神经干细胞与功能化自组装多肽水凝胶的细胞相容性

目的 制备功能化自组装多肽水凝胶并检测其与神经干细胞(NSCs)的生物相容性.方法 合成自组装多肽RADA16 与多肽RADA16-IKVAV,将两者混合制备功能化自组装多肽水凝胶,用原子力显微镜(AFM)观察其形态学特征.采用无血清培养法从新生大鼠皮层分离培养NSCs.将NSCs分别接种到RADA16自组装多肽水凝胶(对照组)与功能化自组装多肽水凝胶(实验组)表面.激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察细胞迁移.用CCK-8法测定吸光度(A)检测细胞增殖能力.应用Nestin、MAP2、GFAP和CC-1免疫荧光染色,检测神经干细胞分化.结果 AFM显示功能化自组装多肽水凝胶由纳米纤维组成,其纤维直径为20～30 nm,长度可达数百纳米.在细胞接种6 d后,对照组和实验组细胞在水凝胶中的迁移距离分别为(27.5±3.7)μm和(53.2±5.4)μm,两组差异有统计学意义(P＜0.05).复合培养7 d后,实验组中细胞A值明显高于对照组(P＜0.05).免疫荧光结果显示13 d后对照组中MAP2阳性细胞百分率为(22.44±3.52)%,实验组为(40.35±4.84)%,两组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 功能化自组装多肽水凝胶与NSCs相容性良好.     

新型多肽神经组织工程支架与背根神经节细胞联合培养的研究

目的 观察自组装含IKVAV多肽凝胶材料与神经组织的生物相容性.方法 肽溶于NaOH溶液中,调整pH至8.5,浓度为0.01g/ml,加DMEM/F12在盖玻片上触发多肽自组装为凝胶,透射电镜检测.取新生SD大鼠背根神经节及其游离细胞分为实验组与对照组,实验组中DRG及其游离细胞与凝胶材料联合培养.倒置相差显微镜观察DRG生长情况,免疫荧光染色结合镜下细胞计数检测凝胶材料的细胞毒性和黏附性.结果 透射电镜显示:自组装凝胶为编织状纳米纤维.实验组中DRG轴突生长情况优于对照组.培养1、3d后,两组中活细胞比例差异无统计学意义.培养3、12h后,实验组中神经细胞黏附数显著高于对照组.结论 含IKVAV多肽凝胶材料能促进DRG生长和神经细胞黏附,对细胞毒副作用小,可作为优良的神经组织工程支架材料.     

两亲性肽自组装凝胶与神经干细胞相容性研究

目的将鼠神经干细胞（Neural Stem Cells，NSCs）接种于肽自组装凝胶内部，观察凝胶与NSCs的相容性。方法机械分离法从乳鼠大脑皮层获取细胞，免疫组织化学鉴定；1wt％两亲性肽溶液在DMEM／F12触发下自组装为三维多孔凝胶，透射电镜观察凝胶超微结构；1×10^5 cells／ml的NSCs悬液分别接种于凝胶内部（三维培养体系）及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面（二维培养体系），Caleein—AM和PI荧光标记．激光共聚焦显做镜观察NSCs的成活及增殖情况，CCK-8绘制细胞生长曲线。结果分离的细胞为Nestin阳性的NSCs，可分化为NSE阳性神经元及GFAP阳性胶质细胞；透射电镜显示凝胶由纳米纤维构成，纤维直径有3～5nm，长度100～1500nm：Calcein—AM／PI荧光双标显示：三维培养体系中，1h后NSCs有部分死亡；培养24h时，开始增殖；培养48h时，细胞增殖活跃，聚集成团。较二维培养明显。CCK-8酶标法显示：三维培养体系细胞增殖活力高于二维培养，且有显著性差异（p〈0．05）。结论 肽自组装三维凝胶与NSCs具有良好的细胞相容性，可促进NSCs增值。     

异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸多肽纳米纤维对神经干细胞生物学行为的影响

目的制备异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV）多肽材料并检测其对神经干细胞（NSC）的生物学行为的影响。方法合成IKVAV多肽两亲性分子，进行自组装，用透射电镜（TEM）检测。培养NSC，加入IKVAV，用CCK．8检测吸光度（A值）显示NSC活性。同时检测IKVAV对NSC黏附、分化和轴突生长的影响。结果成功合成IKVAV并自组装成为凝胶，TEM显示为纳米纤维，直径7～8nm，长度可达到数百纳米。当IKVAV浓度为20mg／g和60mg／L时，A值有明显增加，和对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。加入IKVAV后，神经球黏附率由4％上升到96％，神经球分化率由6％上升到100％，向神经元分化的比率由4．5％提高到5．6％，同时促进神经轴突生长。结论IKVAV可形成纳米纤维，并且具有良好的神经生物活性，是一种优良的神经生物材料。     

骨髓基质干细胞在IKVAV多肽纳米纤维凝胶表面增殖、黏附及向神经细胞诱导分化的研究

目的研究骨髓基质干细胞（BMSCs）与IKVAV多肽纳米纤维凝胶复合的细胞假体应用于脊髓损伤治疗的可行性。方法合成IKVAV多肽两亲性分子，进行自组装，用透射电镜检测。将IKVAV多肽纳米纤维凝胶与BMSCs复合培养，采用倒置显微镜下观察、Calcein—AM／PI染色、CCK-8法、免疫荧光双标法，检测IKVAV多肽对BMSCs增殖、黏附及向神经细胞方向诱导分化的影响。结果IKVAV多肽可成功自组装成纳米纤维凝胶，其与BMSCs复合培养细胞生长良好，活细胞数达90％以上，IKVAV多肽对BMSCs增殖没有影响，可促进BMSCs的黏附，并在诱导BMSCs向神经细胞分化过程中提高神经元分化比例。结论BMSCs在IKVAV多肽纳米纤维凝胶材料表面可良好的增殖及黏附，并可提高其向神经细胞分化过程中神经元的分化比例。     

自组袭多肽纳米支架与骨髓间充质干细胞的生物相容性研究

[目的]合成神经活性多肽IKVAV(isoleucine-lysine-valine-alanine-valine,异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)两亲性分子,在体外进行自组装纳米纤维支架,并检测其与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)的生物相容性。[方法]IKVAV多肽两亲性分子委托上海波泰生物科技公司合成,并用高效液相色谱仪和质谱仪进行纯化和分析。将IKVAV多肽两亲性分子溶于0.1 M NaOH溶液中,加入稀盐酸降低pH值引发自组装,并利用透射电镜进行观察。分离兔骨髓间充质干细胞,流式分析其表面抗原标志。将MSCs与自组装支架体外共培养12 d,测定细胞粘附率,MTT方法检测IKVAV自组装材料对细胞生长增殖的影响,观察其生物相容性。[结果]IKVAV-PA可在一定条件下自组装形成凝胶,透射电镜可见其显示为纳米纤维,其直径为7.0～8.0 nm。分离的MSCs细胞表面标志CD105、CD44、CD34和CD45的阳性率分别为99.3%、99.5%、0.1%、0.4%。共培养过程后,随着时间延长,MSCs在多肽凝胶支架上黏附率上升,吸光度增加,细胞活性增强。[...     

褪黑素对大鼠脊髓神经干细胞增殖和分化的影响

目的:研究不同浓度的褪黑素(melatonin,MT)对胚胎大鼠脊髓神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)增殖和分化的影响。方法:取孕14d胚胎大鼠脊髓,分离并原代培养脊髓NSCs。传四代后分为对照组和实验组,实验组分别加入不同浓度的MT(100μmol/L、1μmol/L及10nmol/L)。采用细胞计数结合免疫荧光检测法,观察脊髓NSCs的生长增殖及分化状况,并作统计学分析。结果:100μmol/L和1μmol/L的浓度的MT均能促进脊髓NSCs增殖;10nmol/L时则抑制脊髓NSCs的增殖;3种浓度的MT均能使脊髓NSCs向神经元分化的比率增加,对照组和实验组的神经元分化比率分别为(23.6±2)%、(45.3±1)%、(42.5±2)%、(50.7±2)%。结论:3种不同浓度的褪黑素对大鼠脊髓NSCs体外增殖有着不同的作用,但都有促进其向神经元分化的作用。     

自组装IKVAV多肽纳米支架及其对背根神经节神经元细胞的作用

目的:应用自组装IKVAV多肽纳米支架与鼠背根神经节神经元细胞(DRGc)联合培养,观察其对DRGc的作用。方法:将多肽溶于0.1MNaOH溶液中,调整pH值为8.5,多肽浓度为0.01mg/μl,与等体积DMEM/F12混合触发多肽自组装为凝胶支架,透射电镜检测。采用原代分离培养方法获得DRGc单细胞悬液后分为实验组与对照组,实验组中DRGc接种于凝胶支架表面,对照组接种于多聚赖氨酸表面,倒置相差显微镜观察神经元生长情况,采用细胞计数结合免疫细胞化学染色方法,观察DRGc的存活和轴突生长情况,并行统计学分析。结果:透射电镜下显示自组装凝胶支架为编织状纳米纤维。实验组和对照组中DRGc培养1d时平均轴突长度分别为43.8±10.4μm、33.4±5.75μm;培养14d时实验组和对照组中神经元数目分别为36.50±1.78个/视野、19.70±3.71个/视野,神经元所占比例分别为(43.60±4.83)%、(26.97±4.90)%,两组间比较有显著性差异(P<0.05)。结论:自组装IKVAV多肽纳米支架能降低神经元的死亡率,并诱导轴突的发生和生长,具有支架及生物活性双重作用,可作为神经组织工程支架材料。     

神经干细胞-多肽自组装凝胶复合体移植治疗脊髓损伤

目的 观察神经干细胞( NSCs)复合多肽自组装凝胶移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能修复的影响.方法 36只SD大鼠造模后1周随机分为3组,分别为DMEM/F12对照组(n＝12)、NSCs移植组(n=12)和NSCs-凝胶移植组(n=12).通过不同时间点BBB评分、病理组织学、免疫荧光技术评价脊髓损伤的修复.结果 移植后2周开始3组大鼠各时间点评分差异有统计学意义(P＜0.01),且组间差异均有统计学意义(P＜0.01);移植后6周,病理切片示C组大量再生的神经纤维桥接脊髓断端,胶质瘢痕不明显;免疫荧光染色示C组5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)/NF-200双标阳性细胞比例(24.83±1.47)％明显多于B组(6.83±1.47)％(P＜0.01),但B组BrdU/GFAP双标阳性细胞比例(42.17±2.71)％明显多于C组(34.33±4.63)％ (P＜0.01).结论 自组装多肽凝胶能提高神经干细胞向神经元分化的比例,复合移植能更有效地促进脊髓功能恢复.     

褪黑素与全反式维甲酸共同作用对大鼠脊髓神经干细胞分化的影响

[目的]研究全反式维甲酸(all-trans retinoic ac id,ATRA)与不同浓度的褪黑素(m elaton in,MT)共同作用对体外培养的胚胎大鼠脊髓神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元方向分化的影响。[方法]取孕14 d的胚胎大鼠脊髓,原代培养出脊髓NSCs,传4代后分别加入ATRA与不同浓度的MT组合。采用细胞计数结合免疫荧光检测法,观察NSCs细胞的生长增殖及分化状况,并作统计学分析。[结果]与对照组[(8.8±1)%]相比,单纯ATRA作用组神经元分化比率[(10.6±2%]无明显差异;单纯MT作用组100 mol/L[(24.8±2)%]与10 nmol/LMT[23.4±1%)]2组都能明显促进脊髓NSCs向神经元分化,2组间比较无明显差异;ATPA与100μmol/LMT共同作用组[(53.9±2)%],进一步提高了脊髓NSCs向神经元分化的比率;ATRA与10 nmol/LMT共同作用组[(26.7±2)%]也能促进脊髓NSCs向神经元方向分化(与对照组相比较),但其分化率与单一使用MT的2组比较无明显差异。[结论]单纯应用不同浓度的MT都促进脊髓源性的NSCs向神经元分化,但ATRA与不同浓度的MT联用对神经元分化率有着不同影响。