抗河豚毒素单克隆抗体的制备及其抗毒效应

目的 :为制备高毒性的小分子生物毒素河豚毒素 (TTX)的单克隆抗体 (mAb) ,探讨TTX中毒免疫抗毒的可能性。方法 :以TTX为半抗原 ,与中国鲎血蓝蛋白 (TTH)化学偶联制备人工抗原 (TTX_TTH) ;并以其免疫BALB c小鼠。用杂交瘤技术制备抗TTX的mAb ,用竞争抑制酶免疫分析法测定mAb对TTX结合活性 ,以mAb与检测抗原的结合被抑制 5 0 %时的TTX浓度 (IC50 )表示mAb的结合反应性。对小鼠预防注射抗体 ,测试抗体对抗TTX中毒的效果。结果 :建立了 2株对TTX_BSA阳性反应的mAb(1E4和 3C11) ,均属IgG1 亚类 ;具有TTX结合活性 ,其IC50 值分别为 3.2× 10 _6 mol L和 9.9× 10 _7mol L ;亲和力常数 (Kaff)分别为 3.0× 10 6 L mol和 2 .8× 10 6 L mol。小鼠预防给予mAbs ,可对抗 1×LD的TTX攻毒 ,动物存活率 71% ;抗 1.5×LD时 ,1 3存活 ;抗毒效果好于小鼠抗血清对照。结论 :用新的TTX人工抗原成功地制备了抗TTX的mAb ,具有一定的体内预防抗毒效价。     

河豚毒素抗毒疫苗不同免疫方案的免疫效果比较

以河豚毒素 (TTX)与中国鲎血蓝蛋白 (TTH)的化学偶联物TTX TTH免疫BALB/c小鼠。在免疫总剂量 (4 5 0 μg)相同时 ,比较长(L)、短 (S)不同免疫时间间隔 (分别为 14～2 0天和 7～10天 )对疫苗有效时间的影响 ,以血清抗体质量和抗TTX攻毒效果检验疫苗的效价。结果发现 ,S组比L组的抗体质量升速更快。L和S两组抗毒效价比较 :首次免疫后一年内 ,15次 (15×LD)攻毒 ,平均存活率分别为92 9%和 99 3% (P <0 0 1) ;半数动物存活时间分别为首次免疫后 11 3和 14 6个月。说明TTX的实验疫苗不同免疫方案均有效预防了TTX的攻毒 ,但短间隔比长间隔免疫产生更优的抗体质量 ,具有更高的抗毒时效性     

破伤风毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的 一株抗破伤风毒素鼠源单克隆抗体的制备与鉴定.方法 从实验室前期以破伤风类毒素为抗原筛选得到的6株稳定细胞株中选取4E12进行制备及鉴定,首先将4E12细胞株扩大培养后腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,经Protein G柱和PD10脱盐柱两步纯化鼠源单抗;其次通过SDS-PAGE电泳检测抗体纯度并通过分型试剂盒鉴定抗体轻重链亚型,免疫印迹法鉴定抗体结合区域及表位类型,非竞争ELISA法测定抗体亲和力常数以及小鼠中和实验评价抗体中和活性.结果 获得能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株4E12,其细胞培养上清效价为4×103,抗体轻重链分别为κ型和IgG1型,CDR3序列分别为SQSTHVPPT和ARKGTGTGFNY;4E12腹水抗体效价为3.2×104,抗体经纯化后纯度＞95％,以线性表位与TeNT/Hc结构域特异性结合,两者的亲和力常数为3.6×10-10 mol/L,小鼠中和实验结果显示,4E12抗体可部分中和破伤风毒素.结论 筛选到一株高亲和力的鼠源单抗,为破伤风毒素检测及中和抗体研发奠定了基础.     

α-芋螺毒素GI与破伤风毒素C融合蛋白的制备及其抗血清活性研究

目的 制备α-芋螺毒素GI抗血清,为其中毒救治提供有效手段.方法 构建包含α-芋螺毒素GI、PADRE和破伤风毒素C片段(TTC)融合蛋白的原核表达载体,原核表达GI-PADRE-TFC融合蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗体滴度,并测定其对小鼠的抗毒活性.结果 获得GI-TTC融合蛋白69.5 mg.GI-TTC融合蛋白免疫小鼠第5次免疫后血清对GI、GI-BSA的抗体滴度分别达到1∶102400及1∶204800.100、200 μl融合蛋白抗血清对2.0×LD50的α-芋螺毒素GI中毒小鼠存活率分别为14.3％、25.0％,且小鼠死亡时间显著延长.结论 α-芋螺毒素GI与破伤风毒素C片段的融合蛋白具有较好的免疫原性,其产生的抗血清对α-芋螺毒素GI具有一定中和活性.     

芋螺毒素GI抗血清制备及中和活性研究

目的 测定芋螺毒素GI与牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫小鼠后产生的抗血清是否具有中和GI毒素作用.方法 戊二醛法制备GI-BSA偶联物,免疫小鼠,制备GI小鼠抗血清,应用抗血清的抗体中和实验,验证其对GI的解毒作用.结果 SDS-PAGE蛋白电泳结果显示,GI与BSA成功偶联,GI-BSA在>标志物相对分子质量(120×103)处有两条新蛋白带;GI-BSA(99 μg/只)每隔2周免疫1次,共免疫4次,第4次免疫后第10天抗血清中和滴度效价>1:64 000;混合100及200 μl 小鼠抗血清与≥1 LD50剂量GI,腹腔注射,100 μl 血清可使1×LD50毒素(16.3 μg/kg)组小鼠75%存活,200 μl血清可使25.8 μg/kg毒素组小鼠75%存活.结论 基于GI-BSA半抗原免疫的小鼠抗血清对GI毒素具有明显的解毒作用.     

表达毒素源性大肠杆菌LT－B抗原的重组鼠伤寒沙门菌株免疫原性的研究

探讨了能稳定表达毒素源性大肠杆菌（ＥＴＥＣ）热敏肠毒素Ｂ亚基（ＬＴ－Ｂ）的重组鼠伤寒沙门菌株的安全性、免疫原性及其免疫保护力。用重组菌株活菌肌注免疫家兔，动物体内产生明显的抗鼠伤寒沙门菌抗体和抗ＬＴ－ＢｌｇＧ抗体。口服免疫小鼠，免疫后小鼠血清和肠液中均能测到抗ＬＴ－Ｂ抗体。兔肠结扎实验证明，重组菌株在达的ＬＴ－Ｂ没有ＬＴ的生物毒性。在小鼠安全性试验中，口服１６ｘ１０￣（１０）活菌３０ｄ后，小鼠存活率为１００％。免疫后的家兔肠结扎攻毒试验和小鼠攻毒试验结果表明，免疫后的动物对野生毒性人源ＥＴＥＣ、猪源ＥＴＥＣ、霍乱弧菌和鼠伤寒沙门菌的攻击均有一定的保护力．     

Tim-3抗体的生物学活性及应用研究

目的：制备抗人Tim-3单抗并评价其生物学活性,为干预Tim-3表达失调引发的疾病提供实验基础。方法制备重组人Tim-3蛋白,常规方法免疫BALB/c小鼠,筛选出阳性克隆,并对其识别、中和活性进行体内外验证,探讨其作为免疫干预手段的可行性。结果①获得一株能够分泌具有较好结合活性的抗人Tim-3单克隆抗体细胞株（克隆号L3D）,其分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a;②流式实验结果表明,该抗体能够结合人U937细胞上的Tim-3分子,且与小鼠RAW 264．7细胞上Tim-3有一定的交叉结合活性;③该抗体能够阻断Gal-9分子诱导的人THP1细胞凋亡,具有良好的体外中和活性;④体内注射L3D,显示该抗体能够显著加重脓毒血症模型小鼠病情,提高炎性因子的表达水平,显示出其良好的体内中和活性。结论成功制备一株分泌抗人Tim-3抗体的细胞株,其良好的结合及中和活性为基于Tim-3表达异常相关疾病的干预提供了实验基础。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

口服金剂KG_(881)免疫抑制作用的研究

本文对国产合成口服金剂KG881进行体内外免疫作用的实验研究,结果表明本品抑制正常小鼠、佐剂性关节炎大鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖反应和腹腔巨噬细胞(PMφS)产生IL—1。并发现对正常小鼠体内NK活性无影响,但对体外NK活性呈抑制作用。综合提示本品具有显著的免疫抑制作用,活性与进口药金诺芬基本一致。     

嗜麦芽窄食单胞菌全菌灭活苗在小鼠体内的免疫保护作用

目的：评价嗜麦芽窄食单胞菌全菌灭活苗在小鼠体内的免疫保护性。方法利用甲醛制备嗜麦芽窄食单胞菌全菌灭活苗并免疫小鼠，检测其抗体效价达到要求后，通过体外健康人血调理杀伤实验以及体内攻毒实验评价全菌灭活苗的保护作用。结果在第二次加强免疫后，免疫组血清中特异性IgG滴度显著增加，其抗血清在体外具有明显的调理杀伤能力；在体内的攻毒实验中也具有显著的保护作用。结论灭活的嗜麦芽窄食单胞菌全菌灭活苗可刺激诱导动物产生体液免疫应答，使小鼠产生有效的免疫保护作用，为进一步探讨嗜麦芽窄食单胞菌全菌灭活疫苗奠定了良好的实验基础。     

热休克蛋白65增强小鼠对HBV DNA 疫苗免疫反应的研究

目的:观察热休克蛋白65的真核表达载体(pHSP65)对HBV DNA疫苗诱导BALB/c小鼠(H-2d)免疫应答的调节作用。方法:肌内注射空载体pcDNA3,HBV DNA疫苗加HSP65佐剂(pHBVS2S pHSP65)或不加佐剂(pHBVS2S);ELISA法测定血清抗HBs抗体;ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;4 h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTLs活性。结果:HBV DNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度虽高于不加佐剂组,但无显著性差异;其IgG1/IgG2 a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.395与10。佐剂组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞量是不加佐剂组的2~3倍。CTLs细胞杀伤活性(E∶T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:(53.68±7.5)%、(42.81±7.7)%,差异显著(P<0.05)。结论:HBV DNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTLs反应;HSP65佐剂能够有效提高小鼠对DNA疫苗的细胞免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂。     

抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体的制备及放射免疫分析

异硫氰酸荧光素(FITC)具有很强的免疫原性, 很容易产生与半抗原结合的特异抗体。作者报告了抗FITC MoAbs的制备及应用~(125)I-抗FITC MoAb测定不同抗原和抗体的实验结果。抗FITC MoAbs的制备:①免疫:将FITC-蜗牛血蓝蛋白100μg加福氏完全佐剂腹腔注入BALB/C小鼠,三个月后用等量的无佐剂抗原静脉注射。(2)融合:加强免疫4天后,把免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞×63-Ag8.653一是通过改良的PEG法     

培养小鼠骨髓细胞半同系移植研究的补充材料

用体外培养不同时间的C57BL/6雄性小鼠骨髓细胞移植到受致死剂量γ线照射的DBF_1雌性小鼠,记录受照射小鼠30天和60天的活存率,并分析造血和免疫功能的主要指标.对部分长期活存小鼠(60～110天)的骨髓细胞和淋巴细胞的染色体核型作细致观察,了解移植进去的造血细胞是否已被植入,结果表明移植培养骨髓细胞的受照射小鼠活存率远较照射对照组为高,造血与免疫功能明显地重建,这无疑是由于移植骨髓在照射动物中形成稳定的辐射嵌合体所致.     

融合基因DNA疫苗STxB-VP1和MDC-VP1对CVB3的免疫效果研究

目的构建融合基因DNA疫苗pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1,并免疫小鼠,观察其免疫效果。方法从痢疾志贺菌PCR扩增志贺毒素B亚单位(STxB)基因片段,用RT-PCR法从小鼠脾细胞扩增巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)基因片段。将这两个基因片段分别与柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的衣壳蛋白VP1通过一个编码15肽的柔性接头(Linker)相连接,构建真核表达质粒pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1。120只BALB/c小鼠随机均分为6组,分别在胫骨前肌注射pcDNA3、pcD-NA3/STxB、pcDNA3/MDC、pcDNA3/VP1、pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1,每3周1次,共3次。每次免疫后20d检测血清中中和抗体水平,最后1次免疫后20d用7LD50的CVB3进行致死性攻击,观察小鼠生存率。结果成功构建了融合基因疫苗pcD-NA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1。各组小鼠的生存率分别是10%、10%、15%、40%、20%和75%,中和抗体水平及血中病毒滴度均与生存率一致。结论与pcDNA3/VP1相比,pcDNA3/MDC-VP1可诱导产生高水平的中和抗体,提高小鼠生存率,而pcDNA3/STxB-VP1仅诱导出低水平的中和抗体,小鼠的生存率降低。     

吗啡全抗原的制备及其免疫效果的评价

目的　制备吗啡及琥珀酰吗啡的全抗原 ,评价二种抗原诱导小鼠产生抗体效价的差异及其对吗啡致依赖的戒断症状的影响。方法　采用混合酸酐法制备琥珀酰吗啡 ,将吗啡及琥珀酰吗啡与BlueCarrier(BC)蛋白交联 ,与福氏佐剂等比例混合免疫小鼠 ;用ELISA法检测小鼠血清中抗体滴度 ;竞争性抑制实验检测抗体与吗啡的体外结合能力 ;观察免疫小鼠对吗啡的依赖能力。结果　二种交联物免疫小鼠第 9周血清中平均抗吗啡抗体滴度均超过 1∶80 0 0 ,其中M 6 S BC组效价强度较M BC组高 ,且效价维持时间较久 ;M BC组及M 6 S BC组与吗啡依赖组比较 15min内体重减轻、跳跃次数及潜伏期均有显著性差异 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1)。二组抗体对吗啡的抑制率能达 5 0 %以上。结论　二种载体蛋白交联物都能诱导小鼠产生高滴度的抗吗啡抗体 ,并使免疫小鼠对吗啡的成瘾性降低     

分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体的产生与特性鉴定

以B型肉毒类毒素免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞进行细胞融合。用ELISA方法筛选有杂交细胞生长孔的上清液,其中有66.7％的孔可分泌肉毒毒素特异性抗体。用有限稀释法进行克隆化培养后,获得4株稳定的杂交瘤细胞系(3B10、3B11、3G12和4A5),在体外培养中均持续分泌抗体,培养液抗体效价达10~(-3)～10~(-5);注入BALB/C小鼠腹腔制备出富含抗体的腹水,抗体效价达10~(-6)～10~(-8)。经用A型和B型类毒素作特异性鉴定,表明抗体3G12及4A5与A型无交叉反应,为B型特异性的。抗体3B10及3B11与A型有弱交叉反应。Ig种类鉴定表明抗体3B10及3G12为IgG_1;抗体3B11及4A5为IgG_2。染色体检查证明4株细胞均为杂交瘤细胞。小白鼠体内进行中和保护力测定表明4种单克隆抗体对肉毒毒素均无保护作用。     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

志贺氏菌激发的粘膜免疫与粘膜保护

将家兔分为三组,分别经口服、滴眼或皮下接种活福氏2a 志贺氏菌。用 BA-ELISA 技术测定血、唾液、泪和粪中 IgG、IgM 和 IgA 类特异抗体。结果表明:滴眼组兔血 IgG 抗体迅速上升,口服组兔血以 IgM 抗体增加幅度较大,并出现较早。两组动物的唾液、泪和粪中 IgG 和 IgA 抗体上升幅度大。粪抗体以口服组出现最早。皮下组血 IgM 增加明显,下降迅速。其他体液中,三类抗体都未见增加。各组动物于免疫后约90天,经眼攻击。局部免疫的两组动物呈现有保护作用,皮下组则无。以上结果证实了机体内共同粘膜免疫系统的存在,并提示唾液、泪和粪产生的对志贺氏菌的免疫应答可能反映动物肠道的免疫状态,评价口服疫苗和研究免疫机理。     

痢疾杆菌有毒株及其变异株免疫保护作用的比较

利用小鼠免疫保护模型观察了福氏2a痢疾菌(F_(2a)-12)、宋内氏痢疾菌(48025)及其变异株(F_(2a)-12A、宋R)全膜的免疫保护作用,分析了起免疫保护作用的因子。以不同型痢疾菌的全膜皮下免疫小鼠,用相应有毒菌株攻击,结果表达脂多糖(LPS)抗原和毒力相关蛋白抗原的宋内氏菌48025对小鼠有同型保护作用,保护率为100％;宋R不表达LPS和毒力相关抗原则无保护作用;表达毒力相关蛋白抗原和LPS的F_(2a)-12和不表达毒力相关蛋白抗原但表达LPS的F_(2a)-12A均对小鼠有同型保护作用,保护率达90％～100％。本文对福氏2a痢疾菌,宋内氏痢疾菌及其变异株的主要抗原成分与免疫保护作用的关系进行了讨论。     

炭疽吸附抗原免疫机理研究

通过纯化的小鼠免疫T细胞被动转移保护力试验,新生去胸腺小鼠和用T细胞重建的去胸腺小鼠对炭疽吸附抗原的体液免疫反应,以及细胞免疫反应的体内体外测定等方法,对炭疽吸附抗原的免疫机理进行了研究。结果表明:炭疽吸附抗原诱导免疫中,体液免疫起重要作用,细胞免疫反应较弱,但T细胞有辅助B细胞产生抗体的功能。