Isolation,culture and detection of molecular marker of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood and umbilical cord

目的 探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记.方法 人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton＇s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代.将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况.利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原.结果 经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一.人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代.经冷冻保存,复苏后仍能较好生长.人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达.结论 人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源.     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（MSCs）的特性及向神经细胞分化的可能性,为神经移植寻找新的细胞来源。方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;丹参和B巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化,用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定;半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞的神经相关基因表达。结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105仿呈现高表达,造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD27、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80（137—1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化,分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白（Nestin）,神经元的标记类神经微管（β-TubulinⅢ）和神经微丝（NF）,以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。RT-PCR检测证实,经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin,诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin,诱导后的表达明显增强。结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增,其表达MSCs的表面标记。不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞,表达神经细胞的相关标记和基因,这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。     

脐带间充质干细胞在精原细胞培养条件下的生殖细胞特性

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞(MSCs)在精原细胞培养条件下向精原细胞方向分化的潜能.方法 采用组织块贴壁法获得MSCs,取第3代MSCs分组进行诱导培养:对照组用基本培养液培养,实验组用条件培养液培养.用倒置显微镜和扫描电镜观察对照组和实验组细胞的外部形态差异;透射电镜观察2组细胞内部的超微结构变化;免疫组织化学方法 检测2组细胞是否表达精原细胞的标记物CD117及CD49f;Western blot进一步检测2组细胞表达精原细胞特异性标记物CD49f的情况.结果 以人脐带华尔通胶为原料培养获得的贴壁细胞高表达MSCs相关的标记,不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记,并可以维持在未分化状态稳定生长、增殖;实验组细胞形态发生了明显变化,由成纤维细胞形变为圆形,并发现极少数变圆的细胞继续分化呈形似蝌蚪状,对照组细胞形态不发生类似变化,超微结构也显示了很大的差异;免疫组织化学证实实验组细胞表达精原细胞的标记物CD117、CD49f,而对照组细胞不表达CD49f,CD117弱阳性表达;Westem blot进一步证实人脐带MSCs诱导前不表达精原细胞标记CD49f,而诱导后表达CD49f.结论 用组织块贴壁法获得人脐带来源的MSCs,在精原细胞培养条件下进行诱导培养,不仅能发生精原细胞样的形态变化及伴发细胞的分化过程,而且能表达精原细胞的特征性标记,证实人脐带来源的MSCs具有向精原细胞方向分化的潜能.     

人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性

目的探讨人脐带血来源间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经元样细胞的可行性及条件。方法采用Fi- coll-Paque(1.077 g/mL)分离液密度梯度分离人脐带血中MSCs,体外扩增纯化后,二甲基亚砜、巯基乙醇及丁羟茴醚等试剂诱导其向神经细胞分化,显微镜下观察,细胞免疫化学法鉴定。结果诱导后脐血MSCs具有典型神经元形态细胞,免疫细胞化学显示神经丝蛋白(NF-M)染色呈强阳性,占(81．86±4．06)％;Nestin染色呈阳性细胞占(39．99±4．60)％;GFAP染色阴性。结论人脐带血MSCs在体外培养及诱导条件下可定向分化为神经元样细胞。     

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。     

婴幼儿血管瘤内皮细胞的体外培养及冻存

目的 研究婴幼儿血管瘤内皮细胞的体外分离培养及进行冷冻保存,探讨建立血管瘤内皮细胞库的可能性.方法 应用胶原酶消化结合免疫磁珠法分离获得血管瘤内皮细胞,以含20%胎牛血清的EGM-2培养液进行培养.vWF免疫荧光染色鉴定所培养内皮细胞及其纯度.按慢冻速融原则对血管瘤细胞进行液氮冻存、复苏,比较未冻存和复苏血管瘤内皮细胞的活力、形态、增殖能力、低密度脂蛋白摄取能力以及细胞凋亡率.结果 CD31免疫磁珠阳性分选获得高纯度的原代血管瘤内皮细胞,复苏后细胞存活率约为未冻存细胞的94.8%,二组细胞形态学无明显差异,生长曲线相似,增殖能力差异无统计学意义,冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高,但无统计学意义.结论 胶原酶消化结合免疫磁珠法能获得高纯度的血管瘤内皮细胞,冻存的血管瘤内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力,为血管瘤的后续实验研究提供了稳定的细胞来源.     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和诱导分化能力的研究

目的 从脐血中分离单个核细胞(MNCs)，体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能。方法 取35份足月顺产新生儿脐血，密度梯度离心法分离出其中的MNCs，采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs。显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色，流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型，体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力。结果 从12份脐血中可培养出MSCs，形态上与从其他来源的MSCs类似，可传至20代而无形态上的变化。细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性，非特异性酯酶——α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyrjc acid esterase，NBE)阳性。其表达CD29、CD44和CD105，特别是人类MSCs标记SH-2和SH-3阳性，而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性，说明它们并非来自造血细胞。这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下，2周左右可以诱导分化形成骨细胞，20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞。脐血MSCs预诱导12h后，胞体发生收缩，细胞边缘有细的突起。正式诱导5h后大多数细胞呈现典型的神经元样。结论 胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs。这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能。     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和

目的从脐血中分离单个核细胞(MNCs),体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能.方法取35份足月顺产新生儿脐血,密度梯度离心法分离出其中的MNCs,采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs.显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色,流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型,体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力.结果从12份脐血中可培养出MSCs,形态上与从其他来源的MSCs类似,可传至20代而无形态上的变化.细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性,非特异性酯酶--α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyric acid esterase,NBE)阳性.其表达CD29、CD44和CD105,特别是人类MSCs标记SH-2 和 SH-3 阳性,而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性,说明它们并非来自造血细胞.这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下,2周左右可以诱导分化形成骨细胞, 20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞.脐血MSCs预诱导12 h后,胞体发生收缩,细胞边缘有细的突起.正式诱导5 h后大多数细胞呈现典型的神经元样.结论胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs.这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能.     

再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞免疫调节特性和造血支持作用的研究

目的研究再生障碍性贫血(AA)患儿骨髓间充质干细胞(MSCs)的免疫调节特性和支持造血的功能。方法从AA患儿和成人骨髓中分离、培养、扩增MSCs,用流式细胞仪测定免疫标记;用3H-TdR法检测PHA刺激后,正常淋巴细胞转化以及MSCs对转化的影响;用造血祖细胞集落培养法(CFU-c)检测MSCs对造血的支持作用。结果从AA患儿骨髓中分离得到了MSCs,与正常骨髓MSCs具有相似的细胞形态和表面标志,但其增殖能力低于正常骨髓MSCs。AA-MSCs体外可抑制脐血淋巴细胞的转化,其抑制能力随细胞数量增加而增强,但与正常骨髓MSCs相比,抑制作用较弱。AA-MSCs体外可以支持脐血造血细胞的生长,但其支持能力只有正常骨髓MSCs的一半。结论AA-MSCs与正常MSCs虽体外生长形态相似,但传代能力、免疫抑制力及对造血集落生长的支持作用均较正常骨髓MSCs减低,提示间充质干细胞参与再生障碍性贫血的发病机制。     

人间充质干细胞体外扩增及生物学特性的研究

目的探讨成人骨髓、胎儿骨髓和人脐血3种不同来源的人类间充质干细胞(MSC)体外扩增及其生物学特性.方法观察3种来源的MSC的生长、增殖和表面标志的表达,从而评价MSC的纯化、增殖能力及其免疫学特性.结果 (1)3种不同来源的人MSC的细胞形态、集落数、集落大小均无差异;但成人骨髓MSC在集落形成及集落交错融合时间上均早于胎儿骨髓和脐血MSC; (2) 3种来源的人MSC传代培养增殖速度无差异,但脐血和胎儿MSC融合后无接触抑制,而成人骨髓MSC存在接触抑制; (3) 来源于骨髓单个核细胞(MNC)8×106或脐血MSC 25×106的MSC,经体外扩增3代、5代和10代后,细胞数分别为107、108和1010个; (4)MSC易纯化,P2代细胞均一性为90%,P3代细胞均一性为95%,P5代细胞均一性达到99%;(5) 不同来源的MSC表面重要标志CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166表达均为阳性,其造血细胞表面标志CD11a、CD14、CD33、CD34、CD28、CD45、CD117表达均为阴性,与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40和CD40L均为阴性.3种不同来源的人MSC表面标志,差异无显著性.(6) 两种不同培养体系对人MSC的纯化扩增及生物学特性无影响.结论 (1)不同来源的人MSC生物学特性无明显差异;(2) 人MSC在体外易扩增纯化,增殖能力强,符合临床组织工程的需要;(3) 人MSC不表达造血细胞及与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志,有可能突破HLA屏障,广泛应用于临床.     

人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化可能性,为心肌细胞移植探索新细胞来源。方法采用5-氮杂胞苷（5-Aza）和二甲基亚砜（DMSO）诱导人脐带间充质干细胞分化。观察诱导后分化细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化心肌样细胞的心肌肌钙蛋白I（troponin I）、心肌肌钙蛋白T（troponin T）和心肌结蛋白（desmin）,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定分化的心肌样细胞是否有细胞心肌特异转录因子（Nkx2.5）和心肌细胞desmin的cDNA表达。结果人脐带MSCs经5-Aza和DMSO诱导后可向心肌样细胞分化,分化细胞表达心肌细胞的标记troponinI、troponinT和desmin。RT-PCR检测证实,人脐带MSCs诱导前不表达Nkx2.5和desmin,经5-Aza和DMSO诱导后表达心肌细胞标记Nkx2.5和desmin。结论人脐带间充质干细胞可以分化为心肌样细胞,5-Aza和DMSO可作为心肌细胞诱导剂,人脐带间充质干细胞可以作为心肌细胞的来源。     

脐血间充质干细胞成功培养的相关因素探讨

目的探讨影响人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成功培养的相关因素,以期提高其培养成功率。方法脐血依胎龄分为3组:40周胎龄组(n＝11);36周胎龄组(n =6);32周及其以下胎龄组(n=5)。采用相对适宜的条件培养,观察能成功培养出MSCs的比率,探讨脐血MSCs培养与胎龄、脐血单个核细胞数量(mononuclear cells,MNCs)、脐血容量之间的相关关系,以及各因素之间可能存在的相关关系。通过检测脐血MSCs的生长曲线、细胞群体倍增时间、成纤维细胞集落形成数目(fibroblast colony forming unit,CFU-F)、表面标志的表达来观察脐血MSCs细胞的生物学特性。结果脐血MSCs培养成功率达54．5％。MSCs培养成功与否与接种于培养瓶内脐血MNCs数量密切相关,脐血MNCs接种数量在1．25×108／L以上者培养成功率达83．3％。单位体积内脐血MNCs含量与胎龄呈负相关。小胎龄者脐血MSCs成集落能力(CFU-F数目)高于大胎龄。流式细胞术检测显示,在原代培养细胞增殖期末间充质干细胞的重要表面标志CD29有62．1％的表达,传1代细胞表达CD29、CD105分别为78．3％和85．0％;造血系统的表面标志CD34、CD45则始终在3．0％以下。结论脐血MNCs的接种数量在1．25×108／L以上可以提高培养的成功率。相同容量内脐血MNCs与胎龄呈负相关,且脐血MSCs样细胞集落形成能力(CFU-F计数)小胎龄者高于大胎龄,可能是小胎龄脐血MSCs相对容易培养成功的原因之一。     

人脐血间充质干细胞对脐血CD+34细胞体外扩增作用的研究

目的 探讨含人脐血来源的间充质干细胞(MSCs)体系在体外对脐血造血干细胞(HSCs)扩增作用。方法 (1)用含人脐血MSCs及不同造血生长因子(HGFs)组合的无血清扩增体系对人脐血CD34^ 细胞进行体外扩增。(2)于扩增前及扩增后第6、12天分别用双色流式细胞仪动态检测HSCs表面抗原标记：CD34^ 、CD34^ CD38^-、CD34^ CD3^ 、CD34^ CD19^ 、CD34^ 和CD34^ CD41^ 。细胞的含量。(3)按本实验室方法行体外半固体培养,观察扩增前后脐血细胞粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)、混合集落形成单位(CFU-Mix)及高增殖集落形成单位(CFU-HPP)集落形成情况。结果(1)含人脐血MSCs体系对脐血CD34^ CD38^ 细胞的扩增倍数在第6天和第12大分别为159和437倍。该业群百分比在单纯因子组扩增第12天时为1．98％,而在含脐血MSCs组为9．98%,明显高于扩增前。(2)集落培养表明,含脐血MSCs组扩增第12天与扩增第6天相比,其CFU-Mix和CFU-HPP的扩增倍数增加,而单纯因子组这两种集落的扩增倍数下降。(3)随扩增天数的增加,两组扩增体系中CD34^ CD3^ 和CD34^ CD41a^ 细胞均明显增加,而CD34^ CD19^ 和CD34^ CD3^ 细胞均明显减少。两组相比,含脐血MSCs组差异更显著。结论 (1)含脐血MSCs体系不仅能扩增更原始的造血干／祖细胞(HSPC),且具有在短期内(12d)保持HSCs不耗竭。(2)含脐血MSCs体系对脐血CD34^ 细胞向定向祖细胞的扩增,主要为髓系及巨核系祖细胞,而对其向淋巴系祖细胞的扩增具有抑制作用。     

人脐血T、B淋巴细胞和NK细胞的免疫学表达特性

目的 探讨人脐血T、B淋巴细胞和NK细胞，以及T／NK细胞杀伤性抑制性受体（KIR）表达的免疫学特性及其意义。方法 应用流式细胞仪检测26例正常新生儿脐血的T、B淋巴细胞和NK细胞抗原标记，包括CD45RA、CD45RO、CD69、CD25、CD40L、CD40、CD10、CD20和CD16等抗原的表达，以及脐血T／NK细胞上KIR分子（CD158a和CD158b抗原）的表达，并与正常儿童外周血比较。结果 脐血T淋巴细胞中CD45RA^ 细胞表达高于外周血（P＜0．01），CD45RO^ 则明显低于外周血（P＜0．01）；脐血T细胞CD69表达极低；CD25在CD8^ 细胞亚群中几乎不表达；CD40L在脐血T细胞中表达低于外周血（P＜0．05）。脐血B淋巴细胞中不成熟亚群CD10^ ／CD19^ 比例增高，成熟B细胞表型CD19、CD20、CD40等抗原均明显高于正常外周血（P＜0．01）。脐血中T淋巴细胞和NK细胞均存在KIR分子表达；脐血和外周血中T淋巴细胞CD158分子表达低于NK细胞（P＜0．01），脐血T淋巴细胞亚群中CD158分子表达低于正常外周血；CD158几乎不表达于CD4^ T细胞，主要表达于CD8^ T细胞，且以CD158a^ 为主；脐血中NK细胞CD158分子表达高于T淋巴细胞（P＜0．05），但明显低于外周血NK细胞KIR的表达（P＜0．01）。结论 脐血T淋巴细胞包括原始和早期T细胞以及T细胞受体表达障碍，导致脐血T淋巴细胞免疫功能不成熟，可能是脐血移植（UCBT）后移植物抗宿主病（GVHD）发生率低和程度轻的重要原因之一。脐血B淋巴细胞免疫应答障碍可能缘于T淋巴细胞表型或功能的障碍。脐血T／NK细胞KIR的表达特性提示，KIR可能与UCBT中GVHD和移植物抗白血病（GVL）效应有关。     

酶消化法分离脐带干细胞

目的 研究酶消化法从脐带组织中分离干细胞的可能性,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源.方法 采用胶原酶胰酶消化新鲜脐带组织,将获得的细胞传代培养,观察基本生物学特性,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,以不同方法将其向骨、脂肪和心肌细胞方向诱导,分别采用Von Kossa、油红O染色和免疫组织化学染色对分化的细胞进行鉴定.结果 新鲜分离的脐带细胞在培养72h后,开始贴壁,传代培养后,细胞逐渐纯化,流式细胞仪分析这些细胞表达CD13、CD29、CIN4、CD90、CD105、CD166和MHC-Ⅰ,而不表达CD31、CD34、CD45、CD106和MHC-Ⅱ.在成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性.在5-氮胞苷诱导4周后,免疫组织化学染色心肌特异性抗体肌动蛋白a-actin和肌钙蛋白T阳性.结论 脐带组织中含有丰富的干细胞,酶消化法能够成功分离出脐带干细胞.     

黄芩苷体外诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的探讨中药黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可行性及其可能的机制。方法采集健康孕妇足月顺产儿的脐带血,共5人份,以肝素抗凝,采用明胶沉降加密度梯度离心两步法分离脐血单个核细胞,加入含黄芩苷50μmol/L的液体培养体系中进行扩增培养。取黄芩苷体外扩增2周的人脐血MSCs,采用黄芩苷诱导24h后,继续维持诱导6d,诱导30min后开始在倒置显微镜下动态观察脐血MSCs生长情况及诱导前后形态学变化。免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶(NSE),微管相关蛋白2(MAP-2)阳性细胞的表达。诱导液(DMEM培养基,200~400μmol/L黄芩苷),37℃,5%CO2诱导24h。维持诱导液(DMEM培养基,200~400μmol/L黄芩苷,B27)继续维持诱导1周。实验共分4组,分别为诱导组;对照1组(诱导液和维持液均不含黄芩苷)、对照2组(诱导液和维持液含3mmol/L的β-巯基乙醇,不含黄芩苷)、对照3组(诱导液和维持液含20g/L二甲基亚砜和20mmol/L丁化羟基苯甲醚,不含黄芩苷)、对照4组(诱导液和维持液均含有上述浓度的黄芩苷、β-巯基乙醇、二甲基亚砜和丁化羟基苯甲醚),各组分别在诱导6h、24h、7d留取标本,制作细胞爬片,细胞固定后,免疫细胞化学染色评价NSE和MAP-2阳性细胞的表达率;Hoechest33258染色,评价细胞存活率。结果诱导组诱导6h后,细胞微丝收缩,原来梭形的脐血MSCs胞体已发生收缩,细胞边缘变得不规整,出现了细的突起。7d后多数细胞成锥形,交织成网,形成较典型的神经元细胞样形态结构,免疫细胞化学染色显示黄芩苷诱导组NSE、MAP-2阳性细胞表达率以及细胞存活率分别为(76.3±9.2)%、(78.5±5.5)%、(85.3±4.8)%,显著高于对照1、2、3组(P<0.01),分别为(4.6±0.6)%、(0.7±0.6)%、(46.7±9.2)%;(63.3±6.8)%、(40.9±5.1)%、(66.5±5.2)%和(71.6±4.7)%、(42.3±4.5)%、(72.8±7.6)%。此外,各组胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达率均低于1%。结论低浓度的黄芩苷体外扩增2周后的MSCs中已有少量表达NSE的阳性细胞出现,这在一定程度上黄芩苷起到了预诱导分化作用;黄芩苷能够体外诱导脐血MSCs分化为神经元样细胞,诱导过程中黄芩苷的诱导作用温和、稳定而持久;诱导出的神经元样细胞成活时间长,其诱导机制可能与黄芩苷的抗氧化、调控细胞NF-κB的活性从而刺激多种细胞因子的表达和生成有关。     

The regulatory function of umbilical cord blood CD4+ CD25+ T cells stimulated with anti-CD3/anti-CD28 and exogenous interleukin (IL)-2 or IL-15

The abundance of CD4⁺ CD25⁺ regulatory T cells in umbilical cord blood (UCB) might contribute to the decreased severity of graft-vs.-host disease (GVHD) for UCB transplantation. This study aims to characterize the phenotypes and suppressive function of UCB CD4⁺ CD25⁺ T cells under the influence of anti-CD3/anti-CD28 (CD3/CD28) and exogenous interleukin (IL)-2 or IL-15. Higher percentages of CD4⁺ CD25^high and FoxP3⁺ cells were detected in UCB compared to their adult counterparts. IL-15 was as effective as IL-2 in enhancing the proliferation of CD3/CD28 stimulated UCB CD4⁺ CD25⁺ T cells. Phenotypically, IL-2/IL-15-stimulated UCB CD4⁺ CD25⁺ T cells expressed higher level of CTLA-4, GITR, membrane bound transforming growth factor-β (mTGF-β), and especially Foxp-3 than controls. IL-2/IL-15-stimulated UCB CD4⁺ CD25⁺ T cells also produced much higher IL-10 and TGF-β than controls; while IL-2/IL-15-stimulated UCB CD4⁺ CD25⁻ T cells showed increased TGF-β, but not IL-10 production. IL-2/IL-15-cultured UCB CD4⁺ CD25⁺ T cells showed comparable suppressor activity on allogeneic adult CD4⁺ T-cell proliferation compared to controls, partly through a contact-dependent fashion. Taken together, IL-2/IL-15-stimulated UCB CD4⁺ CD25⁺ T cells show distinct regulatory T-cell phenotypic and functional features, and may be applied for the alleviation of GVHD severity following UCB transplantation.