丙戊酸钠对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖及HPA、PCNA表达的影响

目的探讨丙戊酸钠(VPA)对体外培养的人肝癌细胞系SMMC-7721细胞增殖抑制作用及对乙酰肝素酶(HPA)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响及机制。方法肝癌细胞株SMMC-7721分对照组和实验组。对照组细胞常规培养,实验组细胞施加VPA干预,设浓度梯度和时间梯度。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性;RT-PCR半定量法测定细胞HPA及PCNA mRNA表达的变化;Western-blot法测定细胞HPA及PCNA蛋白含量。结果 VPA对SMMC-7721细胞的生长具有明显的增殖抑制作用,且表现为时间依赖性和浓度依赖性(P<0.05);当药物浓度增加至≥2.0mmol/L时,其HPA和PCNA mRNA及蛋白的表达量较对照组明显下调,且呈时间依赖性(P<0.05)。结论 VPA对肝癌SMMC-7721细胞有明显的增殖抑制作用,且能够在核酸和蛋白水平上下调HPA及PCNA的表达,从而抑制肿瘤的增殖、侵袭和转移。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸肝细胞毒性相关作用机制研究

目的研究丙戊酸肝细胞毒性相关机制。方法使用人肝癌细胞系HepG2,VPA、TSA处理,检测细胞活性、凋亡情况、线粒体膜电位、PI3K/AKT/mTOR通路活性、Bcl-2、Bax凋亡通路和自噬激活情况。结果5 mmol/L、10 mmol/L VPA处理24 h,细胞活性明显降低;5μmol/L TSA处理24 h,细胞活性明显降低。因此选用10 mmol/L VPA、5μmol/L TSA。10 mmol/L VPA处理24 h或5μmol/L TSA处理24 h,细胞凋亡率显著升高,细胞线粒体膜电位降低,细胞PI3K/AKT/mTOR通路活性降低,细胞Bcl-2活性降低,Bax活性升高,cleaved-caspase-3比例升高,细胞LC3Ⅱ表达增加,p62表达降低,VPA的作用强于TSA。结论 PI3K/Akt/mTOR通路抑制以及线粒体异常引起的凋亡在VPA相关肝毒性中发挥重要作用,而且VPA的肝毒性也与其HDAC抑制剂活性具有一定关联。     

Effect of reversing low-level histone acetylation with VPA on metastasis of hepatocellular carcinoma in vitro

目的 探讨丙戊酸钠(VPA) 逆转组蛋白低乙酰化水平对体外培养的人肝癌细胞系SMMC-7721细胞体外侵袭、转移能力的影响及其可能的作用机制.方法 流式细胞仪(FCM)分析不同浓度VPA对SMMC-7721细胞凋亡及细胞周期的影响;分别采用划痕试验,Transwell侵袭小室和细胞-基质黏附试验测定细胞体外迁移、侵袭和黏附能力;Western blot观察不同浓度VPA处理后HPA和PCNA蛋白的表达变化.结果 VPA诱导SMMC-7721细胞凋亡,阻滞细胞于G2/M期,抑制细胞增殖.VPA试验组细胞的侵袭、迁移能力以及黏附能力均显著低于对照组(P<0.05).随浓度和时间增加,VPA能明显降低HPA和PCNA蛋白表达.结论 VPA可通过逆转染色体组蛋白低乙酰化水平,显著抑制肝癌细胞增殖,降低肝癌细胞侵袭、迁移和黏附能力.下调HPA和PCNA表达可能是其发挥作用的主要机制之一.     

应用丙戊酸钠调节组蛋白乙酰化修饰抑制肝癌细胞增殖的作用及机制

目的观察应用组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸钠调节染色体组蛋白低乙酰化水平对肝癌细胞增殖的作用，并进一步检测Cyctin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21^Waf/cip1蛋白及mRNA表达变化，探讨其分子作用机制。方法应用0．75～4．0mmol／L丙戊酸钠作用于肝癌细胞系HepG2细胞后，MTT法检测细胞生长抑制、细胞克隆形成试验观察克隆形成率、碘化丙啶标记流式细胞术检测细胞周期、间接免疫荧光法分析Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21^Waf/cip1蛋白表达，RT—PCR检测分析Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21^Waf/cip1 mRNA表达。结果0．75～4．0mmol／L丙戊酸钠作用24、48、72、96h，观察组出现了时间-剂量依赖趋势的生长抑制，同时细胞克隆形成率显著降低，对照组细胞增殖周期G1、S、M期所占比例未见明显改变，而观察组则随药物浓度、作用时间的不同而出现不同程度的细胞增殖周期G1期阻滞，G1期比例由55．4％～82．8％不等，差异有统计学意义（P〈0．01）。观察组Cyclin A、Cyclin D1蛋白及mRNA表达均被明显下调而P21^Waf/cip1蛋白、mRNA表达则被明显上调，与对照组比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）；而Cyclin E蛋白和mRNA表达变化则未见明显差异（P〉0．05）。结论通过应用特异性组蛋白脱乙酰酶抑制剂调节组蛋白乙酰化修饰可明显抑制肝癌细胞生长、抑制细胞克隆形成、阻滞细胞增殖周期于G1期；丙戊酸钠作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂可明显抑制肝癌细胞增殖，其作用机制是通过上调P21^Waf/cip1 mRNA蛋白表达，下调Cyclin D1、Cyclin A mRNA蛋白表达分别和／或协同实现。     

丙戊酸钠对重度烫伤大鼠心肌保护作用及其机制研究

目的研究丙戊酸钠(抗癫痫药)对重度烫伤大鼠心肌保护作用及其机制。方法 98只♂SD大鼠,随机分为4组:①假烫组、②烫伤组、③烫伤+二甲基二乙酸(2M2P)组和④烫伤+丙戊酸钠(VPA)组,80℃水浴(假烫组37℃),造成50%总体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤。③、④组分别于烫伤后,即刻皮下注射2M2P、VPA300 mg.kg-1。分别于烫伤后2,6 h腹主动脉取血,测定磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)变化;然后处死大鼠观察心肌病理变化;检测心肌热休克蛋白(HSP70)表达。结果烫伤大鼠血浆CK-MB水平持续升高,于伤后6 h,VPA组的血浆CK-MB水平(U.L-1)显著低于烫伤组(4398.0±1273.8 vs5438.0±987.9,P<0.01)和2M2P组(4398.0±1273.8 vs 5198.0±1097.3,P<0.01),HSP70表达明显高于烫伤组和2M2P组。病理观察显示,VPA组的心肌损伤轻于烫伤组和2M2P组。结论 VPA改善烫伤休克大鼠心肌酶学指标和组织学损伤,其机制可能与其促进保护性蛋白HSP70表达增多有关。     

肝素对肝癌细胞乙酰肝素酶mRNA表达和侵袭能力的影响

目的:探寻肝素对乙酰肝素酶(heparanase,HPA)转染的肝癌细胞侵袭能力和乙酰肝素酶mR-NA表达的影响。方法:用含人全长乙酰肝素酶cD-NA的pcDNA3-HPA质粒转染人肝癌细胞株BEL-7404,加入不同剂量肝素进行细胞培养,用侵袭小室观察肝癌细胞穿膜细胞数,用RT-PCR法检测细胞乙酰肝素酶mRNA表达。结果:BEL-7404细胞组和空载体转染细胞组乙酰肝素酶mRNA表达均为阴性,pcDNA3-HPA质粒转染组乙酰肝素酶表达阳性,穿膜细胞数(27.00±4.30)显著高于另外2组(分别为11.67±2.52和9.67±2.89,P<0.01);加入肝素后BEL-7404细胞组和空载体转染细胞组穿膜能力和乙酰肝素酶表达均无显著变化;而pcDNA3-HPA质粒转染组穿膜细胞数随着肝素剂量的加大而逐渐减少,超过一定剂量后则不再显著减少,但该组乙酰肝素酶表达始终阳性。结论:在一定剂量范围内,肝素可抑制表达乙酰肝素酶之肝癌细胞的侵袭能力,而不影响乙酰肝素酶mRNA表达。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂抗血管新生机制的体内研究

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂对白血病细胞移植瘤血管新生的影响及其机制.方法 12只裸鼠均分为对照组和丙戊酸钠(VPA)用药组.建立Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤模型,应用HDAC抑制剂VPA体内用药.RT-PCR和免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR) mRNA或蛋白的表达;染色质免疫共沉淀法检测VEGF基因启动子区域染色质内组蛋白H3乙酰化程度的变化.结果 与对照组比较,VPA用药组VEGF及VEGFR2 mRNA和蛋白表达水平明显减少,启动子区域染色质内组蛋白H3的乙酰化程度明显升高.结论 VPA作为HDAC抑制剂,通过提高组蛋白的乙酰化程度,进而抑制血管新生相关因子及受体的表达,阻碍白血病的血管新生.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成及其体外抗肿瘤研究

目的设计并合成组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi),并对其组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制活性和体外抗肿瘤活性进行研究。方法以N-Boc-对苯二胺和辛二酸酐为起始原料,反应制得7-(N-Boc-氨基)苯胺甲酰基庚酸,再通过胺醛缩合反应合成HDACi;并采用HDACs试剂盒和CCK-8试剂盒测试所合成目标化合物抑制HDACs的活性和抗肿瘤活性。结果合成了26个新化合物,其结构均经过核磁共振氢谱和质谱进行了确证。初步的生物活性测试结果表明,所合成的目标化合物对HDACs的抑制活性均强于阳性药物伏立诺他,并对MCF-7、PC-3、HepG2、MGC-803和KB 5种肿瘤细胞有不同程度的抑制活性,其中希夫碱含有吸电子基的化合物对HDACs的抑制活性以及抗肿瘤活性强于其他衍生物。尤其是4-氰基化合物11c对HDACs展现出了最强的抑制活性,是阳性药伏立诺他的58倍;同时,化合物11c对肿瘤细胞MCF-7、PC3、MGC-803和HepG2展现出了最强的抗肿瘤活性,其抗胃癌MGC-803甚至是阳性药物伏立诺他的7.2倍。结论希夫碱是一类重要的抗肿瘤药效团,能够提高HDACi的抗肿瘤活性,为今后发展新型、高效的HDACi提供了新的思路。     

血浆中丙戊酸钠浓度的体外稳定性实验

目的观察血浆中丙戊酸钠浓度的体外稳定性变化。方法取口服丙戊酸钠的癫痫患者的静脉血,采用荧光偏振免疫仪(TDXFLX)测定其血浆中丙戊酸钠的浓度。然后将血浆置于冰箱冷藏(2～8℃)放置,每周测定1次血浆中丙戊酸钠浓度,共4周。结果放置1周时,血浆中丙戊酸钠浓度变化无统计学差异;放置2,3和4周时,血浆中丙戊酸钠浓度变化有统计学差异。结论放置1周,血浆丙戊酸钠浓度稳定性良好;放置2,3和4周时,丙戊酸钠浓度的稳定性较差。     

雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠的保护作用

目的:探讨雷帕霉素(RAPA)对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及可能机制。方法:将36只大鼠随机分为对照组、糖尿病组和糖尿病雷帕霉素治疗组,每组12只。链脲佐菌素腹腔注射制作糖尿病大鼠模型。检测大鼠血糖(Glu)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿蛋白(UPro)等生化指标改变;组织学检查观察肾组织病理改变;用Westernblotting方法检测肾组织中细胞增殖核抗原(PCNA)和Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)蛋白的水平。结果:与对照组相比,糖尿病组大鼠Glu、Cr、BUN、UPro均显著上升,大鼠肾脏明显肥大,肾小球肥大,毛细血管基底膜厚度显著增加,肾皮质PCNA及COL-Ⅳ的蛋白表达显著上调。雷帕霉素治疗后,上述指标除Glu外均得到改善。结论:雷帕霉素能够减轻糖尿病大鼠肾脏的肥大,抑制系膜外基质聚集,下调PCNA及COL-Ⅳ的表达,延缓糖尿病肾病的进展。     

人肾透明细胞癌组织中增殖细胞核抗原表达与肾癌的关系

目的 通过检测人肾透明细胞癌组织中增殖细胞核抗原（PCNA）表达的变化,研究其表达与肾癌的关系.方法 标本离体后分成肾透明细胞癌组、癌旁组织组、正常肾组织组,均用10%的甲醛固定48 h,常规石蜡包埋、切片5 μm,同时应用免疫组织化学方法进行观察研究.结果 PCNA免疫组化染色：正常肾组织内的细胞核有弱阳性表达,癌旁阳性表达增加,高于正常肾组织,肾癌组织阳性表达明显增强, 明显高于癌旁组织,两两比较差异均有统计学意义（P＜0.01）.肾癌4个期之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 PCNA在正常组、癌旁组、癌组织组的表达呈明显加强趋势,癌组织细胞增殖旺盛,是肿瘤形成的重要机制.     

人肾腺癌PCNA、Bcl-2的表达及意义

目的 :探讨人肾癌表达 Bcl- 2、PCNA的意义及肾癌发生的机制。方法 :采用免疫组化的方法对 45例人肾腺癌石蜡切片和 10例正常肾组织切片的 Bcl- 2、PCNA蛋白的表达情况进行检测。结果 :在肾癌中 PCNA、Bcl- 2的表达明显高于正常肾组织 (P<0 .0 5 )。相关性分析表明 :PCNA与 Bcl- 2在正常肾组织与肾癌中无显著相关性。结论 :肾癌的发生可能与 Bcl- 2、PCNA的高表达相关 ,且二者可作为良恶性肾组织鉴别诊断的辅助指标 ;肾癌对放疗、化疗不敏感可能与其 Bc1- 2高表达有关     

缬沙坦及红花对单侧输尿管结扎大鼠肾脏细胞增殖的影响

目的观察肾间质纤维化实验大鼠肾脏细胞增殖的特点及缬沙坦、红花对其的抑制作用。方法结扎大鼠单侧输尿管(UUO)复制肾间质纤维化实验动物模型,分别给以缬沙坦10mg·kg-1·d-1、红花4.0g·kg-1·d-1经口灌服,14d后摘取肾脏,采用免疫组化、RT-PCR检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、流式细胞学检测细胞增殖/凋亡及细胞周期。结果免疫组化结果显示UUO大鼠肾脏PCNA阳性细胞表达明显增多,RT-PCR显示其基因表达增强,流式细胞学显示UUO大鼠肾脏细胞增殖/凋亡比例下降,S期细胞比例增多;缬沙坦及红花治疗组均可在蛋白及基因水平下调其表达。结论单侧输尿管结扎可诱导肾脏细胞增殖,血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦及中药红花可下调其表达。     

食管鳞癌PCNA和c-erbB-2表达与预后的关系

目的 探讨PCNA和c-erbB-2在食管鳞癌组织中表达的意义及其与预后的关系。方法 应用免疫组化SP法对10例正常食管粘膜组织,15例重度不典型增生的食管粘膜组织和87例食管癌组织中PCNA和c-erbB-2的表达进行检测。结果PCNA和c-erbB-2在食管癌组织中均呈异常高表达,与肿瘤病理分级、分期及预后密切相关,而且两者之间存在着协同表达。结论 PCNA增殖指数高与c-erbB-2异常高表达在食管鳞癌的发生和发展过程中起重要作用。提示PCNA和c-erbB-2可作为判断食管癌预后的标记物。     

靶向沉默SSBP1基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响

目的 观察靶向沉默线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响.方法 设计并构建靶向SSBP1 基因的特异性siRNA,采用脂质体介导瞬时转染肝癌HepG2细胞,细胞分3组:对照组、空白转染组、转染组.Real time-PCR和Western-blot检测靶向干扰后SSBP1 mRNA和蛋白表达变化.CCK-8法检测细胞增殖.流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率及线粒体膜电位.划痕实验及Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭转移能力.Western-blot检测增殖、侵袭转移相关基因蛋白表达状况.结果 SSBP1 siRNA能够显著抑制SSBP1 mRNA和蛋白表达.与对照组和空白转染组比较,转染SSBP1 siRNA后HepG2细胞增殖能力、G2期和S期细胞比例、线粒体膜电位明显降低,G1期细胞比例、细胞凋亡率明显升高(P<0.05);同时细胞增殖相关基因PCNA、凋亡抑制基因Bcl-2、转移相关基因MMP-9蛋白表达显著下调,凋亡诱导基因Bax蛋白表达显著上调(P<0.05).结论 靶向沉默SSBP1基因能够通过线粒体途径抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移,并诱导其凋亡.