间期双色双融合荧光原位杂交监测慢性髓系白血病异基因造血干细胞移植后bcr/abl融合基因

本研究探讨bcr/abl双色双融合荧光原位杂交（DD-FISH）的敏感性及临床应用价值.对19例慢性髓细胞白血病（CML）异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后微小残留病灶（MRD）用DD-FISH进行监测,同时与常规细胞遗传学（CC）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）结果相比较.样本取自骨髓,少数来源于骨髓片或外周血.结果表明：14例CML患者在Allo-HSCT后CC显示持续正常供者核型,RT-PCR转为阴性,移植2月后均为完全供者嵌合（DC）,DD-FISH检测结果持续为阴性,平均随访11.25月,MRD无增加.1例CC及RT-PCR阴性,而性染色体FISH为混合嵌合,DD-FISH阳性,监测无MRD增加,临床未治疗,疾病稳定.3例骨髓复发患者的DD-FISH及性染色体FISH均提示MRD明显增加,RT-PCR转为阳性,却只有1例CC异常,供者淋巴细胞输注（DLI）及甲磺酸伊马替尼治疗后均为DC,DD-FISH阴性,RT-PCR阴性.1例骨活检证实髓外复发患者骨髓或外周血样本的DD-FISH、CC及PCR均阴性,供受者完全嵌合.结论：间期双色双融合FISH可应用于CML异基因造血干细胞移植后MRD的监测,其操作简易快速,灵敏度高,且骨髓或外周血均可采用.动态监测能及时发现扩大的白血病细胞克隆.     

实时定量RT-PCR监测慢性粒细胞白血病患者造血干细胞移植后bcr-abl mRNA水平

目的评价实时定量RT—PCR（Q—PCR）技术用于监测慢性粒细胞白血病（CML）患者异基因造血干细胞移植（HSCT）疗效的意义。方法采用基于TaqMan探针的Q—PCR技术检测112例CML患者HSCT后不同时间共316份骨髓标本bcr—abl mRNA的表达。bcr—abl mRNA水平以内参基因abl进行归一化。采用荧光原位杂交法（FISH）评估HSCT后是否达细胞遗传学完全缓解（CCyR）。结果Q-PCR实验可重复敏感度为5个拷贝。abl及bcr—abl基因CT值的批内差及批问差均〈2．0％。HSCT后1个月开始持续处于CCyR状态的101例患者，中位跟踪时问为12（6—60）个月的289份标本表现为HSCT后各时间段均有一定数量患者可检测出bcr-abl mRNA，总体上随着HSCT时间延长，中位水平逐渐降低。HSCT后1个月中位bcr—abl水平为0．035％（0～0．406％），较本室资料初治CML慢性期患者中位水平降低3个对数级，3个月时为0．006％（0～0．683％），6个月开始降至0％（0—0．225％），移植6个月后标本最高bcr—abl水平为0．068％。8例患者HSCT后未达CCyR或遗传学复发时bcr—abl水平为0．12％～13．45％，其中5例患者遗传学复发前的1份标本（复发前1—2个月）bcr—abl水平为0．09％-3．42％。9例持续CCyR患者bcr-abl水平曾经〉0．090％，但随后均下降至0。2例急变期患者HSCT后1．6和3个月内持续CCyR，但分别于1个月和1．5个月后进展为血液学复发，ber—abl水平亦从0及0．140％分别急剧增至46．900％和75．900％。结论Q—PCR技术精确、可靠，对CML患者HSCT后有必要定期系列监测ber—abl水平，以及时了解病情变化。对急变期患者需要更密切的监测。     

慢性髓性白血病异基因造血干细胞移植后M-bcr/abl及m-bcr/abl融合转录子追踪观察

为研究慢性髓性白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (SCT)后M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子表达特征 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术测定 72例CML患者SCT后不同时间骨髓M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子的表达。结果显示 ,CML患者移植后 <6个月M bcr/abl阳性率 (79.2 % ,4 2 /5 3)显著高于 6 - 12个月(34.3% ,11/32 )及≥ 12个月 (35 .1% ,13/37) (P <0 .0 0 1) ,各时间段M bcr/abl阳性患者的临床复发率分别为1 9% (1/5 3) ,0 (0 /32 )及 16 .2 % (6 /37) ;6例临床复发患者中有 5例复发时M bcr/abl与m bcr/abl同时阳性。 14例遗传学缓解患者移植 6个月后M bcr/abl阳性的 17份标本无 1例m bcr/abl阳性。结论 :多数CML患者移植后M bcr/abl仍为阳性 ,一般在 6个月内转阴 ,移植后M bcr/abl阳性的患者不一定复发 ,同时追踪观察M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子可能会有助于监测残存白血病。     

异基因造血干细胞移植后慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因水平的动态变化

背景:bcr-abl融合基因不仅是慢性粒细胞白血病的诊断标准,其水平的变化也是判断病情或疗效的惟一指标,尤其是bcr-abl融合基因的动态变化对于异基因造血干细胞移植效果的评估和预后判断可能更为重要.目的:了解慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后bcr-abl融合基因水平的变化情况. 设计:回顾性病例分析.对象:2001-04/2007-01在广东省人民医院血液科收治的确诊1年内行异基因造血干细胞移植的慢性粒细胞白血病患者22例,中位年龄31.5岁,患者对治疗均签署知情同意书,治疗方案经医院医学伦理委员会批准.方法:所有同胞供者均采用粒细胞集落刺激因子行外周血干细胞动员.所有患者均采用改良BU/CY联合FLU预处理方案,供受者血型不相合者于移植前7 d、1 d行血浆置换以降低血型抗体滴度.患者经深静脉输入同胞供者平均单个核细胞数为5.48×108/kg,平均CD34 细胞数为10.45×106/kg.由于移植和随访时间不同,每例患者收集标本3～14份,共130份外周血标本.主要观察指标:通过实时荧光定量PCR法检测22例患者异基因造血干细胞移植后不同时间130份外周血标本中bcr-abl融合基因的水平.结果:移植后6个月内,bcr-abl融合基因总体水平逐渐降低,移植后1、3、6个月bcr-abl阴性患者的比例分别为33.33%、53.33%和84.62%,bcr-abl高水平阳性(bcr-abl/abl ≥ 0.02%)患者的比例分别为58.33%、33.33%和15.38%,低水平阳性(bcr-abl/abl < 0.02%)患者的比例分别为8.33%、13.33%和0.移植6个月后,多数患者连续多次检测不到bcr-abl融合基因,其中持续阴性者9例(69.23%),低水平波动者1例(7.69%),低水平持续阳性者1例(7.69%),复发2例(15.38%);复发的2例患者移植后6个月内连续检测bcr-abl融合基因水平均未降低至0,且3次检测结果中2次属于高水平阳性.结论:异基因造血干细胞移植后,慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因总体水平逐渐下降,但不同患者bcr-abl变化情况各异,通过实时定量PCR检测可明确其变化趋势.     

慢性髓性白血病bcr／abl融合基因的克隆与表达

目的：克隆bcr／abl融合基因融合位点基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株总RNA作为模板,采用RT—PCR方法扩增包含Bcr／abl（b3a2）融合位点基因片段。将RT—PCR物按正确的阅读框架,定向克隆到pEGFP—N3的下游,将重组质粒转化大肠杆JM109大肠杆菌,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果：扩增出470bp的Bcr／abl融合位点基因片段,构建重组质粒pEGFP—bcr／abl,酶切产物的大小分别与预期相符。结论：成功地扩增bcr／abl融合位点基因片段及构建真核表达重组质粒pEGFP—bcr／abl,为在体外表达重组bcr／abl蛋白奠定基础。     

慢性髓系白血病不同bcr/abl融合基因转录子与临床关系的研究

目的研究慢性髓系白血病(CML)bcr/abl融合基因转录子类型与临床的关系.方法采用RT-PCR技术检测537例临床怀疑CML的患者新鲜骨髓标本三种bcr/abl(M、m及μ型)融合基因的表达.结果 479例CML患者 M-bcr/abl阳性,其中慢性期(CP)370例,加速/急变期(AP/BC)109例,CP期和AP/BC期患者表达b2a2型融合基因转录子的百分率分别为32.4%(370例中120例)及36.7%(109例中40例)(P>0.05),急淋变及急髓变患者b2a2型百分率分别为52.6%(19例中10例)及33.3%(90例中30例) (P>0.05);b3a2型患者初诊时外周血血小板数明显高于b2a2型患者[(485.9±333.8)×109/L] vs [(380.5±321.9)ⅹ109/L](P<0.05);66.0%CP及64.4%AP/BC患者同时表达M-bcr/abl及m-bcr/abl;1例单纯m-bcr/abl(+)患者表现为急性髓系白血病(AML);2例μ-bcr/abl(+)患者均具有典型CML表现.结论典型CML患者几乎均为M-bcr/abl融合基因阳性,大部分患者同时伴有m-bcr/abl表达,个别CML患者可以为μ型;除了急性淋巴细胞白血病(ALL)外,单纯m-bcr/abl(+)也可见于AML或CML急粒变的患者; b3a2型患者初诊时更易有血小板数增高表现.     

bcr/abl融合基因和慢性粒细胞白血病

bcr/abl融合基因酪氨酸激酶活性异常在慢性粒细胞白血病发病分子机制中起重要作用,其表达物bcr/abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病分型的重要依据,检测此基因对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗和病情观察具有重要临床意义.     

异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察

本研究利用STR—PCR结合RT—PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后患者嵌合体和融合基因的表达，分析其植入和微小残留病变情况，评价其对复发的预测价值。采用STR—PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率，采用RT—PCR方法检测融合基因转录本bcr／abl mRNA。结果表明：4例患者在移植后28天均为100％供者型嵌合，融合基因bcr／abl mRNA均为阴性。但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0％-80．4％），融合基因bcr／abl mRNA阳性；其中2例复发后一直处于混合嵌合状态，另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态，目前处于分子生物学缓解状态。上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率（DC）下降；融合基因表达阳性。结论：STR—PCR在敏感范围内，其结果与RT—PCR的结果符合率高，两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段，对判断疾病复发及GVHD均有预警作用，对实施临床干预治疗有重要指导价值。     

联合应用FISH和巢式RT-PCR技术检测慢性髓系白血病bcr/abl融合基因

目的 检测慢性髓系白血病(CML)bcr／abl融合基因，协助临床诊断。方法 联合应用荧光原位杂交(FISH)、Northem杂交和巢式RT—PCR技术。结果 在16例被检测的CML患中，有3例两种方法的结果不一致，经Northem杂交验证发现，RT—PCR较FISH更敏感，但存在假阳性；另外，FISH较容易检测到bcr／abl融合的少见类型，而巢式RT—PCR需要同时设计多对特殊引物，否则极易漏诊。结论 联合应用FISH和巢式RT—PCR技术检测CML bcr／abl融合基因可以优势互补，使结果更加准确、可靠，更适合于临床诊断、疗效判定以及对微量残留病的监测。     

慢性髓细胞白血病患者染色体分析及bcr/abl融合基因转录本定量的临床意义

目的探讨慢性髓细胞白血病(CML)患者染色体分析与bcr／abl融合基因定量的临床应用价值。方法17例CML患者采用骨髓细胞短期培养法制备染色体,应用G、R显带技术进行染色体分析,同时采用实时定量RT-PCR技术进行bcr／abl融合基因定量检测,并对其中的9例患者进行了跟踪观察。结果全部患者均检出Ph染色体及表达bcr／abl融合基因,阳性患者之间19cr／abl表达水平差异很大。常规药物治疗后稳定于慢性期的4例患者,bcr／bal表达水平轻度上升或下降,未发现新的染色体异常;进入急变期的3例患者bcr／abl表达平均上升了9．06倍,均出现新的附加染色体异常;2例异基因骨髓移植的患者bcr／abl表达水平随临床治疗而发生变化;bcr／abl变化趋势相同而细胞遗传学结果不同的患者,对药物治疗的反应不同,预后也不一样。结论染色体分析结合bcr／abl基因定量较为全面地反映了CML患者的生物学特性,与疾病进展密切相关,对CML的诊断、疗效评价、预后判断反映白血病细胞负荷有较大的临床价值。     

不典型慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的RT-PCR研究

应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对30例慢性粒细胞白血病(CML)患者的bcr-abl融合基因进行了检测,并结合临床、血液学、细胞化学和细胞遗传学等指标对4例Ph~-CML进行了分析,其中的1例t(7;22)(q22,q24)易位为国内外首次报道。结果表明,Ph~-/bcr~ CML和具有变异型Ph染色体的CML与Ph~ CML之间有较多相近之处,如白细胞与血小板数较多,N-ALP较低,脾肿大明显,发病年龄较轻,易发生急变;Ph~-/bcr~-CML与Ph~ CML之间差异显著,如发病年龄较高,脾中度肿大,白细胞数多者较少,急变较少见。     

急性淋巴细胞白血病bcr/abl融合基因表达及其与免疫表型的关系

采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了M-bcr/abl和m-bcr/abl两种类型融合基因在48例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的表达,并且绝大多数病例同时进行了免疫表型和DNA倍体的流式细胞术分析。结果表明,25%(12/48)的病例M-bcr/abl或m-bcr/abl融合基因阳性,m-bcr/abl阳性率略高。分析bcr/abl阳性病例的免疫表型,发现大多数病例为B系标志阳性,但部分T系标志阳性的病例也检测出M-bcr/abl或m-bcr/abl,说明bcr/abl阳性ALL病例以B系标志阳性者居多,T系标志阳性的ALL病例也可为bcr/abl阳性。     

筑巢式PCR检测22例慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因结果分析

目的：探讨bcl/abl融合基因在慢性粒细胞白血病（CGL）的诊断、治疗和预后判断的价值。方法：对22例CGL患者作筑巢式逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测bcr/abl融合基因。结果：22例CGL患者中21例bcr/abl融合基因阳性，阳性率为95．5％。结论：筑巢式KPCR是一种快速、敏感而准确的检测方法。     

慢性髓系白血病首发血小板显著增多

本研究探讨以血小板显著增多首发的慢性髓系白血病（CML）临床、细胞遗传学及分子生物学特征。应用骨髓细胞涂片、骨髓活检观察细胞形态学改变;RT-PCR检测bcr／abl融合基因;常规染色体核型分析及FISH检测细胞遗传学变化。结果发现：以血小板显著增多为首发表现的CML是一组具有独特临床和生物学特点的疾病,骨髓细胞涂片和骨髓活检表明,骨髓增生活跃,以巨核系异常增生为主,血小板大片戍堆,可见圆形核小巨核细胞,中等度白细胞增多,经细胞遗传学和分子生物学检测均证实存在有Ph染色体和（或）表达bcr／abl融合基因,对此类患者应该早期进行积极治疗,甚至进行分子生物学水平的干预;而原发性血小板增多症（ET）患者则不宜过多地使用化疗药物,否则反而诱致白血病的发生。结论：对血小板明显增多的患者应及时进行Ph染色体及bcr／abl融合基因表达水平的检测．这对于ET及CML的诊断和鉴别诊断极为重要,以避免误诊、误治。     

bcr/abl mRNA反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病Ph~ 细胞的作用

Ph~ 慢性粒细胞白血病(CML)的bcr/abl融合基因在其发病机制中具有重要作用。为研究bcr/abl反义寡核苷酸对CML细胞的作用,将合成两种18个碱基的bcr/abl硫代反义寡核苷酸与相应CML细胞系(K562细胞)及患者细胞共同孵育。结果发现,bcr/abl反义寡核苷酸可明显抑制K562细胞生长;对CML细胞CFU-GM抑制率为54％—91％,部分病例CFU-GM可有bcr/abl mRNA消失而PCR检测为阴性。上述抑制都是序列特异性的,与剂量呈正相关关系。通过流式细胞仪PI染色分析DNA含量,检测具有凋亡间接特征的亚二倍体细胞数量,发现反义寡核苷酸诱导细胞凋亡是其主要作用机制。本实验为bcr/abl反义寡核苷酸CML基因治疗及体外骨髓净化提供了依据。     

吉西他滨对慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞G-CSFR及bcr/abl mRNA的影响

为了观察吉西他滨对慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)及bcr/ablmRNA的作用,收集CML慢性期、急变期患者的及骨髓象正常的非血液病患者骨髓液,分为吉西他滨组(加入吉西他滨,调整浓度为10μg/ml)和对照组,培养48小时后收集细胞。采用流式细胞术检测各组标本骨髓G-CSFR的表达率;采用RT-PCR技术检测各组标本bcr/abl mRNA的表达。结果表明:吉西他滨组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓G-CSFR的表达率分别为(50.72±8.57)%、(36.32±4.25)%和(59.42±7.62)%。对照组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓粒系G-CSFR的表达率分别为(45.42±6.52)%、(30.58±5.68)%和(58.56±5.54)%。两组CML患者骨髓G-CSFR的表达率分别与骨髓象正常组比较,差异有显著性(p0.05),CML慢性期患者与急变期比较,差异有显著性(p0.05)。吉西他滨组CML患者G-CSFR的表达率与未加药组相应组别比较,差异有显著性(p0.05)。吉西他滨组CML慢性期、急变期患者bcr/abl mRNA表达水平比较,差异无显著性(p0.05)。吉西他滨组与对照组、CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关(p0.05)。结论:在体外培养下,吉西他滨可以提高CML慢性期、急变期患者骨髓G-CSFR的表达率,对bcr/abl mRNA表达的作用不明显,CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关。     

bcr/abl融合转录子阳性的B细胞型急性淋巴细胞白血病免疫表型特点

为探讨B细胞型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中bcr／abl融合转录子阳性白血病细胞的生物学特征，用流式细胞术检测26例bcr／aN阳性及32例bcr／abl阴性B-ALL病例的免疫表型，用PC双法检剩免疫球蛋白重链(IgH)基因重排。结果表明：所有的病例均为CDl9阳性。bcr／abl阳性与bcr／aN阴性B-ALL表面分子有显统计学差学异（P＜0．05)的是CD34(96．2％与65．6％)，CDl0(96．2％与71.8％)及CD38(43．8％与95．4％)。在26例bcr／abl阳性病例中，原始细胞共表达CDl0 ／CDl9 ／CD34 ，CDl0 ／CD34 ／HLA—DR 和CDl0 ／CD34 ／CD38—分别为92．3％(24／26)，73．1％(19／26)和56。2％(9／16)。对bcr／abl阳性组的17例进行了IgH基因重排检剩，10例阳性(58．8％)。14例bcr／abl阴性组中12例(85．7％)阳性。在32例bcr／aN阴性病例中，原始细胞共表达CDl0 ／CDl9 ／CD34 和CDl0 ／CD34 ／HLA—nR 分别为43．8％(14／32)和37.5％(12／32)，无1例表型为CDl0 ／CD34 ／CD38—。结论：bcr／abl阳性B-ALL患CD34和CDl0阳性率较高，而CD38阳性率较低，且IgH基因重排检出率较低，其独特的免疫表型特征是CDl0 ／CD34 ／CD38-。该研究结果提示该类型白血病细胞具有较早期的B系祖细胞免疫表型特点。     

Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的通过Real Time PCR实时监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的表达,探讨其在诊断及预后评价价值。方法采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例慢性粒细胞白血病及其它血液系统疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平。结果骨髓原始、外周血原始与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,初诊慢性粒细胞的bcr/abl融合基因表达水平普遍明显增高,经羟基脲±干扰素治疗后表达明显下降,复发或加速期患者可提前2-4个月左右早期发现,格列卫或移植治疗后,多数bcr/abl融合基因可转阴性。结论 bcr/abl融合基因检测对诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标。     

应用国产ES探针检测慢性髓系白血病的bcr/abl融合及der(9)中间缺失

本研究旨在验证国产LSI bcr/abl ES探针检测慢性髓系白血病(CML)bcr/abl融合基因及衍生9号染色体中间缺失的有效性。应用国产LSI bcr/abl ES探针对97例经骨髓细胞形态学及常规细胞遗传学显带分析确诊的CML患者进行FISH检测,对具有der(9)中间缺失的病例再进行ASS基因探针的FISH检测,并取同期129例染色体核型正常的除外血液肿瘤性疾病及骨髓增殖性疾病患者作为阴性对照。结果显示:97例CML患者中91例染色体核型分析具有经典的t(9;22),6例为变异易位。经FISH检测所有患者均具有bcr/abl融合信号,其中16例具有der(9)中间缺失,占16.5%,在16例der(9)中间缺失的病例中13例具有ASS基因的缺失。129例阴性对照患者均未检测出bcr/abl融合。结论:国产LSI bcr/abl ES探针能有效识别bcr/abl融合及der(9)中间缺失,无假阴性及假阳性结果,ES-FISH检测结果与G显带核型具有很好的一致性。