant protein and prognosis of biliary atresia.Methods Immobile pH gradients isoelectric focusing was used as 1D, and vertical SDS-PAGE as 2D.Sliver staining, Melanie3. 02 2D analysis software, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and NCBInr database searching were used to separate and identify the proteome from liver in patients with biliary atresia. Results Satisfactory 2DE patterns were obtained. Thirty-three protein spots were remarkably changed in patients with biliary atresia compared with the control group. Twenty-two protein spots were significantly difference between BA patients with good prognosis and BA patients with poor prognosis. Fifteen protein spots were referred to mass spectrometry, and 7 protein spots were identified, including Viperin, SARM1, GPC3, APC,THUM2, MIA3 and KIAA0649. Conclusions In this study, proteins related to the prognosis and pathogenesis of biliary atresia were identified, which may contribute to prognosis and pathogenesis of biliary atresia.     

胸膜核因子-κB表达与胸膜纤维化相关性研究

目的 探讨胸膜核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的表达与胸膜纤维化形成的相关性.方法 对27例胸腔积液患儿进行胸腔镜手术治疗,术中取病理,通过HE染色分组,进行NF-κB免疫组织化学检测.结果 无胸膜纤维化组NF-κB免疫组织化学中只有少数类上皮细胞染色,阳性细胞数低于20%,而胸膜纤维化组NF-κB免疫组织化学染色细胞数大于40%,呈强阳性表达,明显高于无胸膜纤维化组(χ2=16.67,P<0.05).胸膜表达NF-κB同纤维化相关检测Gamma值为0.75,呈正相关.结论 胸膜纤维化与NF-κB存在相关性.     

胆道闭锁肝内毛细胆管HLA-DR表达免疫电镜研究

目的用免疫电镜技术检测胆道闭锁患儿肝内毛细胆管微绒毛人类白细胞抗原DR(HLA-DR)表达的变化。方法对14例胆道闭锁及12例对照组婴儿的肝活检标本,行肝内毛细胆管HLA-DR免疫电镜染色研究,并结合临床预后进行分析。结果14例胆道闭锁患儿中毛细胆管微绒毛表达HLA-DR阳性8例,对照组均不表达HLA-DR,差异有显著性(P<0.05),胆道闭锁肝内毛细胆管微绒毛HLA-DR表达与预后呈负相关(γ=-0.748,P<0.05)。结论免疫电镜发现,胆道闭锁患儿肝内毛细胆管微绒毛有HLA-DR异常表达,可能与局部的免疫应答和本病的发病机理有关。     

核转录因子Gli在胆道闭锁肝上皮间充质转化中的调控作用

目的:研究胆道闭锁肝纤维化过程中Shh信号通路核转录因子Gli1/Gli2在肝上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)中的调控作用,为阐明胆道闭锁肝纤维化的机制提供依据。方法:选择2018年1月至2018年12月经手术证实为胆道闭锁Ⅲ型患儿的肝活检组织标本10例作为...     

核因子-κB与川崎病

核因子-κB(NF-κB)是调节多种炎症和免疫基因表达的一种重要的转录调节因子,其过度激活与许多病理现象有关,已引起人们广泛地关注。本文综述了NF-κB的生物学特性、功能及其与川崎病的关系。     

胆道闭锁肝内胆管上皮E-cadherin的表达及其与细胞凋亡相关性研究

目的研究胆道闭锁(biliaryatresia,BA)肝内胆管上皮Ecadherin的表达及胆管上皮细胞凋亡情况,初步探讨其与BA发生的关系。方法应用Ecadherin免疫组化染色方法和末端脱氧苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷(Dutp)缺口末端标记技术(TUNEL法)观察38例胆道闭锁患儿与16例正常对照儿童肝内胆管上皮Ecadherin表达及胆管上皮细胞凋亡情况。结果胆道闭锁患儿肝内胆管上皮Ecadherin表达强度0.33±0.12较正常对照0.62±0.20显著降低(P<0.01),胆管上皮细胞凋亡指数为0.5174±0.1993明显高于正常对照0.1234±0.1932(P<0.01),BA组肝内胆管上皮Ecadherin表达强度与胆管上皮细胞凋亡指数呈显著负相关(r=-0.853)。结论BA发生与肝内胆管上皮Ecadherin异常降低有关,可能是通过异常降低的Ecadherin上调胆管上皮细胞凋亡数量,导致肝内胆管发育障碍,产生“胆管板畸形”的方式来实现的。     

小鼠胆道闭锁肝脏组织干扰素-γ及其受体mRNA表达

目的 动态检测小鼠胆道闭锁(biliary atresia,BA)模型肝脏组织中干扰素-γ(IFN-γ)及其受体IFN-γ R mRNA的表达情况,探索其与BA发生的关系.方法 采用腹腔注射恒河猴轮状病毒建立BALB/c新生小鼠BA模型,其巾BA组45只,对照组24只(腹腔注射病毒培养液).应用RT-PCR方法检测小鼠模型肝脏中IFN-γ及其受体mRNA的表达.结果 与对照组小鼠相比,不同鼠龄BA组肝内IFN-γ mRNA的表达水平均明显高于对照组,并出现先升高后降低趋势,第九天时达到峰值,约为对照组30倍.IFN-γ受体mRNA表达水平同样出现先升高后下降趋势,第九天达到最高水平,明显高于对照组.IFN-γ受体mRNA在第3、6、9、14天时明显高于对照组,到第21天时恢复到基线水平.结论 小鼠BA模型肝组织中IFN-γ及其受体mRNA表达水平基本同步上调,IFN-γ通过受体特异性功能在BA炎症的发生及发展过程中发挥重要作用.     

脑白质损伤新生大鼠核转录因子-κB和诱导型一氧化氮合酶表达的变化

目的研究缺氧缺血(HI)对新生大鼠脑白质胶质细胞核转录因子κB(NF-κB)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响,探讨NF-κB及iNOS在新生大鼠脑白质损伤(WMD)发病机制中的作用。方法将2日龄大鼠随机分为实验组和假手术组,建立新生大鼠WMD模型,分别于HI后1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d及7 d处死,对其脑组织取材后行HE染色观察其病理改变,并应用免疫组织化学法检测其NF-κB及iNOS的表达水平。结果在新生大鼠脑白质中,实验组NF-κB表达水平于HI后1 h开始明显上升,12 h达到高峰,至7 d仍明显升高,与对照组比较差异均有统计学意义[(45.2±2.5)vs(35.7±2.1);(62.3±2.9)vs(34.1±2.0);(75.0±3.7)vs(33.6±2.1);(126.2±4.3)vs(14.3±2.4);(81.1±2.6)vs(33.7±2.0);(40.2±2.5)vs(32.5±2.3);(34.6±2.6)vs(31.9±2.8),Pa<0.001]。实验组iNOS于HI后1 h表达开始显著增多,1 d达到高峰,至7 d仍明显升高,与对照组比较差异均有统计学意义[(25.4±1.7)vs(22.7±1.9);(37.9±1.9)vs(21.7±1.2);(53.3±2.1)vs(21.9±1.0);(61.9±1.7)vs(21.7±1.3);(74.0±2.2)vs(22.7±1.5);(57.3±2.2)vs(21.1±1.1);(26.3±2.5)vs(20.8±1.6),Pa<0.001]。实验组脑室周围白质区NF-κB表达与iNOS呈正相关(r=0.977,P<0.001)。结论 HI可导致新生大鼠脑白质NF-κB表达及iNOS水平显著增高,参与新生大鼠WMD的病理生理过程。     

胆道闭锁肝纤维化与血清学监测

胆道闭锁（Biliary Artesia,BA）是新生儿阻塞性黄疸最常见的原因之一。其病理特征为胆管的进行性炎症和肝纤维化,发展速度快,涉及肝内外胆管,虽然通过Kasai手术（即肝门空肠吻合术）能够改善肝内外胆道的梗阻。但多数患儿仍发生进行性肝内胆管破坏和肝纤维化。最后发展为肝硬化和门静脉高压。晚期病例肝脏移植将不可避免。BA病人的预后受多种因素的影响,如Kasai手术时的年龄、病变的类型以及肝纤维化程度等。预测BA的预后以及判断肝纤维化程度。对选择肝移植的手术时机有着极其重要的意义。     

胆道闭锁肝内外胆系免疫炎性反应与临床预后相关分析

目的 测定胆道闭锁(BA)肝组织和肝门纤维块中白细胞分化抗原(CD68)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和细胞间粘附因子-1(ICAM-1)的含量,分析肝内外组织免疫炎性改变与临床预后相关性,旨在了解其在发病过程的重要性.方法 取2005年7月至2006年5月在本院行BA Kasai根治术的21例患儿的肝门纤维块及肝脏组织标本;对照组为5例胆汁淤积综合征患儿和10例胆总管囊肿患儿的肝脏组织标本.采用免疫组化染色法进行CD68、MCP-1和ICAM-1染色.选用LEICA DM研究级生物显微镜,QWIN软件环境下测量抗体阳性细胞面积百分比和平均光密度.随访19例BA患儿术后3个月直接胆红素下降比率,与肝组织CD68、MCP-1和ICAM-1表达量进行相关性分析.结果 BA组肝组织CD68、MCP-1、ICAM-1表达较对照组明显增强,但肝门纤维块几乎没有表达;CD68、MCP-1、ICAM-1阳性表达量和表达强度明显高于对照组,其中ICAM-1最为显著;除了MCP-1外,CD68、ICAM-1在肝脏表达的表达量与表达强度呈线性正相关,相关系数分别是r=0.838,P=0.0002;r=0.565,P=0.035;BA组肝组织CD68阳性表达面积百分比与术后3个月直接胆红素下降率呈负相关(r=-0.645,P=0.023).结论 CD68阳性表达是BA免疫炎性反应过程的一个重要环节,MCP-1和ICAM-1在这一环节中起了一定的作用;肝组织CD68阳性表达可能提示预后不佳.     

Connective tissue growth factor and progressive fibrosis in biliary atresia

Connective tissue growth factor (CTGF) is a newly described protein that stimulates transforming growth factor-1 (TGF-1). We evaluated the expression of CTGF mRNA in operative biopsy specimens from biliary atresia (BA) patients and normal controls to assess the role of CTGF in BA. Liver biopsy specimens were taken from BA patients at the time of portoenterostomy (n=22) and compared with specimens taken from normal controls (n=6). In situ hybridization was used to stain CTGF mRNA in all specimens. The distribution of collagen type IV (C-IV) was also assessed in the same specimens as an indicator of the severity of fibrosis present at the time of biopsy. Results were analyzed to determine whether there was any correlation between CTGF and C-IV and outcome. Of the 22 postoperative BA patients, eventual outcome was good in 17 (group I), and five (group II) subsequently required liver transplantation. Control specimens (n=6) had no apparent CTGF mRNA expression, and median C-IV positive immunoreactivity was 1.23±0.25%. CTGF mRNA was weakly expressed in hepatic stellate cells (HSC) and hepatocytes in specimens from group I, and median C-IV-positive immunoreactivity was 3.18±0.86%. However, in specimens from group II, there was increased CTGF mRNA in HSC and hepatocytes. Median C-IV-positive immunoreactivity was 6.31±0.96%. There was a significant correlation between CTGF mRNA intensity and the amount of C-IV, which implies that CTGF expression reflects prognosis. This study provides the first evidence that CTGF is strongly expressed in BA, in particular in HSC and hepatocytes, suggesting that they may be a source of CTGF. The strong correlation with C-IV indicates that CTGF plays a major role in the pathogenesis of progressive fibrosis in BA.     

胆道闭锁基质金属蛋白酶-1和转化生长因子β1与肝纤维化关系的研究

目的研究胆道闭锁肝组织MMP-1、TIMP-11和TGF-β_1的表达与肝纤维化的关系,探讨胆道闭锁肝纤维化机制。方法利用免疫组化法(S-P法)检测33例胆道闭锁肝组织中MMP-1、TIMP-1、TGF-β_1蛋白的表达,通过图像分析技术进行定量研究。结果胆道闭锁肝组织中MMP-1、TIMP-1、TGF-β_1蛋白均有不同程度表达,以肝细胞胞浆、胞膜表达最为明显。TGF-β_1、TIMP-1蛋白在肝组织中的阳性表达随肝纤维化程度的加重而增强,有正的相关性;MMP-1蛋白在肝组织中的表达,随肝纤维化程度的加重无明显变化,无相关性;TGF-β_1蛋白表达与TIMP-1间有相关性,与MMP-1间无相关性。TGF-β_1、TIMP-1在胆道闭锁肝组织的表达强度明显高于对照组(P<0.01),MMP-1在两组间的表达差异无显著性意义(P>0.05)。结论MMP-1、TIMP-1、TGF-β_1与胆道闭锁肝纤维化的发生、发展有密切联系,TGF-β_1与TIMP-1有协同表达和调控作用,通过抑制肝组织TIMP-1、TGF-β_1蛋白表达,或促进MMP-1的表达,可成为抑制胆道闭锁肝纤维化的有效方法。     

胆道闭锁汇管区炎性细胞浸润及其细胞因子的表达研究

目的 了解胆道闭锁(biliary atresia,BA)肝内汇管区炎症反应类型及细胞因子表达和具体作用机制.方法 应用免疫组织化学、免疫荧光和免疫印迹的方法对18例胆道闭锁患儿与15例先天性胆管扩张症(congenital biliary dilatation ,CBD)患儿肝脏标本进行对比研究.结果 BA患儿肝内汇管区大量CD4+、CD8+、CD68+细胞浸润(与CBD组相比均P＜0.01).肝内Th1通路相关细胞因子IFN-γ(干扰素-γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)表达,而CBD组为阴性.Th2相关细胞因子IL-4(白介素-4)、IL-5(白介素-5)及CD8+相关细胞因子粒酶、穿孔素表达在BA组与CBD组均为阴性.BA组肝内iNOS(诱导型一氧化氮合酶)检测阳性,胆管上皮Fas(自杀相关因子)表达(0.60±0.13)与CBD组(0.29±0.16)相比明显上调(P＜0.01),上皮细胞凋亡指数(49±13)%远大于CBD组(22±16)%(P＜0.01).结论 BA肝内汇管区炎症反应强烈,是由CD4+细胞Th1亚型及其相关细胞因子所介导的原发特异性炎症.巨噬细胞参与的Th1炎症通路可能在BA胆管上皮进行性损伤中起着关键作用.     

胆道闭锁患儿自身免疫性肝病抗体的筛查分析

目的 分析自身免疫性肝病相关抗体在胆道闭锁(BA)患儿血清中检出情况,探讨其在BA临床诊断及致病机制中的意义.方法 采用线性免疫印迹法分别检测81例BA组、48例疾病对照组(DC)和40例正常对照组(NC)血清中自身免疫性肝病IgG抗体,包括原发性胆汁性胆管炎相关抗体(PBC相关抗体,含AMA-M2、抗M2-3E 、抗Spl00、抗PML和抗gp210抗体)、自身免疫性肝炎相关抗体(AIH相关抗体,含抗LKM-1、抗LC-1、抗SLA/LP抗体)以及抗Ro-52抗体.结果 BA组患儿中PBC相关抗体组合检出率为18.5%,单一检出率由高到低分别为抗M2-3E抗体(14.8%)、抗PML抗体(3.7%)、抗gp210抗体(2.5%),AMA-M2(1.2%)和抗sp100抗体(1.2%),其中,抗M2-3E抗体阳性率明显高于NC组((χ)2=5.025,P=0.025),但与DC组(4.2%)无统计学差异(P>0.05).AIH相关抗体在BA患儿中仅检出抗LC-1抗体(7.4%),与DC组(6.3%)、NC组(7.5%)的检出率差异,无统计学意义(P>0.05).抗Ro-52抗体在BA、DC和NC组的检出率分别为6.2%,4.2%和5%,组间无统计学差异(P>0.05).结论 BA患儿血清中存在不同程度检出率的自身免疫性肝病抗体,PBC相关抗体检出率较高,尤其是抗M2-3E抗体.自身抗体的检出提示BA存在针对靶抗原的体液免疫,可能参与BA的免疫致病过程,但其在BA的血清学诊断意义仍待进一步研究.     

胆道闭锁婴幼儿肝移植围术期液体管理

目的 分析胆道闭锁( biliary atresia,BA)婴幼儿肝移植围术期各阶段内环境的变化特点,并探讨相应的液体管理措施.方法 2006年9月至2011年8月我院行胆道闭锁婴幼儿肝脏移植手术24例,围术期连续监测患儿血流动力学,定时采血检测酸碱平衡、乳酸、电解质、血糖等指标,记录液体治疗措施.结果 患儿术中血pH值及碱剩余(BE值)于无肝期即刻下降至术毕接近正常,分别为(7.38±0.09)、(-1.44±0.64),术后开始升高、至术后12h达峰,此后逐渐下降至正常;乳酸于无肝期开始升高(3.31 -±0.8) mmol/L,新肝期30 min达峰,术后6h明显下降,术后12h完全降至正常;血清钾浓度(K+)于新肝期后出现显著下降(3.21±0.52) re mol/L;血清钙浓度(Ca2+)自无肝期出现明显下降(1.03±0.12) m mol/L;血清钠浓度(Na+)于新肝期后出现逐渐升高趋势(141.2±2.9)mmol/l;血糖(BG)于无肝期后明显高于术前水平(7.4±2.8) mmol/L.术后患儿电解质及血糖水平有所波动,但与术后即刻比较无明显变化.24例患儿均顺利完成手术,围术期未发生脱水及心肺事件.术后ICU死亡4例,其余患儿均顺利回到病房.结论 胆道闭锁婴幼儿肝移植围术期内环境呈现规律性变化.术中液体治疗原则与一般腹部大手术有所不同;补液速度相似,但是液体比例以胶体液为主,占液体总量的50 ％以上.术后即期液体治疗与普通外科手术相近.     

新生儿巨细胞病毒感染与胆道闭锁肝脏纤维化的相关研究

目的探讨新生儿巨细胞病毒感染与胆道闭锁肝脏损伤的关系。方法回顾我院2004年1月-2005年1月收治21例胆道闭锁患儿临床资料。对肝组织纤维化和肝细胞变性坏死程度分级，同时进行肝脏和肝门纤维块巨细胞病毒-pp65免疫荧光染色。根据血清及病毒学检查结果将病人分组，比较两组患儿肝功能，肝脏纤维化，肝细胞破坏程度。结果巨细胞病毒感染组13例，非感染组8例。两组肝功能各指标除总胆红素，γ-谷氨酰转肽酶外无明显差异。巨细胞病毒感染组肝脏纤维化程度重于非感染组（P〈0．05）。结论巨细胞病毒活动性感染加重胆道闭锁患儿胆汁淤积和肝脏的纤维化。     

Orthotopic liver transplantation in patients with biliary atresia and situs inversus

Situs inversus (SI) and the polysplenia syndrome (PS) occur relatively frequently in patients with biliary atresia, the largest subgroup of pediatric liver transplantation patients. We present two cases of orthotopic liver transplantation (OLT) in pediatric patients with SI. One had SI totalis, where a normal liver was placed in the left upper quadrant (LUQ) with the right lobe overlying the vertebral column. The second had PS and isolated SI of the liver, and a living-related left-lateral-segment graft was placed in the LUQ. Although multiple, often unpredictable vascular and intestinal anomalies occur frequently in association with SI, particularly in the setting of the PS, these cases, as well as several others recently reported, reveal that these anomalies can be managed successfully by a variety of technical modifications of the standard OLT technique. Likewise, concerns about the placement of a situs solitus liver in the midline or LUQ position of a SI abdomen have proved to be unfounded. Accepted: 24 June 1997     

胆管闭锁与十二指肠乳头异位的关系探讨

目的 胆管闭锁的病因目前尚不清楚,本研究对胰胆的解剖进行造影研究.方法 对221 例胆管闭锁患儿中 47 例(21.3%)进行胆管造影,根据胆囊管和胆总管及十二指肠显影清晰影像进行研究,观察胆总管、胰管、胰胆合流共同管及其开口部位.以同期收治的 29 例非胆管闭锁性黄疸婴儿的胆管造影结果 为对照.结果 对照组29例中7例(24.1%)十二指肠乳头开口于十二指肠降段以远,而胆管闭锁组 47 例中 24 例(51.1%)十二指肠乳头开口于十二指肠降段以远,后者较前者明显增高(P<0.05).胆管闭锁组和对照组合并胰胆合流异常的发生率分别为95.7%(45/47)和82.8%(24/29),二者差异无显著性意义(P>0.122).胆管闭锁患儿胰胆合流共同管的平均长度指数为0.418±0.152,比对照组(0.236±0.122)明显延长,P<0.05.胆管闭锁组胆总管的平均直径指数为0.078±0.043,对照组为0.199±0.086,前者较后者明显细小,P<0.05,而共同管和胰管的直径差异不显著(P>0.05).结论 十二指肠乳头远端开口异位和胰胆合流共同管延长是胆管闭锁影像学改变特点,提示此畸形的病因与胚胎早期肝憩室发育异常有关.     

胆小管增生诱导胆道闭锁早期肝纤维化

目的观察门管区胆小管增生与肝纤维化的关系，进而探讨胆小管增生对胆道闭锁病程的作用和意义。方法选取在1997-2003年间经我科治疗的胆道闭锁(17例)和婴儿肝炎综合征(19例)患儿。术中肝活检标本石蜡切片行常规HE染色和免疫组化染色(Cytokeratin-7，Ki67)，观察手术时年龄、肝纤维化、胆管增生、胆管增生活性和术前直接胆红素水平。结果在胆道闭锁组，不同肝纤维化级别的胆小管增生级别有相关关系(rs=0．561，P=0．019)。结论大量的胆管迅速增生，诱导产生大量的基质沉积于门管区，可能就是胆道闭锁患儿肝纤维化迅速进展的主要原因。