细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞的大容量扩增与杀伤活性观察

建立大容量细胞因子诱导杀伤(Cytokine-inducedkiller,CIK)细胞培养方法,观察CIK细胞回输后对患者细胞免疫功能的影响。采用1000ml培养袋大量扩增患者自体CIK细胞,用MTT法检测CIK细胞杀伤活性,比较回输前后患者外周血单个核细胞(PBMNC)对靶细胞的杀伤活性及其毒副作用。结果表明大容量培养法使自体CIK细胞扩增总量达1.6×1010以上,回输CIK细胞使患者PBMNC的杀伤活性明显增加,未出现毒副作用。因此CIK细胞大容量扩增方法在治疗肿瘤微小残留病变上有着良好的临床应用前景。     

HBsAg脉冲的树突状细胞对CIK细胞功能的影响

目的:探讨HBsAg脉冲的树突状细胞(DC),对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的增殖和杀伤作用的影响。方法:选择慢性乙肝患者23例,用常规方法分离外周血单个核细胞(PBMC),经HBsAg脉冲后培养为特异性的DC,用3H-TdR掺入法检测该细胞对CIK细胞增殖的刺激作用,用乳酸脱氢酶释放法检测特异性CIK细胞对HepG2215细胞的特异性杀伤作用。结果:HBsAg脉冲的DC对CIK细胞的增殖具有刺激作用。由HBsAg脉冲的DC所诱导的特异性CIK细胞对HepG2215细胞的特异性杀伤作用增强。结论:HBsAg脉冲的DC可增强CIK细胞的杀伤活性。     

CIK细胞抗肿瘤研究进展

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)是一种由多种细胞因子诱导的以表达CD3+和CD56+细胞为主的异质性细胞群,对多种肿瘤细胞均有明显的细胞毒活性,即使对化疗失败多重耐药肿瘤细胞亦能产生显著的效果。CIK通过表达CD56分子促进细胞间的黏附和结合,可释放穿孔素、细胞溶解素等使靶细胞产生渗透性溶解,当效靶细胞比为30∶1时,抑瘤效果较好,且不易引起移植物抗宿主病,仅有发热等轻度不良反应。CIK治疗可明显提高肿瘤患者生存率,改善晚期肿瘤患者的生存质量,延长生存期,是一种安全有效的过继免疫治疗方法。     

自体肿瘤抗原致敏的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期肾癌的疗效观察

目的探讨负载自体肿瘤抗原的树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)在晚期肾癌治疗中的临床疗效,并监测患者的免疫状态及不良反应。方法回顾分析2011-01/2013-12期间在我科治疗的82例晚期肾癌患者,单采其外周血单个核细胞(PBMC),其中贴壁细胞经体外诱导产生DC,并负载自体肿瘤细胞裂解物(Ag)制备Ag-DC;T淋巴细胞经体外诱导产生CIK细胞,将Ag-DC与CIK细胞共培养制备Ag-DC-CIK瘤苗,检测DC表面分子的表达及IL-12的分泌,监测CIK细胞增殖情况,并将Ag-DC-CIK分次回输给其中41名患者,以41例单纯的CIK细胞治疗作为对照,治疗2疗程后,检测患者外周血细胞因子水平及T细胞亚群变化,结合影像学等检查综合评价疗效,同时观察不良反应。结果负载肿瘤细胞冻融抗原的DC,高表达CD11c、CD83、CD86、HLA-DR表面分子,IL-12的分泌显著增加。Ag-DC与CIK细胞共培养后,可明显刺激CIK细胞的增殖,同时CD3+CD8+细胞及CD3+CD56+细胞的含量明显增加,此外,Ag-DC-CIK瘤苗的临床疗效明显高于单纯CIK细胞治疗组,2组均未发生严重的不良反应。结论晚期肾癌PBMC来源的DC负载自身肿瘤细胞冻融抗原能提高晚期肾癌患者的免疫状态。     

抗原致敏DC与CIK共培养体外抗肾癌效应的研究

目的： 探讨肾癌(RCC)抗原致敏树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养后的DC-CIK细胞对RCC的杀伤活性。 方法： 将健康成人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC经RCC(786-0细胞株)抗原致敏后与同源CIK细胞共培养，实验分3组：RCC抗原致敏DC与CIK共培养组（A组），未致敏DC与CIK共培养组（B组），单纯CIK组（C组）。流式细胞仪检测DC及CIK免疫表型。MTT法检测3组效应细胞对786-0细胞杀伤活性。 结果： 效靶比 20∶1 时，A、B、C组对786-0细胞杀伤活性分别为（70.64±8.26）%、（53.40±7.33）%、（46.64±6.01）%，各组比较差异显著（P<0.05）；以前列腺癌PC3细胞作靶细胞对照，A组对786-0及PC3细胞的杀伤活性有显著差异（P<0.05）。 结论： RCC抗原致敏DC与CIK共培养后的DC-CIK细胞可明显提高CIK细胞对RCC的杀伤特异性和杀伤活性。     

氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型中抗肿瘤效应的研究

探讨氟尿嘧啶(5-FU)、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用,为临床上联合应用5-FU和CIK细胞治疗结肠癌提供理论依据。建立BALB/C小鼠结肠癌模型,在体外诱导培养小鼠CIK细胞,5-FU(12.5mg/kg,d0)联合CIK细胞(1×107,d3)处理小鼠结肠癌荷瘤模型,并绘制肿瘤生长曲线,生存分析采用Kaplan-Meier法及logrank检验,应用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞CTLA-4和非淋巴细胞CD80、CD86表达;RT-PCR法检测肿瘤组织中IFN-γ和TNF-α表达量。5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单治疗组,差异有统计学意义(P<0.05);5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高,且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加;5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-α表达量,且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义(P<0.05)。5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞,且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型免疫功能。     

胎盘免疫调节因子对CIK细胞活性的影响

目的探讨胎盘免疫调节因子(placentalfactor,PF)对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells,CIK)的增殖及CIK细胞杀伤活性的影响。方法抽取健康人新鲜血液,诱导CIK细胞产生后,设加入不同浓度的PF-CIK组和不加PF的空白CIK组,观察CIK细胞的增殖率和细胞毒活性的变化。结果与不加PF的空白CIK细胞相比较,加不同浓度的PF组CIK细胞的增殖率和杀伤率均有统计学差异(P<0.01)。结论PF可上调节CIK细胞的生长及杀伤活性,为CIK细胞的过继性免疫治疗提供了一种新的方法。     

胃癌干细胞抗原负载树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞

BACKGROUND:As the existence of tumor stem cells, it is difficult to completely eliminate tumors in clinic. OBJECTIVE:To explore the tumor-killing effect of gastric cancer stem cells as antigen to stimulate dendritic cells combined with cytokine-induced killer cells. METHODS:Side population cells from human gastric cancer cell lines were isolated, and tumor antigen was prepared by freeze thawing method. After coculture with dendritic cells, dendritic cells combined with cytokine-induced killer cells, gastric cancer cell antigen, and gastric cancer stem cell antigen, killing rates of gastric cancer cells were detected using MTT assay. Expression rate of CD83, a mature dendritic cell surface marker, was also detected. RESULTS AND CONCLUSION:The CD83 expression level and killing rate of gastric cancer cells were both significantly lower in the gastric cancer stem cell antigen group than the other groups (both P < 0.05). These results indicate that gastric cancer stem cells as antigen to stimulate dendritic cells combined with cytokine-induced killer cells can promote the proliferation of gastric cancer cells and elevate the ability to killing gastric cancer cells.     

恩替卡韦联合细胞因子诱导的杀伤细胞序贯治疗慢性乙型肝炎患者树突状细胞相关功能观察

观察恩替卡韦联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced kill cells,CIK)序贯治疗慢性乙型肝炎患者DC功能变化,为指导CIK联合核苷(类)药物抗病毒治疗提供理论依据。以15例接受恩替卡韦联合CIK序贯治疗的慢性乙型肝炎患者为观察对象,单独接受CIK治疗患者为对照,分别在治疗前、HBVDNA500IU/ml及CIK治疗2周后流式细胞技术测定DC表面共刺激分子CD1a、CD80、CD83及HLA-DR表达水平,同时淋巴细胞增殖实验评估DC细胞功能。结果显示15例恩替卡韦联合CIK序贯治疗患者同治疗前相比在接受恩替卡韦治疗并达到HBVDNA500IU/ml时仅有HLA-DR表达水平高于治疗前,其它共刺激分子标志物及淋巴细胞增殖能力没有显著变化。CIK序贯治疗后DC共刺激分子标志物和HLA-DR水平明显升高,并且淋巴细胞增殖能力也明显升高。单独CIK治疗患者同治疗前比较DC表面分子标志物水平及淋巴细胞增殖能力均无变化,同联合治疗组相比DC标志物水平和淋巴细胞增殖能力均低于联合治疗组。以上结果提示恩替卡韦联合CIK序贯治疗明显提高慢性乙型肝炎患者DC共刺激分子及HLA-DR表达,并诱导免疫细胞应答功能,恩替卡韦联合CIK序贯治疗可能通过增强DC相关功能提高慢性乙肝患者的抗病毒疗效。     

CCK-8对LPS诱导树突状细胞成熟的影响

目的: 观察八肽胆囊收缩素(CCK-8)对脂多糖(LPS)诱导树突状细胞(DCs)成熟的影响。方法: 采用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导法培养小鼠骨髓来源DCs,在LPS诱导其成熟过程中用不同浓度的CCK-8进行干预,采用流式细胞分析技术检测DCs表面主要组织相容性复合物II(MHC II)、分化群80(CD80)和分化群86(CD86)的表达;ELISA法检测DCs培养上清中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;MTT法检测CCK-8处理DCs对同种异体T细胞增殖反应的影响。结果: CCK-8剂量依赖性地抑制LPS诱导DCs表面CD80、CD86和MHC II表达(P<0.01, P<0.05 );CCK-8抑制LPS诱导DCs分泌IL-1β、IL-6和TNF-α(P<0.01);并且,CCK-8降低LPS诱导DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性(P<0.05,P<0.01)。结论: CCK-8对LPS诱导DCs成熟过程中的细胞表型、细胞因子分泌和抗原提呈功能有抑制作用,提示CCK-8有可能在抗感染和抵抗自身免疫性疾病过程中发挥重要调节作用。     

Interaction between dendritic cells and natural killer cells during pregnancy in mice

A complex regulation of innate and adaptive immune responses at the maternal fetal interface promotes tolerance of trophoblast cells carrying paternally derived antigens. Such regulatory functions involve uterine dendritic cells (uDC) and natural killer (uNK) cells. The existence of a NK and DC "cross talk" has been revealed in various experimental settings; its biological significance ranging from cooperative stimulation to cell lysis. Little is known about the presence or role of NK and DC cross talk at the maternal fetal interface. The present study shows that mouse NK and DC interactions are subject to modulation by trophoblast cells in vitro. This interaction promotes a tolerogenic microenvironment characterized by downregulation of the expression of activation markers on uNK cells and uDC and dominance of Th2 cytokines. NK and DC interactions would also influence uterine cell proliferation and this process would be strongly modulated by trophoblast-derived signals. Indeed; while low proliferation rates were observed upon regular coculture allowing direct contact between uterine cells and trophoblasts, incubation in a transwell culture system markedly increased uterine cell proliferation suggesting that soluble factors are key mediators in the molecular "dialog" between the mother and the conceptus during the establishment of mouse pregnancy. Our data further reveal that the regulatory functions of trophoblast cells associated with tolerance induction are impaired in high abortion murine matings. Interestingly, we observed that secretion of interleukin-12p70 by uDC is dramatically abrogated in the presence of uNK cells. Taken together, our results provide the first evidence that a delicate balance of interactions involving NK cells, DC, and trophoblasts at the mouse maternal fetal interface supports a successful pregnancy outcome.     

反义survivin联合顺铂抑制裸鼠荷骨肉瘤生长

目的：探讨反义基因治疗与化疗联合应用提高骨肉瘤疗效的可行性及其机制。 方法:通过构建荷骨肉瘤裸鼠模型，采用瘤内注射和腹腔给药方式，以 survivin反义寡核苷酸（ASODN）配合顺铂（DDP）对瘤鼠进行联合干预治疗，并与各单药组进行比较，观测各组裸鼠肿瘤生长情况、评估瘤体病理形态，免疫组织化学法检测瘤组织survivin蛋白表达，DNA末端原位标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞凋亡水平。 结果:与各单药组相比，联合治疗组在显著下调survivin蛋白表达同时，肿瘤细胞凋亡坏死更为明显，肿瘤生长受抑效果更强。 结论:ASODN对DDP具有明显增效作用，可弥补DDP耐药缺陷，二者联合可望发挥协同抗瘤效应。     

细胞因子诱导的杀伤细胞联合白细胞介素2治疗恶性胸腔积液

目的 观察应用细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞联合白细胞介素2（IL-2）治疗恶性胸腔积液的疗效.方法 收集2009年7月至2013年7月于本院肿瘤科就诊的恶性胸腔积液患者50例,随机数字表法分为治疗组（n=24）和对照组（n=26）.胸腔积液引流净后,治疗组胸腔灌注CIK细胞联合IL-2,连续3d;对照组灌注IL-2联合顺铂,隔日1次,连续3次.治疗4周后评价疗效和不良反应.结果 治疗组有效率87.50％（21/24）,完全缓解率54.17％（13/24）;对照组有效率57.69％（15/26）,完全缓解率42.31％（11/26）.与对照组比较,治疗组的完全缓解率、有效率均增加（均P＜0.05）.不良反应比较显示,治疗组发热的发生率较高,而对照组胸痛、胃肠道反应、骨髓抑制的发生率较高（均P＜ 0.05）.与治疗前比较,治疗后两组患者的Karnofsky评分均增加（均P＜0.05）.结论 CIK细胞联合IL-2胸腔灌注治疗恶性胸腔积液不良反应小,疗效确切.     

白藜芦醇诱导人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤凋亡的研究

目的：探讨白藜芦醇诱导人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤凋亡的机制。 方法： 建立人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤模型，采用瘤旁注射的方法，用不同剂量的白藜芦醇进行治疗，并设对照，用透射电镜和TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况，免疫组织化学法和RT-PCR法检测肿瘤组织的凋亡相关基因bcl-2和bax的表达情况。 结果： 白藜芦醇对胃癌原代细胞移植瘤有明显的抑制作用； 透射电镜和TUNEL法发现白藜芦醇导致移植瘤内大量细胞发生凋亡；免疫组织化学法发现白藜芦醇注射组的Bcl-2蛋白阳性细胞率（3.92％±0.85％、5.70％±0.84％和11.86％±0.97％）明显低于两个对照组（P<0.05），两个对照组（27.56％±1.40％和29.48％±0.51％）之间无显著差异；Bax蛋白阳性细胞率（52.30％±1.54％、45.72％±0.88％和40.02％±1.20％）明显高于两个对照组（P<0.05），两个对照组（20.88％±0.91％和19.34％±0.35％）之间无显著差异； RT-PCR法发现白藜芦醇注射组的bcl-2 mRNA条带强度随剂量的增大而递减，并明显低于两个对照组（P<0.05），两个对照组之间无显著差异（P>0.05）；bax mRNA条带强度递增，并明显高于两个对照组（P<0.05），两个对照组之间无显著差异（P>0.05）。 结论： 白藜芦醇对胃癌原代细胞移植瘤有明显的抑制作用，通过下调bcl-2 的表达和上调bax 的表达而诱导胃癌裸鼠移植瘤细胞发生凋亡，是其抗胃癌作用的机制之一。     

Survivin反义寡核苷酸抑制肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的：研究survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌耐药细胞株移植裸鼠皮下后，移植瘤生长的抑制作用。方法:将人肝癌耐药细胞系SMMC-7721/ADM裸鼠移植瘤模型，随机分为：空白对照组、单纯脂质体转染组、正义链转染组、200 μg/L ASODN组、400 μg/L ASODN组和600 μg/L ASODN组，观察裸鼠移植瘤体积，计算抑瘤率。免疫组化检测Survivin蛋白的表达。结果:A组、B组和C组移植瘤随时间增长而增大，但3组间无显著差异（P>0.05）。D组、E组和F组注射ASODN后，裸小鼠移植瘤的体积随着注射ASODN时间的延长和ASODN浓度的增加，移植瘤生长越来越小，并呈时间-剂量-效应依赖性。实险第20 d D组、E组和F组的肿瘤抑制明显大于A组、B组和C组（P<0.05）。HE染色见对照组移植瘤细胞密集成群，核大深染，而ASODN组见肿瘤细胞少，癌细胞皱缩变圆，胞核固缩深染。免疫组化见对照组肝癌细胞浆Survivin蛋白表达较强，而ASODN组Survivin蛋白表达较弱。结论:Survivin反义寡核苷酸能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。     

白细胞介素18基因转染的肺癌细胞对树突状细胞免疫特性的影响

目的：研究IL-18基因转染的肺癌细胞对树突状细胞（DC）表型和免疫活性的影响。 方法：构建含IL-12 P40信号肽序列的分泌型人IL-18表达载体并转染NCI-H460肺癌细胞。从人外周血诱导DC，分为未转染组（NT）、空载体组（PV）、基因转染组（GT）和单纯DC组（PD），用流式细胞仪分别测定未经转染肺癌细胞、空载体转染细胞及基因转染细胞刺激的DC和单纯DC表面CD54、CD80、CD83及CD86的表达。用MTT法测定上述4组DC刺激T细胞增殖的作用。用ELISA法测定上述4组DC培养上清中IL-12的表达量。 结果：分泌型IL-18表达载体酶切及测序结果与预期结果一致。IL-18转染细胞表达IL-18融合基因及18 kD蛋白。GT组DC表面分子的表达、刺激T细胞增殖的作用及IL-12分泌量均高于其余3组。 结论：IL-18基因转染的肺癌细胞可促进DC表面分子表达，增强DC免疫刺激活性及其IL-12的分泌。     

CD3AK细胞在裸鼠体内抗转移作用的研究

目的研究肿瘤引流淋巴结的淋巴细胞在体外用ＣＤ３单克隆抗体激活（ＣＤ３ＡＫ）后在体内是否仍然具有抗肿瘤作用。方法取卵巢癌病人盆腔引流淋巴结淋巴细胞,在体外用ＣＤ３单抗激活后输注载高转移人卵巢癌裸鼠体内实验性治疗。实验分４组：顺铂组,ＣＤ３ＡＫ组,联合治疗组,对照组。治疗于接种移植瘤后１０天开始,历时８０天。结果观察到ＣＤ３ＡＫ组１只裸鼠移植瘤消退,２／７只出现转移灶,与对照组８／１０只裸鼠出现转移灶比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。ＣＤ３ＡＫ组肿瘤体积（０．５７８８±０．２５４９）与对照组（１．５６８５±０．２８３０）比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。ＣＤ３ＡＫ组抑瘤率达６３．１％。ＣＤ３ＡＫ组裸鼠的血清孕酮含量（３．３８４３±０．５３１４）明显低于对照组（６．３４８０±０．７６１５）,两组比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。ＣＤ３ＡＫ组淋巴结窦性组织细胞增生（５９／６９枚）明显多于对照组（５５／９４枚）,两组比较差异有非常显著性（Ｐ＜０．０１）。结论ＣＤ３ＡＫ细胞在裸鼠体内具有抗肿瘤生长和抗转移作用,同时有提高宿主免疫功能的作用。     

树突状细胞对脐血来源细胞因子诱导杀伤、自然杀伤细胞杀伤活性及CD45RO表达的影响

目的:探索同一来源脐血树突状细胞(DCs)对细胞因子诱导杀伤(CIK)、自然杀伤(NK)细胞杀伤活性和CIK细胞上CD45RO表达的影响。方法:通过细胞因子组合诱导、扩增脐血来源的DCs、CIK和NK细胞,杀伤效应细胞分为两组:A组为接受DCs共孵育6d刺激的CIK、NK细胞,B组为未接受任何刺激的CIK、NK细胞,了解DCs对相应效靶比下CIK、NK细胞杀伤K562、HL-60细胞株细胞毒活性的影响;通过流式细胞术检测两组CIK细胞上CD45RO、CD45RA的表达率。结果:随着效靶比的升高,脐血CIK、NK细胞对肿瘤细胞株的杀伤力增加。在20∶1、10∶1效靶比下,A组CIK、NK细胞对HL-60的杀伤率分别为76.77％±5.76％、55.87％±2.09％,B组为61.14％±3.72％、49.96％±1.51％,A组对HL-60的杀伤明显高于B组;在20∶1效靶比下,A组对K562的杀伤明显高于B组;而在10∶1效靶比下两组之间的杀伤活性未见显著差异;A组CIK细胞上CD45RO表达率显著高于B组。结论:DCs与CIK、NK细胞共孵育可提高CIK、NK细胞的细胞毒活性及增加CIK细胞上CD45RO的表达。     

Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的抑制作用

目的探讨Bcl-XL反义寡核苷酸转染后,对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响。方法采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸转染、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western蛋白印迹杂交、四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)、流式细胞术及凋亡的原位末端标记(TUNEL)检测等方法观察了Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖、凋亡的影响及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响。结果MTT法检测显示,Bcl-XL反义寡核苷酸可显著抑制食管癌细胞的增殖(P<0.05);对Bcl-XLmRNA表达抑制率为57.3%,可显著下调Bcl-XL的蛋白表达;应用流式细胞术和TUNEL检测技术,反义寡核苷酸组的凋亡率分别为(31.1±5.8)%和35.0%,与相关对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。反义寡核苷酸组裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长受到显著抑制(P<0.05)。Bcl-XLmRNA及蛋白表达亦受到明显抑制,并且移植瘤组织中凋亡细胞明显增加。结论Bcl-XL反义寡核苷酸可有效抑制食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长。通过反义寡核苷酸下调Bcl-XL的表达,达到治疗食管癌的目的,为食管癌的基因治疗提供实验依据。