质粒介导16S rRNA甲基化酶在奇异变形杆菌临床分离株的流行情况研究

到目前为止,在革兰阴性杆菌中已发现AnnA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD和NpmA 6种16S rRNA甲基化酶,且编码这些酶的基因通常和超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因共处一个质粒上,通过质粒在不同的菌株之间播散[1-]4.RmtC型16S rRNA甲基化酶首次在奇异变形杆菌中被发现[4],但16S rRNA甲基化酶在奇异变形杆菌中的流行情况还不清楚.本研究的目的是对从我院2004年5月至2007年9月临床标本中分离的198株奇异变形杆菌进行16SrRNA甲基化酶筛查,并对其转移机制进行研究,现将结果报道如下.     

产ESBL肺炎克雷伯菌中16S rRNA甲基化酶的分布与相关耐药性的研究

目的 调查我院产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株16S rRNA甲基化酶基因的分布以及与耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用.方法 收集我院临床2010年3月至9月分离出69株非重复产ESBL肺炎克雷伯菌,采用PCR法检测16S rRNA 甲基化酶基因,并对阳性菌株进行ESBL基因及整合子基因分析,通过DNA直接测序确定.质粒接合试验和质粒消除试验确定16S rRNA甲基化酶基因的传播途径,利用ERIC-PCR技术进行基因分型.结果 69株产ESBL肺炎克雷伯菌中有rmtB阳性菌株20株(28.9％),其中2株同时携带有rmtB和armA.在20株产16SrRNA甲基化酶菌株中,均携带有CTX-M基因,测序显示14株CTX-M-14基因,6株CTX-M-15基因;14株携带有TEM-1基因;8株携带有SHV基因,测序显示5株SHV-12基因,3株SHV-11基因;3株携带有OXA-10基因;3株携带有VBE-1基因.另有12株携带有int1阳性,含有5种不同的耐药基因盒,分别携带drfA25、drfA1、drfA12、aadA1、aadA2、sat和blaVEB-1基因.ERIC-PCR法显示20株16SrRNA甲基化酶基因阳性的肺炎克雷伯菌主要分为5型,A型为优势流行克隆株.质粒接合和消除试验发现A型克隆株KP5和KP16 rmtB均位于一质粒上并通过接合传播.结论 本院产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株中存在16S rRNA甲基化酶基因rmtB的普遍流行,导致对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药.rmtB可通过水平基因传播和克隆传播的两种方式进行播散,并且存在同时产ESBLs、16S rRNA甲基化酶和Ⅰ类整合子的肺炎克雷伯菌的传播.     

同时产ArmA型16S rRNA甲基化酶及KPC-2型β-内酰胺酶泛耐药阴沟肠杆菌的研究

目的 探讨上海交通大学医学院附属瑞金医院分离的5株泛耐药阴沟肠杆菌产碳青霉烯酶及16S rRNA甲基化酶的情况及两者之间的相关性.方法 用E test法检测5株泛耐药阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值.PCR扩增16S rRNA甲基化酶基因armA、mtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA,β-内酰胺酶基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、PER-1、VEB-1.鸟枪克隆法克隆碳青霉烯酶基因,并对克隆片段进行测序.质粒接合试验验证碳青霉烯酶基因及16S rRNA甲基化酶基因是否具有转移性.脉冲场凝胶电泳(PFGE)法对5株菌进行分子分型.等电聚焦电泳法检测β-内酰胺酶等电点.Southern杂交法对耐药决定因子进行定位.结果 5株阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值均＞32 mg/L.克隆的碳青霉稀酶基因为blaKPC-2,酶编码基因上游为一转座酶基因,两侧为复制靶位,下游为ISKpn6的插入序列,该序列包括一个重复序列和tnpA转座子,酶编码基因位于54.2 kb的一个非接合性大质粒上.等电聚焦电泳显示5株菌均产4种β-内酰胺酶(TEM-1,pI5.4;KPC-2,pI6.7;SHV-12,pI8.2;CTX-M-14,pI8.4).16S rRNA甲基化酶基因位于接合性质粒上,而blaKPC-2基因则位于非接合性质粒上,5株菌PFGE型别一致.结论 5株泛耐药阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药由产碳青霉烯酶KPC-2所介导.blaKPC-2与armA型16S rRNA甲基化酶基因由两条不同的质粒编码,不存在相关性.临床医院应加强监控,以防止交叉感染.     

土生克雷伯菌中发现16S rRNA甲基化酶基因rmtB

近年来,有关临床分离的革兰阴性杆菌产生16S rRNA甲基化酶导致对临床上常用的几乎所有氨基糖苷类抗生素耐药情况备受国内外学者关注[1-3]引.我们曾先后报道了临床分离的阴沟肠杆菌[1]、鲍曼不动杆菌[4]、肺炎克雷伯菌[5]中16SrRNA甲基化酶基因存在与分布状况.     

亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌16S rRNA甲基化酶基因检测及流行菌株分析

目的 研究我国多中心亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌的耐药性、16S rRNA甲基化酶的阳性率及分子流行病学特征.方法 收集2004年11月-2005年11月国内6省市19家医院临床分离的342株亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌.采用琼脂稀释法和E test法对18种抗菌药物测定分离株的最低抑菌浓度(MIC)值;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株的同源性;PCR法筛选4种16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC,克隆测序明确基因型;接合试验、质粒抽提、电转化以及Southern blot确定甲基化酶耐药基因定位.结果 所有菌株均为多重耐药株,其中对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、异帕米星、奈替米星耐药率分别为92.6%、98.6%、87.4%、90.9%和92.4%.PCR扩增、测序证实221株鲍曼不动杆菌检出甲基化酶armA基因;另3种甲基化酶基因rmtA、rmtB、rmtC均阴性.在上述342株鲍曼不动杆菌临床分离株中,298株可归类为6个流行克隆,44株为散发株.3个主要克隆(A、B、C)在全国广泛播散,分别在国内6家、3家、11家医院内流行.接合试验、质粒抽提、电转化及Southern blot表明armA编码基因存在于染色体上.结论 亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌的表型均为多重耐药.介导氨基糖苷类抗生素高度耐药的16S rRNA甲基化酶基因armA在鲍曼不动杆菌中广泛存在,其主要传播方式为克隆播散,这必将引起临床的高度关注.     

应用激光捕获显微切割技术分离肝癌石蜡组织标本中细菌及螺杆菌基因的检测

目的　对肝癌石蜡组织标本病理切片中发现的细菌进行分离鉴定。方法　38例肝癌石蜡组织标本经聚合酶链反应(PCR)扩增螺杆菌16S rRNA,阳性标本病理切片后行石炭酸碱性品红染色观察幽门螺杆菌(H.pylori),应用激光捕获显微切割技术(LCM)分离光镜下观察到的细菌,分离的细菌经PCR扩增螺杆菌16S rRNA,PCR产物进行测序及同源比较,阳性者再扩增H.pylori的特异基因[相对分子质量(Mr)为26×103 蛋白,H.pylori种特异抗原]和相关功能基因(cagA,vacA)。结果15例肝癌石蜡组织标本中检测到螺杆菌16S rRNA,选取观察到细菌数量较多的6例用于LCM分离。分离的6例细菌样本均扩增出螺杆菌16S rRNA,经测序与H.pylori有99%~100%的同源性。4例Mr为26×103 蛋白基因阳性,1例扩增出cagA基因,未扩增出vacA基因。结论　肝癌石蜡组织中经PCR检测到的H.pylori就是病理观察到的细菌。     

螺杆菌感染与NF-κB p65蛋白表达相关性在人食管癌发生中的意义

目的研究人食管癌是否存在螺杆菌感染及其与NF-κB p65蛋白的关系,从而探讨在人食管癌发生中的意义。方法随机收集食管癌标本40例和正常食管标本10例,采用聚合酶链反应(PCR)扩增螺杆菌16S rRNA,随机选4例测序及同源比较。阳性者再扩增幽门螺杆菌(H.pylori, Hp)的特异基因相对分子质量(M_r)26×10~3的种特异性抗原和相关功能基因(CagA,VacA)。并采用免疫组化法检测食管癌组织中NF-κB p65蛋白的表达情况。结果32.5%(13/40)的食管癌组织中发现有螺杆菌16S rRNA基因存在,正常人食管组织无一例阳性。4例测序及同源比较,食管癌组织中螺杆菌序列与H.pylori的16S rRNA序列有99%～100%同源性。阳性标本均扩增出Hp特异基因M_r 26×10~3种特异性抗原,但仅2例扩增出CagA基因,3例扩增出VacA基因。免疫组化法染色显示,16S rRNA阳性的食管癌组织中NF-κB p65蛋白表达率为100%(13/13),而16S rRNA阴性食管癌组织表达率仅占18.5%(5/27),二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论食管癌患者食管组织存在螺杆菌感染,该螺杆菌可能为Hp。螺杆菌感染导致食管黏膜NF-κB p65蛋白表达的增加,可能在食管癌生成中作为信号传导机制之一。     

从耐药肺炎克雷伯菌中检出aac(6′)-Ib基因新亚型

为深入了解一组分离自浙江省杭州地区和湖州地区耐药肺炎克雷伯菌之氨基糖苷类药物耐药的遗传学背景,我们同时检测了47株耐药肺炎克雷伯菌的15种氨基糖苷类修饰酶和6种16S rRNA甲基化酶基因.现报道如下.     

gyrB基因和16S rRNA基因序列分析在沙门菌属细菌鉴别中的临床应用评价

最近研究发现，gyrB基因是16S rRNA基因以外适合细菌鉴别的又一理想靶基因。gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚单位的基因，其显著优点是基因进化率较快，碱基替换频率较高，在相似细菌的检测和鉴别方面比16S rRNA基因更具优越性。本实验以10株沙门菌为受试对象，     

23S rRNA基因序列分析及其在细菌鉴别诊断中的应用

目的研究细菌23S rRNA基因序列的差异，为细菌鉴别诊断和相关研究提供科学依据。方法设计合适的通用引物、寻找恰当的扩增条件扩增常见细菌的23S rRNA基因片段。通过序列测定和运用生物信息学分析不同种属细菌23S rRNA基因的保守序列、变异规律及菌株间种系进化关系。结果扩增出常见引起食源性感染的16属(种)细菌23S rRNA基因片段。部分扩增产物进行了限制性酶切鉴定和序列测定。序列比较研究获得21个23S rRNA的通用保守序列，23S rRNA基因保守序列与变异区在种系间呈间隔分布，大量变异区呈“马赛克”式分布。种系间进化关系与16S rRNA分析结果一致。结论23S rRNA基因序列的分布规律为进行细菌的鉴别诊断及基因芯片的研制提供了重要的理论和实验基础。     

用16S rRNA基因序列分析从西藏的微小牛蜱中检出的埃立克体

用埃立克体属特异性套式PCR和DNA序列测定从西藏微小牛蜱检出边缘无形体和埃立克体;用半套式PCR扩得该埃立克体的16S rRNA基因,并测定了它的序列;将该埃立克体的16S rRNA基因序列与其它埃立克体的16S rRNA基因序列进行对比分析,结果证明它的16S rRNA基因与埃立克体属的犬埃立克体群16S rRNA基因相似水平最高(97%～98%);用16S rRNA基因序列做系统发育分析,结果显示该采自西藏的微小牛蜱的埃立克体可能是与查菲埃立克体密切相关的一种新埃立克体.     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

16种常见凝固酶阴性葡萄球菌的快速分子鉴定

目的 建立对16种常见凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的快速分子鉴定.方法 用gap基因对16种常见CNS进行扩增和测序,获得序列在GenBank进行比对,构建进化树进行同源分析,同时与16S rRNA基因比较.结果 16种常见CNS中,gap基因相似率介于39% ～ 98%,人葡萄球菌和与人葡萄球菌亚种相似率最高(98%),腐生葡萄球菌与木糖葡萄球菌相似率最低(39％),16SrRNA基因相似率介于96% ～ 99%,至少2种细菌99%以上相似率,最多4种葡萄球菌99%以上相似率；进化树同源分析显示,两种方法在检测缓慢葡萄球菌与松鼠葡萄球菌、产色葡萄球菌与中间葡萄球菌和人葡萄球菌与人葡萄球菌亚种时,都有很高的可信度(99%以上),而对于其他10种细菌,gap基因同源分析有较少的不可靠信度(49%,56%),16S rRNA基因同源分析有较多不可靠信度(43%、43%、50%、56%、63%、65%、76%).结论 gap基因序列分析能够对16种常见CNS进行准确鉴定,同源分析可信度要明显优于16S rRNA基因.     

抗生素治疗时限对化脓性脑膜患儿脑脊液细菌16s rRNA基因检测的影响

目的：研究抗生素治疗时限对化脓性脑膜患儿脑脊液细菌16s rRNA基因检测的影响。方法：选取2014年2月至2016年3月在我院收治的化脓性脑膜炎患儿60例。对所有患儿予以16s rRNA基因检测和脑脊液细菌培养检测，比较两种方法检测结果，观察抗生素使用对两种检测方法的影响。结果：脑脊液细菌培养阳性率显著低于16s rRNA基因芯片检测阳性率[15%(9/60) vs.35%(21/60)](P<0.05)。抗生素应用早期的16s rRNA基因检测阳性率和抗生素使用后期的阳性率比较差异不显著[36.67%(11/30) vs.33.33%(10/30)](P>0.05)；抗生素使用早期的脑脊液细菌培养阳性率显著高于抗生素应用后期的阳性率[13.33%(4/30) vs.0.00%(0/30)](P<0.05)。结论：和脑脊液培养相比，16s rRNA基因芯片法检测化脓性脑膜患儿脑脊液细菌受抗生素治疗时限的影响更小。     

中国莱姆病螺旋体的核糖体基因分型研究

目的 莱姆病螺旋体的基因型和临床表现、疫苗菌株和抗原菌株的选择存在密切的关系，所以对中国菌株进行分子流行病学研究，可为莱姆病的防治提供科学依据。方法 5S－23S rRNA基因间隔区RFLP分析和16＋23S rRNA基因RFLP分析。结果 中国菌株至少被分为3个基因型（B.burgdorferi sensu stricto、B.garinii和B.afzelii),B.garinii和B.afzelii占优势，B.burgdorferi sensu stricto少见。少数菌株用上述方法尚不能明确其分类地位，需进一步研究，中国很可4能存在世界上独特的新基因型。结论 中国菌株的基因型明显不同于北美菌株，而同欧洲菌株比较接近，5S－23S rRNA基因间隔区RFLP分析方法简便、快速、准确，是理想的基因型分类方法，可作为国内菌株基因型鉴定的常规方法。     

耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺的耐药机制及分子流行病学研究

目的 研究耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCoNS)临床分离株对利奈唑胺的耐药机制及分子流行病学.方法 2011年3-8月我院分离到17株对利奈唑胺耐药的MRCoNS,包括10株头状葡萄球菌、4株科氏葡萄球菌、2株溶血葡萄球菌和1株松鼠葡萄球菌.用E-test法测定抗生素对细菌的最低抑菌浓度(MIC);脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株之间的同源性;PCR扩增和序列分析研究细菌对利奈唑胺耐药的分子机制.结果 9株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的头状葡萄球菌为同一克隆株,MIC值为4μg/ml的另1株头状葡萄球菌为密切相关菌株.4株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的科氏葡萄球菌为同一克隆株.松鼠葡萄球菌利奈唑胺MIC值为64 μg/ml,2株溶血葡萄球菌分别为4 μg/ml和6μ/ml.对23S rRNA基因第5功能区和cfr基因进行PCR扩增和测序发现,9株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的头状葡萄球菌的23S rRNA基因第5功能区存在常见G2576T突变和一个未报道过的C2104T突变;松鼠葡萄球菌存在G2576T突变;除松鼠葡萄球菌外,其余16株菌株均携带cfr基因.结论 首次报道在国内分离到利奈唑胺耐药的葡萄球菌临床菌株.MRCoNS对利奈唑胺耐药与23S rRNA基因第5功能区碱基突变和携带cfr基因相关.利奈唑胺耐药MRCoNS在我院有克隆传播现象.     

4023例新生儿耳聋基因线粒体12S rRNA突变的研究

目的本研究通过对新生儿耳聋基因线粒体12S rRNA突变的检测,为预防药物性耳聋的可行性提供支持。方法对4023例新生儿采用飞行时间质谱检测技术进行耳聋基因线粒体12S rRNA的检测,检测位点包括A1555G和C1494T。结果4023例新生儿耳聋基因检测结果中共发现5例12S rRNA A1555G纯合突变,突变比例为0．12％。结论耳聋基因线粒体12SrRNA的检测对预防药物性耳聋具有重大意义,倡导对新生儿进行耳聋基因线粒体12S rRNA筛查的理念。     

鲍曼不动杆菌armA基因的分布与耐药性的研究

目的 调查我院鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化基因armA的分布以及与鲍曼不动杆菌耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用.方法 收集72株鲍曼不动杆菌,采用K-B法对鲍曼不动杆菌进行药物敏感试验,后采用PCR筛选鲍曼不动杆菌的16S rRNA甲基化基因armA,并利用随机扩增多态性DNA法(RAPD)技术进行基因分型.统计各鲍曼不动杆菌菌株对多种氨基糖苷类药物的药敏结果,并分析基因型与耐药性的关系.结果 根据PCR产物片段大小,72株鲍曼不动杆菌共有armA基因阳性菌株20株(27.8%).含有armA基因型鲍曼不动杆菌菌株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率均为90%;随机扩增多态性DNA法显示20株armA基因阳性的鲍曼不动杆菌主要分为7型,A型为优势克隆株.结论 产16S rRNA甲基化基因armA的鲍曼不动杆菌菌株可对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药.同一克隆菌株在病房内和病房间的传播为我院armA基因传播的主要方式.     

一株副猪链球菌的鉴定及生物学特征分析

目的对从一患者脑脊液中分离的副猪链球菌菌株进行病原学鉴定, 并了解其生物学特征。方法对该菌株使用分离培养、生化鉴定、16S rRNA和管家基因recN基因分析、平均核苷酸一致性分析(ANI)、药敏实验、耐药基因、毒力基因分析等方法进行分析。结果该菌为革兰阳性球菌、在血平板上草绿色溶血, 经16S rRNA、recN基因及全基因组序列分析为副猪链球菌, 对多种抗生素敏感, 并携带有黏附类等多种毒力基因。结论副猪链球菌可导致人类感染, 可通过基因测序方法进行诊断。     

应用单一和双重荧光定量PCR法快速检测军团菌

目的 建立单一和双重荧光定量PCR方法分别和同时进行军团菌属及嗜肺军团菌的检测.方法 利用军团菌属16 S rRNA基因和嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,两条基因探针分别标记FAM和HEX,并将相关反应体系和条件进行优化.分别应用单一基因探针(单一荧光定量PCR)和双重基因探针(双重荧光定量PCR)对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异度、敏感度.应用双重荧光定量PCR检测空调水样滤膜样品和DNA提取样品,比较两者结果的一致性.结果 针对军团菌属及嗜肺军团菌,应用荧光定量PCR,16 S rRNA基因和mip基因均能较好的检出,16S rRNA和mip的最低检出限分别为8和10个拷贝.经优化得到了最佳反应体系.单一荧光定量PCR方法所检的8株嗜肺军用菌及4株非嗜肺军团菌16 S rRNA基因均为阳性,嗜肺军团菌mip基因阳性,非嗜肺军团菌mip基因阴性.双重荧光定量PCR方法所检的23株嗜肺军团菌中有2株为假阴性,9株非嗜肺军团菌和非军团菌属中有1株为假阳性.49份空调水样滤膜直接检测和提取DNA后检测的结果一致,其中26份水样军团菌阳性,20份为嗜肺军团菌,6份为非嗜肺军团菌;1份弗朗西斯菌检测HEX阳性(假阳性),占实际培养分离的1/26.结论 单一及双重荧光定量PCR法特异、快速、敏感,一次同时检测嗜肺与非嗜肺军团菌,满足对空调和环境水样军团菌监测的要求.