利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾(human embryonic kidney cell,HEK-293)细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

嗜人性猪内源性反转录病毒感染性克隆感染人胚肾细胞HEK293后Stathmin蛋白差异表达分析

目的 分析嗜人性猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retroviruses,PERV)感染的人源细胞中Stathmin蛋白的差异表达情况,探索嗜人性PERV感染人源细胞后可能产生的效应机制.方法 嗜人性PERV感染性克隆感染HEK293细胞,采用PCR、实时定量RT-PCR、免疫荧光分析确认PERV感染,利用实时定量RT-PCR和免疫印迹法分析Stathmin蛋白表达差异.结果 嗜人性PERV感染性克隆成功感染HEK293细胞,实时定量RT-PCR和免疫印迹法检测结果表明,PERV感染后Stathmin蛋白与对照相比表达上调.结论 嗜人性PERV感染HEK293细胞后Stathmin表达上调,该研究结果为深入研究嗜人性PERV与人源细胞的相互作用及PERV感染后的分子效应等提供了线索,也提示了PERV感染后可能会对细胞的生长、生理功能等造成影响,甚至存在潜在的致病性.对探索嗜人性PERV感染人源细胞后可能产生的效应以及猪→人异种移植的病毒安全性评价也具有重要意义.     

稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23细胞系建立及其功能研究

目的:建立稳定表达人巨细胞病毒UL23基因的HELF细胞系,研究病毒蛋白在宿主细胞内行为,为进一步研究人巨细胞病毒蛋白pUL23的功能提供依据。方法:通过PCR技术从人巨细胞病毒基因组中扩增出UL23基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1-FLAG-UL23。将该载体导入Am-phoPackTM-293细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染HELF细胞,HELF经持续G418抗性筛选后获得稳定表达UL23基因的细胞系。采用激光共聚焦显微镜观察病毒蛋白在细胞内的定位。结果:RT-PCR、Western blotting结果证实病毒基因UL23能够整合到宿主细胞基因组中,并能在宿主细胞中稳定表达病毒蛋白。共聚焦显微镜观察到病毒蛋白pUL23定位于细胞质,处于细胞核周边。结论:利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,成功构建了稳定表达UL23基因的转基因细胞系。该病毒蛋白在宿主细胞质中的定位,提示病毒蛋白发挥功能的空间位于细胞核周边,有利地推进了人巨细胞病毒蛋白pUL23功能研究的进程。     

壳聚糖纳米纤维支架对猪肝细胞分泌猪内源性逆转录病毒的影响

探讨壳聚糖纳米纤维支架对肝细胞的PERV分泌量以及其感染性的影响。将新鲜分离的猪肝细胞接种于壳聚糖纳米纤维支架或普通条件下连续培养7 d,分为实验组(Nano组)和对照组(Hep组)。每天收集培养液检测逆转录酶(RT)活性,并通过RT-PCR和实时定量PCR测定PERV RNA水平。通过western blot检测细胞裂解液中PERV gag 30蛋白含量。细胞培养液体外孵育HEK293细胞以测定其感染性。结果表明:实时定量PCR、RT活性以及western blot具有相似的变化趋势。在体外培养10 h和2 d出现PERV分泌高峰然后逐渐下降。除第6 dPERV RNA水平和第5 d蛋白水平实验组明显高于对照组外,其余均无明显差异。体外感染实验无HEK293细胞感染。壳聚糖纳米纤维支架会延长猪肝细胞的PERV分泌时间但对分泌量以及体外感染性并无明显影响,可安全用于生物人工肝。     

沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响

背景：研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的：构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法：采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过...     

小鼠分泌型TIGIT慢病毒载体的构建及其功能研究

本文旨在构建表达小鼠TIGIT胞外段与人IgG-Fc段融合基因TIG-Fc的慢病毒载体,验证TIG-Fc蛋白的功能,为进一步研究其免疫调节作用奠定基础。具体方法是将TIG-Fc融合基因克隆到pLOX载体质粒上,鉴定正确连接的克隆TIG-Fc-pLOX,并与pCMV△R8.2和pMD.G三质粒共转染人胚肾(HEK)293T细胞,收获上清中携带T1G-Fc基因的慢病毒Lenti-TIG-Fc。感染了Lenti-TIG-Fc的293T细胞与内毒素刺激成熟的小鼠树突状细胞(DC)共孵育后,ELISA检测上清中IL-10水平。结果显示成功构建的慢病毒Lenti-TIG-Fc感染293T细胞后,可使其稳定分泌TIG-Fc融合蛋白。融合蛋白可诱导成熟DC分泌IL-10明显增加。     

前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建

为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础,拟构建bimS的重组腺病毒载体。采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS;克隆至T载体测序正确。亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,形成含目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的穿梭载体。穿梭载体pAdtrack-CMV-bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组,获得重组pAdEasy-CMV-bimS,线性化后脂质体法转染人胚肾(HEK)293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察;将病毒以MOI=100感染HEK293细胞,western blot检测bimS蛋白表达。结果显示病毒感染293细胞48~72h观察到GFP表达,7d出现典型细胞病变症状(CPE);提取培养上清中病毒DNA,以PCR法可检测到bimS的扩增产物;western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白,与未感染的阴性对照细胞相比,bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞。表明重组bimS腺病毒构建成功;为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础。     

异种器官移植中PERV病原安全性的研究进展

猪内源性反转录病毒 (porcine endogenous retrovirus,PERV)是指以前病毒 DNA形式整合进宿主细胞基因组中 ,并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒。由于 PERV在体外可以感染人的多种细胞 ,这引起了人们对猪 -人异种移植病原安全性的广泛关注。本文从 PERV的生物学特性、基因组的结构与功能及其病原安全性等几个方面综述了近年来的研究进展     

人巨细胞病毒基因时序表达对感染结局的影响

目的　探讨人巨细胞病毒 (HCMV)主要基因序列表达情况对其感染结局的影响。方法采用不同滴度HCMV感染传代培养的人胚肺成纤维细胞 ,建立HCMV梯度感染细胞模型。分别应用FQ PCR法测定感染细胞内IE基因拷贝数、免疫组化法联合计算机病理图文分析系统检测p5 2蛋白表达水平以及RT PCR法测定MCPmRNA转录水平 ,光镜观察致细胞病变作用 (CPE)、电镜检查细胞超微结构改变。结果　IE基因在病毒滴度最低的A组细胞内负荷量最低 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) ;p5 2蛋白在病毒滴度较高的B、C组表达水平明显高于A组 (P <0 .0 1) ,其表达定位于受染细胞核内 ;仅在B、C组内检测到MCPmRNA。A组未检出细胞病变 ,B、C组细胞检测到随感染时间延长而加重的CPE及超微结构改变。结论　HCMV受染细胞内IE基因负荷量与病毒基因组表达启动密切相关 ,p5 2蛋白高效表达是病毒基因组完整表达的必要条件 ,MCPmRNA转录是活动性HCMV感染的标志。     

展览中器官移植中PERV病原安全性的研究进展

猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus,PERV)是指以前病毒DNA形式整合进宿主细胞基因组中，并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒，由于PERV在体外可以感染人的多种细胞。这引起了人们对猪-人异种移植病原安全性的广泛关注，本文从PERV的生物学特性，基因组的结构与功能及其病原安全性等几个方面综述了近年来的研究进展。     

丙型肝炎病毒阳性血清体外感染人肝细胞的研究

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)抗体(Ab)阴性,HCV-RNA阳性血清建立体外感染肝细胞模型.方法 HCV Ab阴性,HCV-RNA阳性的窗口期血清与人肝细胞共同培养,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫荧光染色、Western blot、共聚焦显微镜和透射电镜等方法检测细胞内HCV核酸复制、蛋白质表达及超微结构改变.结果 细胞与病毒共同培养7～45 d,细胞内和/或培养上清中可间断检出HCV正、负链RNA;细胞浆内有HCV 核心和NS3抗原的表达;细胞超微结构有改变,并于感染后第24天时观察到类似病毒样颗粒.结论 窗口期血清中的HCV能在人肝细胞7701中复制一段时间.     

Generation of recombinant Norovirus-like particles (VLP) in the human endothelial kidney cell line 293T

Summary. Noroviruses (NVs) are the major cause of non-bacterial outbreaks of gastroenteritis. Here we report a new alternative system to generate recombinant NV virus-like particles (rNV-VLP) in a human endothelial kidney cell line (HEK). Transfecting HEK-293T cells with an expression vector coding for the ORF-2 gene lead to the expression of the viral structural protein VP1 which spontaneously assembled into virus-like particles (VLP), as shown by electron microscopy. The transfected cells did not show a cytopathic effect and released rNV-VLP into the culture medium. The HEK-293T cell derived particles were morphologically indistinguishable to the rNV-VLP produced from baculovirus and the Venezuelan equine encephalitis virus (VEE)-replicon. The produced particles were stable for at least 2.5 months at 4 °C.     

野生型和突变型GDF5蛋白表达及亚细胞定位的研究

目的研究人生长分化因子5基因(GDF5)c.1118T>G(p.L373R)突变对GDF5蛋白在HEK-293细胞系表达及其亚细胞定位的影响。方法构建pDsRed1-N1-GDF5-WT和pDsRed1-N1-GDF5-L373R载体,分别转染HEK-293细胞,细胞培养72h后通过荧光显微镜观察比较野生型和突变型GDF5蛋白荧光分布情况。结果 GDF5蛋白在HEK-293细胞中成功表达,在荧光显微镜下观察到转染野生型和突变型GDF5的细胞胞浆均匀发出红色荧光,而空载体组的红色荧光则弥散于全细胞,荧光强度均匀一致。结论野生型和突变型GDF5蛋白均定位于HEK-293细胞质。     

白细胞介素-6诱导相关新基因LX3的细胞定位研究

目的 研究IL-6诱导相关新基因KX3在真核细胞内的表达定位。方法构建真核融合表达载体pEGFP-N1／LX3,运用Lipofectin转染293T和NIH3T3细胞。共聚焦荧光显微镜检测GFP荧光,以确定IL-6诱导相关新基因KX3在细胞内的表达定位情况。结果获得真核表达载体pEGFP-N1／LX3,并成功转染293T和NIH3T3细胞,共聚焦荧光显微镜观察了KX3-GFP在细胞内的荧光分布。结论IL-6诱导相关新基因在细胞内为全细胞分布。     

Chlamydia pneumoniae infection in human monocytes

Chlamydia pneumoniae infection has been associated with cardiovascular diseases in seroepidemiological studies and by demonstration of the pathogen in atherosclerotic lesions. It has the capacity to infect several cell types, including monocyte-derived macrophages, which play an essential role in the development of atherosclerosis. However, the persistence of C. pneumoniae in mononuclear cells is poorly understood. To study the morphology and biological characteristics of the infection, human peripheral blood monocytes were infected with C. pneumoniae. Freshly isolated monocytes resisted the development of infectious progeny, and confocal and transmission electron microscopy showed that the morphology of the inclusions and chlamydial particles was abnormal. Addition of tryptophan or antibodies against gamma interferon did not diminish the inhibition of C. pneumoniae, suggesting that other factors are involved in the chlamydiostatic activity of the monocytes. Chlamydial mRNA was expressed at least 3 days after infection, however, and a capability for infected monocytes to induce a positive lymphocyte proliferative response was detected for up to 7 days, indicating that C. pneumoniae remains metabolically active in the monocytes in vitro. These results are in accordance with the hypothesis that C. pneumoniae may participate in the maintenance of local immunological response and inflammation via infected monocytes and thus enhance atherosclerosis.     

人重组腺病毒rAd-IL-23R的构建与功能鉴定

目的构建表达白介素23受体的人重组腺病毒(rAd-IL-23R),并探究该病毒对人子宫颈癌(HeLa)细胞系增殖的影响。方法采用AdEasyTM系统,将带有IL-23R的穿梭载体与腺病毒骨架载体进行同源重组,构建pAd-IL-23R,酶切消化鉴定,线性化的病毒质粒在HEK-293A细胞中进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。CCK-8法检测rAd-IL-23R对HeLa细胞增殖的影响,流式细胞计量术分析和Western blot检测rAd-IL-23R对HeLa细胞凋亡的影响。结果pAd-IL-23R经PacⅠ酶切消化为约30 kb和3 kb的核酸片段,可诱导HEK-293A细胞产生细胞病变,并成功表达IL-23R蛋白;用不同滴度的rAd-IL-23R(0、1和2 MOI)感染HeLa细胞后,rAd-IL-23R对细胞增殖的抑制具有明显的剂量效应(P<0.05),随着MOI增加,细胞凋亡率显著增加(P<0.05),同时cleaved-caspase 3的蛋白表达水平增高。结论成功构建rAd-IL-23R,该重组腺病毒可抑制HeLa细胞增殖并促进凋亡发生。