辐射敏感性启动子调控CD基因表达联合125I照射对膀肤癌EJ细胞的杀伤作用

以脂质体介导的辐射敏感性基因联合胞嘧啶脱氨酶(cytosine deantinase,CD)基因转染膀胱癌EJ细胞,研究放射性核素125 I照射后5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对转染膀胧癌EJ细胞的杀伤作用.人工合成辐射敏感性启动子E8,将启动子克隆至质粒pCD2的CD基因上游,构建以E8为启动子、CD基因为目的基因的新质粒,并采用DNA测序法测定E8和CD基因的序列;脂质体Lipofectamine2000介导pE8-CD转染膀胧癌EJ细胞,用[3]I照射(吸收剂量为2舜)后,蛋白质免疫印迹分析(Western blot)测定CD蛋白表达;在转染EJ细胞中分别加人不同剂量125 I勺和5-FC,四哇盐比色法(MTT法)测定各组细胞存活率,并以未经125 I勺照射组、未加5-FC组和5-氟尿啼吮(5-FU)组(阳性对照组)进行对照.DNA测序显示构建的pE8-CD质粒含E8启动子及CD基因序列;Westem blot可检测到CD基因表达;125 I加5-FC组细胞存活率明显低于未经125 I照射组及未加5-FC组,与5-FU组相近.这表明放射性核素与基因治疗联合对肿瘤细胞具有协同杀伤作用.     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合黄连素对直肠癌细胞的杀伤作用

目的:探讨黄连素联合腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因(Ad-CD)对直肠癌细胞的体外杀伤作用.方法:用重组腺病毒介导外源CD基因转染到人直肠癌细胞株HR-8348,检测病毒的转导效率和CD基因表达.用四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测黄连素联合Ad-CD基因对HR-8348细胞存活率及体外旁观者效应的影响.结果:在250μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)浓度下,0 1、 0 3、 3 0、 30 0μmol/L浓度的黄连素联合5-FC对直肠癌细胞生长抑制率分别为27 7%、 42 4%、 52 3%、 56 3%.3 0μmol/L浓度的黄连素可作为参考用药浓度.在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中,黄连素联合CD/5-FC对直肠癌细胞具有更强的抑制作用.结论:黄连素可以增强自杀基因系统对直肠癌细胞的杀伤作用,可作为一种增效剂应用于直肠癌的治疗.     

放射敏感性启动子调控Apoptin基因表达对肺腺癌细胞的杀伤作用研究

目的构建放射敏感性启动子调控的凋亡素(Apoptin)基因的真核表达质粒pE6-Apoptin-EGFP,探讨其在X线调控下对肺腺癌细胞A549的杀伤作用。方法分别以限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ双酶切质粒pE6-p53-EGFP及pApoptin-EGFP,电泳分离,回收目的线性DNA片段,T4连接酶连接,构建重组质粒pE6-Apoptin-EGFP,测序、鉴定。脂质体介导瞬时转染肺腺癌细胞A549,RT-PCR、荧光显微镜等检测照射前后融合蛋白表达,流式细胞仪检测放射诱导前后转染细胞的凋亡变化。结果成功构建重组质粒pE6-Apoptin-EGFP,并在被转染A549细胞中检测到Apoptin基因表达;经放射诱导的pE6-Apoptin-EGFP/A549细胞及对照组pE6-EGFP/A549细胞的凋亡率分别为(32.48±3.56)%和(10.67±2.42)%,未经放射诱导的pE6-Apoptin-EGFP/A549细胞及对照pE6-EGFP/A549细胞的凋亡率分别为(6.33±1.21)%、(4.25±0.87)%;与其它3组相比,放射诱导的pE6-Apoptin-EGFP/A549细胞凋亡率明显增高,具有非常显著统计学差异(P<0.01)。结论放射敏感性启动子调控的Apoptin基因表达可在放射线调控下在A549细胞中有效表达并诱导凋亡,为进一步研究非小细胞肺癌的放射-基因联合治疗奠定了基础。     

靶向调控Claudin-4基因表达介导DNA损伤修复增强膀胱癌细胞化疗敏感性的研究

目的 探究靶向下调紧密连接蛋白4(Claudin-4)基因表达对膀胱癌细胞DNA损伤修复及其化疗敏感性的影响。方法 采用si-Claudin-4及阴性对照(si-NC)转染人膀胱癌细胞系EJ下调Claudin-4的表达,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞Claudin-4的表达,以确定转染效果。不同浓度顺铂（DDP）处理转染后的EJ细胞,CCK-8法检测细胞存活率。将EJ细胞随机分为对照组、si-Claudin-4组、DDP组、DDP+si-Claudin-4组。经转染处理与DDP处理后,CCK-8法检测各组细胞存活率;平板克隆形成实验检测各组细胞克隆形成能力;细胞免疫荧光染色观察各组细胞内γ-H2AX焦点生成情况;单细胞凝胶电泳法检测各组细胞DNA损伤情况;Western blot检测各组细胞内γ-H2AX、Ku70、Ku80以及DNA-PKcs的蛋白表达水平。结果 细胞转染后,si-Claudin-4组细胞内Claudin-4 mRNA和蛋白相对表达量均显著低于对照组和si-NC组（P<0.05）。经不同浓度DDP处理后,si-Claudin-4组EJ细胞存...     

miR-145过表达对宫颈癌细胞辐射敏感性的影响

目的:探讨微小RNA(miR)-145过表达增强宫颈癌细胞放疗敏感性的分子机制。方法:运用Lipofectamine 2000将miR-145-mimic转染4株宫颈癌细胞系He La、Ca Ski、C33A和Si Ha,以NC-mimic为阴性对照,并以real-time PCR检测子宫内膜基质细胞(ESC)和4株宫颈癌细胞中miR-145的表达水平;转染的细胞经电离辐射照射后于不同时点运用MTT法和Annexin V-FITC/PI染色法联合流式细胞术分别测定细胞活力和细胞凋亡率;运用免疫荧光检测组蛋白γH2AX的表达水平;Western blot检测细胞中螺旋酶样转录因子(HLTF)的蛋白表达水平。结果:miR-145在ESC中高表达,而在4株宫颈癌细胞中均呈低表达,转染miR-145-mimic后4株宫项癌细胞中miR-145的表达水平显著高于NC-mimic组细胞(P0.05)。相同条件下,辐照后miR-145过表达的宫颈癌细胞的活力显著低于NC-mimic组细胞,72 h的细胞凋亡率明显增加(P0.05)。免疫荧光观察结果显示miR-145过表达显著促进电离辐射诱导的γH2AX激活;Western blot结果显示,miR-145过表达显著抑制HLTF的表达,与NC-mimic比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:miR-145在正常子宫内膜上皮细胞中高表达,而在宫颈癌细胞系中低表达;miR-145过表达可显著抑制宫颈癌细胞的活力,促进电离辐射诱导的细胞凋亡。miR-145过表达增强宫颈癌细胞的辐射敏感性,其机制可能与下调HLTF表达、抑制DNA损伤修复、促进细胞凋亡有关。     

DNA干扰——无启动子同源基因片段对基因表达调控的作用

同源基因片段是人们最常使用的调控基因表达的手段.除反义RNA、miRNA、siBNA外,另外一种同源基因片段--无启动子基因cDNA片段则鲜为人知,其研究仅限于植物和大鼠.随着RNA干扰技术缺陷的暴露以及人们对多种同源基因依赖性基因沉默的深入了解,进一步弄清无启动子同源基因对细胞特别是人类细胞基因的影响就日显重要了.     

细胞辐射敏感性相关基因的研究进展（文献综述）

在研究电离辐射的生物效应时,相同照射剂量引起生物效应程度不同的现象称为辐射敏感性。DNA损伤修复、细胞周期调控这两方面是细胞辐射敏感性的主要因子。另外,凋亡相关基因、细胞骨架及信号传导等相关基因也与辐射敏感性密切相关。本文就细胞辐射敏感性相关基因的研究进展做一简述。     

全反式维甲酸对人结肠癌LoVo细胞化疗药物敏感性及Survivin基因表达的影响

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对人结肠癌LoVo细胞化疗药物敏感性及Survivin表达的影响,为ATRA的临床应用提供理论依据.方法 应用流式细胞仪检测经不同浓度(10-5、10-6、10-7mol/L)的ATRA作用不同时间(24、48、72 h及第5、9、15天)后结肠癌LoVo细胞的周期变化.将细胞分为AT...     

全反式维甲酸对人结肠癌LoVo细胞化疗药物敏感性及Survivin基因表达的影响

Objective To study the effects of all-trans-retinoic acid (ATRA) on chemotherapeutics sensibility and expression of Survivin in human LoVo colon cancer cell line, and to provide a theoretical basis for clinical application of ATRA.Methods Flow cytometer (FCM) was used to detect the cell cycle of LoVo colon cancer cell line after treated with various dose of ATRA (10-5 mol/L, 10-6 mol/L and 10-7 mol/L)for 24 h, 48 h, 72 h, 5 d, 9 d and 15 d respectively.The cells were divided into ATRA group (10-6 mol/L)and control group (cultured in routine medium RPMI1640).Meanwhile, each group were divided into subgroups respectively treated with 0 g/L, 2 g/L, 4 g/L and 6 g/L 5-fluorouracil(5-FU) , or with 0 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L and 600 mg/L mitomycin (MMC).MTT assay was used to detect the viability of cells so as to analyze the change in chemotherapeutics sensibility.Drug interactions were analyzed according to the interaction effects.Staining with acridine orange (AO) and ethidium bromide (EB) was used to study the apoptosis in control group(RPMI1640) , ATRA group (10-6 mol/L), 5-FU group (4 g/L), MMC group (400 mg/L), ATRA (10-6 mol/L) + 5-FU (4 g/L) group and ATRA (10-6 mol/L) + MMC (400 mg/L) group.The expression of Survivin in the LoVo cell line was investigated by immunofluorescence technique.Results Compared with the control group, the percentage of cell in Go-G1 phase increased after interference with various doses of ATRA for 24 hours, peaked at 48 h, and gradually decreased afterwards, while the percentage of cells in stages S and G2-M decreased, reach the trough at 48 h, and then increased gradually.Effects of 10-6 mol/L ATRA were most significant at all time spots.Compared with control group, 10-6 mol/L ATRA reduced cell survival rate (P＜0.05),and the survival rates in control subgroups treated with various doses of 5-FU were significantly higher than those in ATRA group (all P＜0.05).In MMC-treated control group, cell survival rate with 200 mg/L MMC was lower than that in ATRA group (0.72±0.02 vs 1.03±0.13, P＜0.05) , while treatment with 400 mg/L or 600 mg/L MMC did not result in lower cell survival compared with the ATRA group (0.52±0.05 vs 0.39±0.02, 0.36±0.02 vs 0.36±0.01, all P>0.05).Positive interactions of 10-6 mol/L ATRA with 5-FU (2 g/L, 4 g/L, 6 g/L) or MMC (200 mg/L, 400 mg/L) were found.Under fluorescence microscope, cells in ATRA + 5-FU group and ATRA + MMC group showed significantly small size, pyknosis and chromatin condensation and formation of apoptotic bodies when compared with control group, ATRA group, 5-FU group and MMC group.Expression of Survivin was inhibited after 10-6 mol/L ATRA treatment for 48 h compared with control group (33.33% vs 27.96% , P＜0.05).Conclusion ATRA enhances the chemosensibility of LoVo colon cancer cell line to 5-FU and MMC,and induces cell apoptosis, potentially through inhibition of Survivin gene expression.     

CD100对非小细胞肺癌患者单核细胞杀伤功能的调控作用

目的:分析CD100对非小细胞肺癌(NSCLC)患者单核细胞杀伤功能的影响。方法:入组2018年3—9月份在郑州中心医院就诊的35例NSCLC患者(NSCLC组)和13例健康对照者(对照组)。分离肺癌组外周血单个核细胞(PBMC)和肿瘤部位、非肿瘤部位的支气管肺泡灌洗液(BALF)及对照组PBMC,纯化PBMC和BAL...     

调控FOXM1基因对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的影响

目的探究调控叉头框转录因子M1(FOXM1)基因对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的影响。方法将FOXM1过表达及特异性靶向FOXM1基因的小干扰RNA(FOXM1-siRNA)转染至乳腺癌BT474细胞,将细胞分为上调FOXM1基因组、下调FOXM1基因组和对照组。Western blot检测FOXM1蛋白以及PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。MTT法检测不同浓度赫赛汀药物对BT474细胞增殖能力的影响。Transwell实验检测不同浓度赫赛汀药物对BT474细胞迁移、侵袭能力的影响。结果下调FOXM1基因后,FOXM1蛋白的相对表达量明显减少(P<0.05)。上调FOXM1基因组BT474细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著高于对照组,且随着赫赛汀浓度的增加其增殖率、迁移数量、侵袭数量逐渐增加,上调FOXM1基因可增强BT474细胞对赫赛汀的耐药性,促进增殖、迁移及侵袭。下调FOXM1基因组BT474细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著低于对照组,低浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制程度较弱,高浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制过度,而中浓度的赫赛汀抑制能力介于低、高浓度之间,能够有效抑制BT474细胞增殖、迁移及侵袭,但无抑制过度的表现。不同赫赛汀浓度下下调FOXM1基因组细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著低于上调FOXM1基因组。下调FOXM1基因组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量均低于对照组和上调FOXM1基因组(P<0.05)。结论上调FOXM1基因可增强乳腺癌BT474细胞对赫赛汀的耐药性,下调FOXM1基因在中浓度赫赛汀的干预下,可通过作用于PI3K/AKT信号通路,抑制乳腺癌BT474细胞的增殖、迁移及侵袭,从而抑制乳腺癌的发展。     

表达CD20scFv-IgGFc-CD28-ζ及CD20scFv-IgGFcT淋巴细胞的建立及其对B细胞淋巴瘤靶向杀伤作用的比较

目的:研究CD20scFv嵌合T淋巴细胞靶向杀伤Daudi细胞时杀伤的效果和T细胞活化情况.方法:将两种质粒转染至PA317细胞中,用转染成功的PA317上清液感染外周血T淋巴细胞后经800 mg/L的G418筛选1周后去杀伤Daudi、K562细胞,分别在不同时点用流式细胞仪检测Daudi细胞AnnexinV的阳性率,用ELISA检测细胞因子IL-2、IFNγ.结果:Daudi细胞Annexin V的阳性率在24 h内两实验组与K562组相比明显增高,而实验组之间没有显著差异.72 h时CD20scFv-IgGFc-CD28-ζ组比CD20seFv-IgGFc组IL-2(1 509.00 ng/L比220.54 ng/L)和IFNγ(912.16 ng/L比251.42 ng/L)的分泌量有显著增高.结论:①两种CD20scFv特异的T细胞在引起Daudi细胞早期凋亡无显著差异,说明在CD20scFv的靶向杀伤过程中CD28-ζ基因可能不主导Daudi细胞的早期凋亡.②CD20scFv-IgGFc-CD28-ζ组IL-2、IFNγ增幅更加明显,说明CD3ζ和CD28嵌合的T细胞可以自身活化而不受MHC的限制,从而增强了T细胞的活化和杀伤等功能.