微量酶联夹心杂交法定量检测hIL-8 mRNA PCR扩增产物

目的:建立一种灵敏度高、特异性强、定量、精确、操作简便的微孔板酶联夹心杂交技术,定量检测人IL-8 mR-NA。方法:针对人IL-8 mRNA逆转录聚合酶链反应产物一条链的不同区域序列设计一对特异探针,其中一条为捕获探针,5′端用活性氨基修饰,与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合,“竖直”地包被在微孔板内;另一条检测探针的3′端标记生物素,和辣根过氧化物酶结合。提取人外周血单个核细胞总RNA,进行RT-PCR扩增IL-8 mRNA,双链DNA产物经热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交,加入检测探针与已杂交的产物结合,经亲和素-辣根过氧化物酶系统检测杂交信号。结果:该法灵敏度为检出16个循环的PCR产物、5×103个PBMCs中的IL-8 mRNA、检测PCR终产物的最高稀释倍数为1∶256阳性;特异性试验非目的扩增片段酶联杂交检测未检出阳性杂交信号;精密度试验CV为5.2%。结论:该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点,适合IL-8 mRNA PCR扩增产物的定量检测。     

微量酶联夹心杂交法定量检测TNF-α mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微板酶联夹心杂交技术, 对人单核细胞分泌的TNF-α mRNA进行定量检测。方法:设计两条特异探针, 其中一条为捕获探针, 5'端带有氨基修饰, 可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合, 而且是"竖直"地包被在微孔内, 另一个为检测探针, 3'端带有生物素标记。提取人单个核细胞总RNA, RT-PCR后的扩增产物经变性后加入已包被好捕获探针的微孔板中, 加入检测探针与已杂交的产物结合, 最后加入亲和素-辣根过氧化物酶(avidin－HRP)显色系统催化底物显色, 450 nm波长下检测吸光度进行定量。结果:该方法检测TNF-αmRNA的灵敏度, 明显高于琼脂糖凝胶电泳, 而且具有良好的重复性, 等量PCR产物作10个复孔, 吸光度的CV值为7.2%, 批间的CV值为9.1%。在本实验中, 我们首次尝试着用客观的数据来表示正常人中1×10⁶个PBMCs中TNF－αmRNA的平均表达量, 发现该表示方法直观明了, 结果稳定, 而且简便可行, 不需要特殊的仪器及昂贵的试剂。结论:本方法具有高灵敏度、高特异性、精确、简单易操作, 结果数据化等优点, 适合于微量细胞因子mRNA的定量检测。     

微量酶标夹心杂交法定量检测人iNOS-mRNA

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术，对人iNOS-mRNA进行定量检测。方法：设计两条特异探针，其中一条为捕获探针，5'端连接氨基，能与微孔板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被在微孔中，另一个为检测探针，3'端带有生物素标记。用脂多糖（LPS）刺激人外周血单个核细胞24 h后，提取巨噬细胞总RNA，进行RT-PCR扩增，PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内，并加入检测探针进行夹心杂交，最后加入亲和素-辣根过氧化物酶（AV-HRP）及底物，在450 nm波长检测杂交信号。结果：该方法检测iNOS-mRNA的灵敏度明显高于RT-PCR-琼脂糖凝胶电泳；特异性高，RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现；精密度良好。结论：本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化，适合于iNOS-mRNA的定量检测。     

微量酶联杂交法定量检测HBV基因 竞争PCR扩增产物

目的 建立一种简便、敏感、精确的微反应板酶联杂交技术,以鉴定HBV基因的竞争PCR扩增产物。方法 设计了两种捕获探针,能分别与竞争PCR扩增产物中的野生片段和突变片段杂交。捕获探针通过3′－端修饰的氨基与微量DNA结合板孔表面的NOS基团化学结合而被“竖直”地包被在反应板上;将热变性后的产物加入两种捕获探针反应孔内,产物中带有生物素的野生或突变片段的一条单链与相应的捕获探针杂交;最后用链亲和素－碱性磷酸酶及底物检测杂交信号。结果 该方法检测PCR产物DNA的灵敏度为80ng/ml,大于琼脂糖凝胶电泳染色鉴定法。获得野生片段和突变片段杂交信号值后,可根据公式计算扩增前野生模板的初始量。结论 本方法操作简单、灵敏度高、结果数据化、特异性强,适用于竞争PCR产物分析。     

RT-PCR酶联杂交法定量测定人PBMC中的IL-1βmRNA

IL 1β是由淋巴细胞和非淋巴细胞分泌的一种细胞因子 ,除参与免疫调控、神经内分泌及抗肿瘤等多种生理过程外 ,并与发热、炎症以及某些疾病的病理变化有关 ,因而在临床及科研中 ,很多情况下需要了解IL 1βmRNA的表达水平〔1〕。目前 ,主要采用点杂交、RT PCR标准曲线法及实时荧光PCR等对IL 1βmRNA进行定量。这些方法 ,仍存在着某些不足 ,本研究利用特制的DNA结合板 ,设计了一种酶联夹心杂交方法 ,能简便、准确地对RT PCR扩增后的人外周血单个核细胞 (PBMC)中的IL 1βmRNA进行定量。材料和方法材料 :正常体检者的抗凝外周血…     

RT-PCR法检测软组织肿瘤石蜡包埋组织中小片段mRNA

有研究报道ＲＴ ＰＣＲ方法可以在石蜡包埋组织中检测融合基因表达 ,并可用于诊断和鉴别诊断中〔1〕。我们采用ＲＴ ＰＣＲ方法 ,检测了一组软组织肿瘤石蜡包埋组织中看家基因卟吩胆色素原脱氨酶 (ｐｈｏｓｐｈｏｂｉｎｉｇｅｎｄｅａｍｉｎａｓｅ ,ＰＢＧＤ)小片段ｍＲＮＡ表达情况 ,探讨软组织肿瘤石蜡组织中小片段ｍＲＮＡ保存情况及ＲＴ ＰＣＲ的可行性。1　材料与方法1 1　材料　收集复旦大学肿瘤医院和华山医院病理科1981～ 2 0 0 0年间软组织肿瘤 78例 ,均为 10 %福尔马林液固定、石蜡包埋组织。包括滑膜肉瘤 37例、恶性周围神经鞘膜…     

重组抗原Em18双抗原夹心酶联免疫吸附试验法检测泡球蚴抗体的建立及初步评价

目的 建立双抗原夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测泡状棘球蚴抗体的方法.方法 重组抗原Em18(rEm18)作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记rEm18抗原为检测抗原,建立检测人血清中泡状棘球蚴抗体的双抗原夹心ELISA方法;应用方阵滴定法对包被抗原、酶标抗原等条件进行优化,并对该系统的灵敏性、特异性、重复性进行初步分析评价.结果 rEm18最佳包被浓度为2.5μg/mL,HRP标rEm18稀释度为1∶800.灵敏度为92％(46/50),特异性为94％(47/50),假阴性率为8％ (4/50),假阳性率为6％ (3/50),批内变异≤9.55％,批间变异≤14.79％,与Em2-ELISA试剂盒检测结果有良好的一致性.结论 本研究成功建立了快速检测泡球蚴特异性抗体的ELISA法,其可以用于人泡球蚴病的早期诊断.     

双抗体夹心ELISA定量检测重组人干扰素α1b方法的建立与评价

目的 建立双抗体夹心ELISA法定量检测重组人干扰素α1b的方法.方法 筛选具有不同抗原结合位点的抗重组人干扰素α1b单克隆抗体,分别作为包被抗体和辣根过氧化酶标记抗体,建立双抗体夹心ELISA法定量检测不同批次重组人干扰素α1b含量,评价该法的检出限、精确度、重复性、特异性.结果 所建立的ELISA最低检出限为10 ng/ml,检测线性范围10～100 ng/ml,R2 =0.992,测定值与实际值偏差＞5％,板间变异系数均小于10％.结论 该方法灵敏度高,特异性强,准确性和重复性好,可用于重组人干扰素α1b成品的定量检测.     

狼疮肾炎外周血单个核细胞IL-16活化的初步观察

目的:目的:观察狼疮肾炎(LN)外周血单个核细胞(PBMCs)白细胞介素16(IL-16)的分泌及IL-16mRNA的表达。方法:采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测PBMCs IL-16分泌的水平;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测PBMCs IL-16mRNA的表达。结果:①LN患者PBMCs自发分泌IL-16,活动组较静止组、正常对照组增高,存在显著性差异(265.6±102.2vs.120.5±84.1;265.6±102.0 vs.50.9±32.4,P<0.05);②LN活动组与静止组PBMCs IL-16mRNA表达增强,较正常对照组存在显著性差异(5.090±1.815 vs.1.030 ±0.426;3.910±1.430 vs.1.030±0.426,P<0.05),但LN活动组与静止组之间IL-16-mRNA的表达差异没有显著性(5.090 ±1.815 vs.3.910±1.430)。结论:LN患者PBMCs存在IL-16mRNA的高表达和自发的IL-16过度分泌。IL-16可能参与介导LN的发病机制。     

自制双腔生物反应器构建组织工程骨软骨复合体的体外性能

背景：关节软骨损伤往往并发软骨下骨损伤形成骨软骨复合缺损,其治疗仍为骨科急待解决的问题,利用组织工程学构建骨软骨复合体为治疗该类疾患提供了新思路。 目的：探讨利用自行设计制造的双腔搅拌式生物反应器构建一体化组织工程骨软骨复合体的可行性。 方法：在双腔搅拌式生物反应器内对复合于β-磷酸三钙支架材料的羊骨髓间充质干细胞同时进行成骨和成软骨诱导,并根据施加剪切应力分为动态培养组和静态培养组。利用MTT试验、RT-PCR和扫描电镜检测骨髓间充质干细胞体外增殖和诱导分化情况。 结果与结论：MTT试验和扫描电镜结果显示,骨髓间充质干细胞增殖良好。成骨和成软骨相关基因RT-PCR检测结果表明,骨髓间充质干细胞诱导分化良好,动态培养组要优于静态培养组。提示利用自行设计制作的双腔搅拌式生物反应器进行骨软骨复合体的体外构建是可行的,力学刺激环境下的构建效果要优于静态环境。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：     

Identification of messenger RNA of fetoplacental source in maternal plasma of women with normal pregnancies and pregnancies with intrauterine growth restriction

Objective:

to quantify placenta-specific RNA in plasma of women carrying foetuses with intrauterine growth restriction and pregnant women with normal pregnancies.

Methods:

8 pregnant women with foetuses with intrauterine growth restriction were studied as well as 18 women with uncomplicated pregnancies in the third pregnancy trimester. Total free RNA was quantified in maternal plasma by spectrophotometry and the gene expression of hPL (Human Placental Lactogen) at the messenger RNA level through technical Real Time-Chain Reaction Polymerase.

Results:

plasma RNA of fetoplacental origin was successfully detected in 100% of pregnant women. There were no statistically significant differences between the values of total RNA extracted from plasma (p= 0.5975) nor in the messenger RNA expression of hPL gene (p= 0.5785) between cases and controls.

Conclusion:

messenger RNA of fetoplacental origin can be detected in maternal plasma during pregnancy.     

Evaluation of a novel microplate colorimetric hybridization genotyping assay for human papillomavirus

Persistent infection with high-risk human papillomavirus (HR-HPV) has been associated with cervical cancer. Developing assays for the identification of these viral types is of great importance for monitoring patients and controlling strategies. The development of the MCHA (microplate colorimetric hybridization assay), a PCR-based method for identifying six of the most common HR-HPV types (HPV 16, 18, 31, 33, 39 and 45) is described. The MCHA combines the amplification with the GP5+/GP6+ consensus primers followed by PCR reverse hybridization with specific probes and detection through a colorimetric assay. The performance of the MCHA was evaluated using 108 DNA samples typed previously by the PapilloCheck^®. The agreement between both methods was 69.4% for HPV 16; 79.1% for HPV 45; 82.4% for HPV 18; 93.6% for HPV 31; 87.9% for HPV 33, and 17.6% for HPV 39. The assay had higher sensitivity than the Papillocheck^®, particularly for identifying HPV 16 and 18. The MCHA seemed to be sensitive and specific for the identification of the most prevalent HPV types in invasive cervical cancer, HPV 16, 18, 45, 33 and 31. It requires low-cost reagents and common laboratory apparatus.     

High correlation between the Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 and the Abbott m2000 RealTime HIV-1 assays for quantification of viral load in HIV-1 B and non-B subtypes

Background

HIV-1 viral load assays are critical tools to monitor antiretroviral therapy efficacy in HIV-infected patients. Two assays based on real-time PCR are available, the Abbott Real-Time HIV-1 assay (Abbott assay) and the new Roche COBAS^® AmpliPrep/COBAS^® TaqMan^® HIV-1 test, v. 2.0 (TaqMan^® test v2.0).

Objectives

We have compared the performance of the two assays in 546 clinical plasma specimens of group M strains from Luxembourg and Rwanda.

Study design

Our analyses focused on subtype inclusivity and platforms accuracy for 328 low level viremia samples.

Results

Strong agreement and linear correlation were observed between the two assays (R² = 0.95) over a wide dynamic range. Bland–Altman analysis showed a mean difference of 0.04 log 10 indicating minimal overall viral load quantification differences between both platforms. One subtype C was severely underquantified by TaqMan^® test v2.0 for which sequence analysis revealed multiple mismatches between the viral sequence and the primer/probe regions. A non significant lower quantification of the Abbott assay was shown for subtype A1 with a mean log 10 difference of 0.24. For specimens under 200 cp/mL, the overall agreement was 90% at the cut-off of 50 cp/mL and 67% at assay's lower limit of detection of 20 and 40 cp/mL. 309 samples were retested by the COBAS^® AMPLICOR^® HIV-1 MONITOR Test, v. 1.5 and a lack of agreement between the three assays around their lower limit of quantification was revealed.

Conclusions

Both real-time tests were closely comparable in the quantification of viral load specimens of ten HIV-1 subtypes and recombinant forms.