敲除PKD1基因的小鼠胚胎干细胞的建立

目的：通过PKD1基因打靶载体的胚胎干细胞转染，药物筛选以及分子鉴定，获得发生同源重组的胚胎干细胞克隆，为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备条件。方法：体外培养小鼠胚胎干细胞，用电穿孔的方法进行PKD1基因打靶载体的转移，并用G418进行筛选培养，得到阳性克隆后，进一步扩大培养，抽提胚胎干细胞的基因组DNA，采用DNA印迹法进行分子鉴定。结果：经G418筛培养得到192个阳性在隆，分子鉴定获得2个发生同源重组的胚胎干细胞克隆。结论：鉴定得到的2个同源重组胚胎干细胞克隆，为进一步建立PKD1基因缺陷小鼠奠定了基础。     

低剂量辐射对胚胎鼠神经源干细胞增殖影响的体外实验研究

目的探讨低剂量辐射(LDR)对胚胎鼠神经源干细胞(NSCs)体外增殖的影响。方法从孕14 d SD大鼠中获得胚胎鼠NSCs并进行体外传代培养,并对LDR前后的细胞进行鉴定,将培养至对数期的细胞分成13组,即0、25、75、200 mGy各剂量照射后4 h、24 h、48 h、72 h,各组细胞分别采用台盼蓝拒染法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验及流式细胞仪方法检测细胞的增殖程度。结果胚胎鼠NSCs体外培养获得稳定传代的NSCs,在诸多辐射剂量和时间框内,以75 mGy照射后的24 h细胞增殖最明显,细胞的增殖指数(PI)最高,且照射前后细胞的鉴定结果显示LDR不会改变其分化潜能和原始状态。结论LDR体外可以刺激胚胎鼠NSCs的增殖效应。     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法,探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞,并用EGF和血清诱导其分化,采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成,但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞,细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖,并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

小鼠胚胎干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的 探索小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ES cell）体外分化为神经前体细胞（Neural precursor cells,NPC）的无血清培养条件,比较人胚胎成纤维细胞（Human embryonic fibroblasts,HEF）与小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）对小鼠ES细胞生长的作用。方法 在MEF或HEF饲养层上培养ES细胞,培养液中含白血病抑制因子。采用无血清方法培养NPC,免疫组化方法检测巢蛋白（Nestin）,用硝基四氮啖蓝/5-溴-4-氯-吲哚基磷酸（NBT/BCIP）显色检测碱性磷酸酶。结果 无血清培养可以获得86%的NPC。HEF与MEF-样能维持ES未分化状态。结论 无血清培养方法有利于ES细胞向NPC分化,HEF可用于小鼠ES细胞的培养,而且比MEF优越。     

人胚胎皮层神经前体细胞的分离培养及鉴定

目的 从20周人胚皮层中分离神经前体细胞并鉴定其增殖及分化能力。方法 应用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清限制培养基从20周自然流产人胚胎皮层组织中分离神经前体细胞,通过神经球形成法使其不断增殖,利用BrdU检测细胞的增殖能力,去除生长因子后诱导神经前体细胞分化。利用流式细胞仪检测神经球内细胞的增殖细胞周期。结果 人胚胎皮层存在神经前体细胞,这些细胞于EGF及bFGF作用下可不断增殖形成神经球,并能自我更新和结合BrdU,于生长因子去除后能够分化成熟的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。反复传代后这些细胞可保持其增殖及分化能力。细胞周期结果显示神经球内细胞增殖较为活跃。结论 从人胚胎中分离的细胞能于体外自我更新和分化为成熟的细胞,证实为神经前体细胞。     

川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的影响

【目的】观察川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞(ES细胞)增殖及分化的影响。【方法】川芎含药血清与ES细胞共培养,采用CCK-8法检测细胞活性,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌细胞特异基因肌球蛋白重链(β-MHC)m RNA的表达水平。【结果】与大鼠血清组和胎牛血清组比较,川芎含药血清组的ES细胞活性差异无统计学意义(P0.05),川芎含药血清组心肌细胞特异基因β-MHC表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】川芎含药血清对ES细胞向心肌细胞分化有促进作用。     

腺病毒介导转录因子X盒结合蛋白1转染对神经干细胞增殖及在缺氧环境下凋亡的影响

目的:以重组腺病毒为载体,将X盒结合蛋白1基因转染胚鼠海马神经干细胞,观察其是否可以促进干细胞增殖以及在缺氧环境下的抗凋亡能力。方法:取孕16dSD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增;将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞,选取普通神经干细胞标记为对照组,转染后的神经干细胞标记为转染组。通过细胞计数和MTT比色法检测对照组和转染组的增殖情况,连续检测7d,绘制生长曲线;取两组神经干细胞用CoCl2诱导缺氧,流式细胞术检测对照组和转染组的凋亡情况。结果:转染组的胚鼠海马神经干细胞增殖能力明显增强(P<0.05);在缺氧条件下,转染组神经干细胞凋亡程度较缺氧对照组减轻(P<0.05)。结论:利用重组腺病毒作为载体成功可以将X盒结合蛋白1基因导入胚鼠海马神经干细胞中;转染后的神经干细胞增殖能力和在缺血、缺氧条件下抗凋亡能力较普通神经干细胞明显增加。     

神经调节蛋白-1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 观察神经调节蛋白-1(NRG-1)诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化及扩增心肌细胞的作用.方法 分别观察ESCs自发及NRG-1诱导情况下心肌细胞分化率;RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA及心肌骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA的表达;细胞免疫组化检测心肌α-actinin蛋白表达;血管活性药物刺激观察心肌细胞的功能反应.结果 NRG-1诱导的心肌细胞分化率显著高于自发的心肌细胞分化率(P<0.05),且诱导生成的心肌细胞对肾上腺素能及胆碱能药物刺激呈现相应的频率反应,刺激前后搏动频率差异均有统计学意义(P<0.05);NRG-1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表达,在NRG-1为100 ng/mL时表达水平最高,且两者的相对表达量明显高于自发分化组的相对表达量(P<0.05或P<0.01);NRG-1干预增加心肌细胞骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA水平且增强α-actinin蛋白表达(P<0.05).结论 外源性NRG-1早期干预能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞.     

神经调节蛋白-1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 观察神经调节蛋白-1(NRG-1)诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化及扩增心肌细胞的作用.方法 分别观察ESCs自发及NRG-1诱导情况下心肌细胞分化率;RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA及心肌骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA的表达;细胞免疫组化检测心肌α-actinin蛋白表达;血管活性药物刺激观察心肌细胞的功能反应.结果 NRG-1诱导的心肌细胞分化率显著高于自发的心肌细胞分化率(P<0.05),且诱导生成的心肌细胞对肾上腺素能及胆碱能药物刺激呈现相应的频率反应,刺激前后搏动频率差异均有统计学意义(P<0.05);NRG-1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表达,在NRG-1为100 ng/mL时表达水平最高,且两者的相对表达量明显高于自发分化组的相对表达量(P<0.05或P<0.01);NRG-1干预增加心肌细胞骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA水平且增强α-actinin蛋白表达(P<0.05).结论 外源性NRG-1早期干预能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞.     

小鼠孤雌胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

目的探讨小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经过拟胚体(EB）阶段,直接诱导分化为神经细胞的可行性。方法采用阶段诱导的方法,首先由孤雌胚胎干细胞向神经前体细胞定向分化,通过巢蛋白(nestin)免疫荧光细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定。在此基础上,撤除丝裂原,加入5%胎牛血清,观察已分化的神经前体细胞能否进一步分化为神经细胞,并对分化出的细胞进行免疫荧光细胞化学鉴定。结果经选择培养基培养3?d后的孤雌干细胞绝大多数可诱导为神经前体细胞,nestin呈阳性。加入血清进一步诱导,可分化出β-Ⅲ-tubline阳性的神经细胞。结论小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经EB培养阶段,可直接诱导分化为神经细胞,并且前期可得到大量的神经前体细胞。     

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。     

NOV对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨NOV基因和蛋白对大鼠神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法：NOV基因重组质粒转染COS－7细胞和NSCs，收集COS－7细胞和NOV基因修饰COS－7细胞的条件培养液（简称COS－CM和NOV－CM），作用于培养的NSCs，^3H-TdR掺入检测NSCs的增殖，免疫细胞化学和流式细胞仪检测NSCs的分化。结果：①NOV－CM能明显促进NSCs对^3H-TdR的摄入，说明NOV－CM能明显促进细胞的增殖，另外NOV－CM的促细胞增殖作用具有一定的量效关系；②免疫细胞化学和流式细胞仪结果显示，NOV－CM促进NSCs向神经元方向分化；③NOV基因修饰NSCs分化时，神经元的比例增高。结论：NOV可能具有促进NSCs增殖和分化的作用。     

丙泊酚对大鼠胚胎神经干细胞增殖及分化的影响

目的探讨丙泊酚对体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响。方法采用孕14～16 d Wistar大鼠,进行NSCs原代培养并用Nestin鉴定,按以下给药分成六组:空白对照组(control)、脂肪乳对照组(introlipid)、丙泊酚不同浓度组[5、25、50、100μmol/l],用5-溴脱氧尿(Brdu)掺入法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞增殖的影响。胚胎神经干细胞诱导分化过程中加入50μmol/l丙泊酚,采用NeuN、GFAP免疫组化法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞分化的影响。结果分离培养的神经干细胞95%以上呈Nestin阳性,不同浓度丙泊酚组Brdu阳性细胞百分数没有差异,丙泊酚NeuN阳性细胞百分数(23.1±0.9%)明显高于对照组(13.4±0.8%)(P<0.05),而GFAP细胞阳性细胞数与对照组相比没有明显差异。结论临床相关剂量丙泊酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖没有影响,但能诱导神经干细胞向神经元细胞分化。     

几种培养方法对ES/GFP小鼠胚胎干细胞系增殖和分化能力作用比较

目的　观察采用不同的饲养层和培养基对永久表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞系ES/GFP的增殖、分化和绿色荧光蛋白表达的影响。方法　分别采用小鼠胚胎成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞为饲养层 ,采用含重组人白血病抑制因子的DMEM/FCS培养基和Buffalo条件培养基培养ES/GFP细胞系。N2 无血清培养基诱导ES/GFP小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞 ,Nestin免疫组化染色。结果　小鼠胚胎成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞为饲养层 ,常规LIF培养液和Buffalo条件培养基均能较好维持ES/GFP细胞的高增殖能力和全能分化能力 ,对绿色荧光蛋白的表达和胚体形成、神经前体细胞的分化无明显差异。结论　人胚胎成纤维细胞可替代小鼠胚胎成纤维细胞作为ES/GFP饲养层 ,减少饲养层制备的工作量和污染的机会。Buffalo条件培养基可完全替代LIF培养基 ,降低细胞培养的成本。     

Cdyl基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系的建立及鉴定

【目的】 建立Cdyl 基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系(iPSC)。【方法】 通过组织块贴壁法培养Cdyl-/-的胚胎成纤维细胞(MEF)。将pMx-Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和hrGFP五种质粒分别转染Plat-E细胞,收集病毒上清,感染Cdyl-/- MEF获得Cdyl-/- iPSC,并对Cdyl-/- iPS细胞的分子标记及体内外分化能力进行检测。【结果】 取Cdyl-/-胎鼠皮肤,培养得到增殖旺盛的Cdyl-/- MEF。成功包装逆转录病毒并感染Cdyl-/-MEF,得到胚胎干细胞样的Cdyl-/- iPS细胞。该细胞表达AKP、Oct3/4、SSEA-1,在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。【结论】 Cdyl-/- iPS细胞具有自我更新和多向分化能力的特性。Cdyl-/- iPS细胞系的建立为研究Cdyl在小鼠早期胚胎发育中的功能提供一个良好的细胞模型。     

胚胎大鼠脑内神经干细胞增殖和分化特性的初步探讨

目的 观察胎鼠发育过程中脑内神经干细胞增殖、迁移和分化特点。方法 在妊娠8～10d、12～13d和15～16d的孕鼠，分别于腹膜腔内注射BrdU，妊娠17d时取其胎鼠脑组织制备切片，免疫细胞化学方法观察BrdU标记的增殖细胞密度和分布；取E13d、E15d和E17d胎鼠皮质，分离获得神经细胞并制备成滴片，免疫细胞化学方法抗nestin和抗NeuN染色，观察不同胚期胎鼠皮质神经干细胞和神经元细胞比例。结果 E8～10d时BrdU标记的细胞主要分布于脑室周围和顶叶皮质；E12～13d时BrdU标记的细胞主要分布于脑室周围、基底节区和顶叶皮质；E15～16d时BrdU标记的细胞主要分布于丘脑和颞叶皮质。E13d、E15d和E17d胎鼠皮质nestin免疫反应阳性细胞比例随胚龄增加而逐渐减少（分别为66．4％、32．1％和3．4％），NeuN免疫反应阳性细胞比例逐渐增加（分别为17．2％、35．6％和92．3％）。结论 胎鼠发育过程中脑内神经干细胞增殖并按一定模式顺序迁移至各脑区，至出生前皮质神经细胞已基本分化成熟。     

GM-1对培养的人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的：观察不同剂量神经节苷脂（GM－1）对神经干细胞增殖和分化的影响。方法：从人胚胎脑组织分离出神经干细胞，培养于含bFGF（阳性对照组）和B27（阴性对照组）的DMEM／F12细胞培养液中，实验组培养液中分别加入0．335μg/L，3．35μg/L及33．5μg/L的GM－1，用MTT比色分析法测定细胞增殖能力，用含体积分数3％血清的DMEM／F12培养液诱导细胞分化，每间隔6h于倒置显微镜下观察细胞分化情况，结果：5d,10dMTT比色显示，GM－1（33．5μg/L）组与阳性对照组比较，P均＞0．05，与阴性对照组比较，P均＜0．05，GM－1（0．335μg/L）组，GM－1（3．35μg/L）组与阴性对照组比较，P均＞0．05。分化实验发现，接种6h后，体积分数3％血清＋DMEM／F12组神球周边可见明显的细胞突起，呈放射状向周围伸出，而3个实验组和阴性对照组的细胞突起短且细小，随着培养时间的延长，各组的细胞突起逐渐伸长，3个实验组分化能力低于对照组，与阴性对照组之间无明显差异，结论：GM－1能够维持神经干细胞的原始神经状态，促进神经干细胞的增殖，对神经干细胞无明显的诱导分化作用。     

受体相互作用蛋白140敲低对小鼠小胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨受体相互作用蛋白(RIP)140基因敲低对小鼠小胶质瘤细胞(BV-2)增殖的影响.方法 用脂质体转染方法将RIP140-短发夹RNA(shRNA)质粒导入BV-2细胞,用嘌呤霉素筛选稳定表达RIP140-shRNA的细胞系,用实时定量PCR和Western印迹法检测RIP140敲低的效果,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RIP140敲低对细胞增殖的影响.结果 成功构建稳定表达RIP140-shRNA的BV-2-71674和BV-2-71080;与BV-2细胞相比,BV-2-71674和BV-2-71080细胞中RIP140的表达无论mRNA水平还是蛋白质水平均明显低,下调率(mRNA)分别为73%和75%(均P<0.01);MTT法检测显示,BV-2细胞在24、48、72、96 h 4个时间点增殖率分别为3.03±0.01、7.36±0.08、14.15±0.25、23.35±0.09,BV-2-71674细胞则分别为2.15±0.03、6.43±0.08、11.77±0.31、18.47±0.04,BV-2-71080细胞分别为1.77±0.03、4.74±0.25、10.03±0.02、17.66±0.21;BV-2-71674和BV-2-71080细胞增殖率均明显低于BV-2细胞,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论 RIP140敲低可以抑制BV-2细胞的增殖.