DEAE-Sepharose FF 纯化脊髓灰质炎病毒Sabin株Ⅰ型稳定性研究

【摘要】 目的 观察离子交换纯化脊髓灰质炎病毒Ⅰ型Sabin株稳定性,以研究病毒纯化的回收率和质量控制。方法 使用微载体培养Vero细胞和脊灰病毒Ⅰ型Sabin株,经过逐级过滤澄清和100K超滤膜浓缩,再经凝胶介质初步纯化后的病毒液,然后观察经过离子介质DEAE Sepharose FF层析纯化5批次的纯化效果。对每次纯化获得的病毒液测定D抗原、蛋白质含量、牛血清白蛋白含量、DNA残留量以评价其质量。结果 凝胶纯化后的病毒液,经离子介质DEAE Sepharose FF纯化,其D抗原、蛋白质含量、牛血清白蛋白含量、DNA残留量和比活性的批间差异不显著(P＞005)。结论 离子介质DEAE Sepharose FF在一定批次内纯化脊灰病毒工艺稳定。     

全球首个Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗获批上市

2015年1月14日,国家食品药品监管总局批准了全球首个Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(单苗)的生产注册申请。该疫苗是由中国医学科学院医学生物学研究所研发,通过采用现行脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产毒株(Sabin株),经在Vero细胞生物反应器培养收获病毒,结合灭活疫苗生产工艺制备而成。该疫苗主要通过注射途径用于儿童预防脊髓灰质炎病毒的感染,它的上市将对我国彻底消灭脊髓灰质炎发挥至关重要的作用。虽然脊髓灰质炎减毒活疫苗免疫力强、作用时间长,但由于它是一种减毒活疫苗,本身仍具有潜在的致病危险,     

SepharoseFF凝胶柱分离参数变化对蝎毒抗癌多肽纯化的影响

目的：优选毒抗癌多肽组分Ⅲ的分离参数,方法：Ｅ 同长度的ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ阳离子交换凝胶柱及不同样品洗脱速度,比较ＡＰ－Ⅲ的分离效果。结果：当柱长为２５ｃｍ,直径为５ｃｍ,流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ时,可分离,ＡＰ－Ⅲ纯度为８９％;分别０．８,０．５和０．２ｍｌ／ｍｉｎ流速进行层析,可分别同６,４,３个峰,ＡＰ－Ⅲ相应的纯度为８９％,８５％,８３％。当柱长为１２．５ｃｍ,而其他条件相同时,得到     

糖基化终产物—牛血清白蛋白的制备和纯化

目的　制备高纯度的糖基化终产物(AGEs) 用作免疫原或检测标准品。方法　牛血清白蛋白(BSA) 与葡萄糖在体外共同孵育制备AGEs - BSA,经凝胶层析纯化后,应用荧光光谱和SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果　纯化后AGEs - BSA 与标准的AGEs - BSA 电泳图谱基本一致;激发和发射光谱均为单峰,分别位于360 nm 和446 nm 。结论　应用凝胶层析纯化AGEs - BSA 效果满意     

茶树油灭活脊髓灰质炎病毒的试验观察

目的　观察茶树油 (teatreeoil,TTO)对脊髓灰质炎病毒 (poliovirus ,PV)的杀灭效果 ,了解TTO对病毒的灭活能力。方法　根据消毒技术规范指定的方法 ,采用细胞感染试验测定病毒与各浓度TTO溶液作用前后感染细胞的滴度。结果　 0 .5 %TTO作用 40min和 60min能分别灭活PV 4.3 3log10和 5 .5log10 ;1.0 %TTO作用 40min和 60min能灭活PV 5 .3 3log10和 5 .5log10。结论　TTO对悬液中的PV有明显的杀灭作用。     

消毒剂对脊髓灰质炎病毒感染力灭活的研究

目的：评价微量组织培养半数感染量病毒滴定法（简称微量ＴＣＩＤ５０法）检测４种常用消毒剂对脊髓灰质炎病毒（ｐｏｌｉｏＶ）的灭活效果。方法：将ＰｏｌｉｏＶ滴定于９６孔细胞培养板中的细胞上进行培养，测定病毒接触消毒剂前后感染细胞的滴度。结果：２％碱性戊二醛、１％二氯异氰尿酸钠（５２００ｍｇ·Ｌ１）５ｍｉｎ内能有效杀灭ｐｏｌｉｏＶ（病毒滴度下降≥３ｌｏｇ），０．２％过氧乙酸和０．５％碘伏（４０００ｍｇ·Ｌ１）需１０ｍｉｎ（病毒滴度下降＞３ｌｏｇ）。结论：用微量ＴＣＩＤ５０法评价消毒剂对病毒的灭活效果，客观、灵敏、简便易行     

血清对Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测结果的影响

目的 比较6种不同血清对Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度（CCID₅₀）检测结果的影响。方法 分别采用6种未处理血清和6种预处理血清组（免疫吸附法）进行Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测（微细胞病变法）,检测了不同组血清中Ⅱ型脊髓灰质炎病毒中和抗体滴度,并使用处理血清组进行促细胞生长试验。最后分析不同血清对感染性滴度的影响。结果 6种未处理血清组病毒感染性滴度检测结果差异有统计学意义（P<0.01）,6种处理血清组病毒感染性滴度差异无统计学意义（P>0.05）。未处理组2号血清的中和抗体滴度为1：4,6号血清的中和抗体滴度为1：8,其余各组血清的中和抗体滴度均<1：4。6种处理血清组的中和抗体滴度均为1：2。血清促细胞生长试验显示6种处理组血清细胞生长趋势正常。结论 Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测前使用免疫吸附对血清进行预处理,可降低血清中存在的中和抗体对检测的影响,为比较不同实验室数据提供可能。     

新城疫病毒的制备纯化与初步鉴定

目的获得纯化的新城疫病毒,为下一步病毒的应用打下基础。方法利用传统鸡胚培养方法制备新城疫病毒（NDV）,通过PEG-6000沉淀,差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法提取纯化了新城疫病毒（NDV）。以血凝实验微量法测定其滴度和活性。用电镜及SDS-PAGE方法对纯化病毒进行鉴定。结果纯化病毒经磷钨酸复染后电镜观察,能看到典型病毒颗粒,SD孓PAGE电泳显示有较纯的蛋白条带。结论病毒纯化效果较好,为我们下一步病毒的功能研究及其应用打下了坚实的基础。     

水中脊髓灰质炎病毒细胞感染模型中病毒株与细胞株的筛选

目的：根据5种细胞系对脊髓灰质炎病毒1型（PV1）5个毒株的敏感性筛选适用于病毒消毒实验的病毒株和细胞系．方法：比较各毒株在不同细胞系中增殖3d～7d后的细胞病变作用（CPE）、半数组织培养感染里（TCⅡ）50）、蚀斑计数（PFU）及免疫印迹（DIBA）试验结果．结果：CPE与TCID）检测表明，同一细胞系Hep2和Hela中病毒感染细胞作用强弱为Henan，Hebei＞Brunhide，Mahony＞Sabin株；不同细胞系对同一病毒株的敏感性为Hep－2＞BGM＞Hela,Vero＞RD细胞．DBA检测提示，Henan株较Brun－hide更易检出．结论：Henan株及Hep－2细胞可作为PV消毒实验所用的病毒和细胞．     

人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的纯化

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型主要衣壳蛋白 L 1的纯化方法。方法 :分别利用亲和层析和离子交换层析对重组融合蛋白 p ET30 a- 6× His- L 1进行了纯化。结果 :以包涵体形式表达的重组蛋白在变性条件下经 Ni- NTA Agarose、Q- Sepharose FF纯化 ,透析复性后均获得较高纯度 ,回收率分别为 30 %和2 9%。结论 :亲和层析和离子交换层析都是纯化重组 L 1蛋白的适宜方法 ,二者纯化效率相当。     

抗原嵌合性（Ⅰ／Ⅱ型）脊髓灰质炎病毒小鼠神经毒力的实验观察

为探讨脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Lansing株中和抗原位点1(N-Ag1)在对小鼠适应能力和神经毒力中的意义和作用,本实验采用DNA重组技术构建的2株抗原嵌合性(Ⅰ/Ⅱ型)PVXF414和XF324,对小鼠适应性和神经毒力进行研究。证明Ⅰ型Mahoney株中的N-Ag1被LansingⅡ型毒株的N-Ag1肽段取代后,形成的抗原嵌合性PV Ⅰ/Ⅱ型毒株脑内接种能引起小鼠中枢神经系统脊髓灰质炎病变,导致四肢麻痹或死亡。从麻痹小鼠大脑组织中分离到与接种病毒抗原性相同的活病毒,表明N-Ag1上这一小段氨基酸序列在决定PV宿主适应性中起重要作用;N-Ag1可能与病毒吸附和穿入小鼠中枢神经组织细胞有关。     

塔城病毒1重组核蛋白的原核表达和纯化

目的 通过原核表达系统表达可溶性塔城病毒1 (Tacheng tick virus 1,TcTV-1)重组融合核蛋白(nucleoprotein,NP)并纯化获得纯度高和均一度好的目的蛋白.方法 利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从经密码子优化的重组质粒中扩增TcTV-1核...     

HIV-Ⅰ CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA质粒的构建和表达研究

目的 构建HIV-1 CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒，并鉴定、检测基因及其表达。方法 用PCR技术获得人免疫缺陷病毒CN54株的gagprotease基因，并使其两端带上合适的酶切住点，将其定向插入到包含脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒pSVA14中，替代其部分结构基因，构建HIV基因嵌合缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组的表达质粒。经筛选、鉴定后用脂质体转染技术将新构建的质粒转入Hela细胞内，用Western Blot方法检测目的基因在Hela细胞内的表达。结果 PCR技术扩增所得的人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因经琼脂糖凝胶电泳、DNA测序证实成功获得，未引入突变碱基，筛选、鉴定证明gagprotease基因被正确定向插入到脊髓灰质炎病毒的cDNA序列之中，Western Blot检测到gagpro-tcase基因正确表达了相关蛋白。结论 成功构建了表达人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因的缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组嵌合质粒，为利用脊髓灰质炎病毒作人免疫缺陷病毒基因的表达载体奠定了基础，此研究对开发以脊髓灰质炎病毒为艾滋病的疫苗载体有重要意义。     

人呼吸道合胞病毒不同纯化方法的比较研究

目的比较人呼吸道合胞病毒(HRSV)的2种纯化方法。方法 HRSV经超滤浓缩后,分别采用蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化。对纯化产物进行感染性效价、SDS-PAGE还原电泳分析及Western blot检测,并取目的产物免疫ICR小鼠,检测免疫血清的中和抗体效价。结果经还原电泳,蔗糖密度梯度离心和Sepharose 4FF凝胶过滤层析的纯化产物都在60~70kDa间呈现一主要条带,前者证实为HRSV特异性F蛋白;但在Sepharose 4FF凝胶过滤层析3个样品(第2峰)中检测出目的病毒,感染性效价分别为4.50、4.25和6.25 lgCCID50/ml。两种方法所得纯化产物免疫ICR小鼠均能诱导产生中和抗体,几何平均效价(GMT)为1∶13.93~1∶4.00。含铝佐剂组的抗体阳性率和中和抗体GMT分别是不含铝佐剂组的1.5~2.0倍和1.0~1.4倍。β-丙内酯灭活组的抗体阳性率和中和抗体GMT分别是甲醛灭活组的1.0~1.3倍和1.0~1.1倍。结论蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析法均能纯化出HRSV,后者效果更好、效率更高。加铝佐剂有助于提高抗体阳转率;β-丙内酯和甲醛2种灭活剂对免疫效果的影响差异不大。     

氧化铝柱纯化吴茱萸提取液中总生物碱和柠檬苦素的研究

目的 研究中性氧化铝柱纯化吴茱萸总生物碱和柠檬苦素的工艺。 方法 以转移率和质量分数为评价指标,对水沉工艺的pH值,氧化铝柱色谱的上样量、洗脱剂的种类、洗脱剂体积和洗脱体积流量进行考察。 结果 水沉工艺的pH值为3,氧化铝柱色谱的上样量20 g,洗脱剂为醋酸乙酯二氯甲烷 (70∶30),洗脱剂用量为5 BV和洗脱速度为2 BV/h。 结论 氧化铝柱色谱对吴茱萸活性成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素的纯化方法可行,经济简便,效率较高。     

纯化HBsAg诱导病毒性肝炎病人外周血单个核细胞产生干扰素的研究

作者以纯化HBsAg为诱生剂,在急性病毒性肝炎(18/23)、慢性肝炎(7/9)及正常人(8/9)的外周血单个核细胞培养中诱生出干扰素,但三者产生干扰素的能力无显著差别(P>0.05)。纯化HBsAg诱生的干扰素在热(56℃,1小时)及酸性(PH2,24小时)环境下相对稳定,不能被抗人γ干扰素单克隆抗体所中和。     

脊髓灰质炎型间嵌合病毒XF414和XF3株的纯化,灭活及免疫原性

免疫电镜、中和抑制试验和D-Ag检测证实,经甲醛处理灭活的PV-1/PV-2(XF414株)及PV-1/PV-3(XF3株)型间嵌合病毒株仍具有二价抗原性,用其免疫家兔,仍能诱导机体产生二价抗PV中和抗体.     

免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒F蛋白方法的建立

目的 利用免疫磁珠分离技术(IMS)建立快速纯化人呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F)的方法.方法 表达RSV F的重组腺病毒FGAd/F感染293细胞,收获细胞裂解液,利用兔抗人RSV多抗包被表面活化的免疫磁珠富集和纯化F蛋白,同时建立夹心ELISA,检测纯化的F蛋白浓度以及 F蛋白的回收率.结果 采用IMS成功纯...     

人乳头状瘤病毒86E7重组蛋白的高效表达、纯化和表征

[目的]基因工程法构建谷胱甘肤S-转移酶(GST)-人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus)HPV86 E7融合蛋白表达质粒,高效表达、纯化、鉴定蛋白质和分析蛋白质的存在形式.[方法]GST-HPV86 E7融合蛋白基因与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1-GST-HPV86 E7,重组质粒转入BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-HPV86 E7,柱上切除GST标签,Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE、MALDI-TOF和色谱质谱联用系统分别用于蛋白质纯度分析、分子量测定和蛋白鉴定;非变性电泳和分子筛排阻色谱用于蛋白质四级结构的分析.[结果]HPV86 E7大肠杆菌中正确表达,基质辅助激光解析飞行时间质谱测得的HPV86 E7精确分子量为(11319.76±5.66)Da.反相高压液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定的匹配肽段有11个肽段,氨基酸的覆盖率为90%.非变性PAGE和凝胶过滤层析实验观察到了HPV86 E7的单聚体、二聚体及多聚体.[结论]重组质粒pGEX-6P-1-GST-HPV86 E7成功构建,诱导后高效表达GST-HPV86 E7融合蛋白,HPV86 E7得到纯化,质谱分析证实表达蛋白为86E7蛋白,以多聚体形式存在.     

汉滩病毒S基因5''端311bp编码蛋白的原核表达、纯化及其抗原性分析

目的进一步了解汉滩病毒核蛋白氨基端的抗原特性. 方法构建汉滩病毒S基因5端311 bp片段的原核表达载体,并诱导表达和纯化了Mr 3.6×104的融合蛋白(汉滩病毒核蛋白氨基端Mr 1.0×104与Mr 2.6×104 GST融合);用mAb,以Western-blot和ELISA方法对该蛋白的抗原位点进行了鉴定. 结果与完整核蛋白反应的mAb中仅有部分与Mr 3.6×104融合蛋白反应,而与核蛋白氨基端Mr 2.6×104片段反应的5株mAb(1A8,A35,8E8,3A9,3G11)都能与Mr 3.6×104融合蛋白反应. 结论汉滩病毒核蛋白氨基端Mr 1.0×104以内存在一个或几个线性表位,而羧基端可能主要起着维持完整核蛋白立体构象的作用,并影响识别立体表位的mAb与该蛋白的结合.