ODC反义寡核苷酸对K562细胞生长抑制作用

鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是催化多胺生物合成的限速酶.过去的研究表明多胺在维持肿瘤恶性表型中起着重要作用.用ODC不可逆抑制剂抑制多胺生物合成不仅能抑制肿瘤细胞的增殖而且还诱导细胞分化.近年我们采用反义技术,以ODC反义RNA转染肿瘤细胞,通过对ODC表达的封闭,成功地使其恶性表型得到了逆转.提示抑制肿瘤细胞的多胺合成可能是抗癌的有效途径.本文用ODC反义寡核苷酸控制肿瘤细胞的多胺生物合成,观察了其对K562细胞生长特性的影响,以期为ODC反义寡核苷酸在肿瘤临床的应用提供实验依据.     

Survivin反义寡核苷酸诱导K562/A02细胞凋亡的实验研究

背景与目的:Survivin是最近发现的凋亡抑制基因,与白血病的发生和耐药有关,反义寡核苷酸可抑制survivin表达,诱导凋亡,增加药物的敏感性。本研究探讨survivin反义寡核苷酸对白血病耐药细胞K562/A02生长、凋亡和半胱氨蛋白水解酶3的活性的作用。方法:以脂质体转染survivin反义寡核苷酸,以MTT、RT-PCR、流式细胞术、荧光分光光度计分别检测survivin反义寡核苷酸对K562/A02细胞的生长抑制、survivin mRNA表达、凋亡和半胱氨蛋白水解酶3的活性。结果:survivin反义寡核苷酸对K562/A02细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性,与对照组相比,survivin mRNA表达降低36.2%(P<0.05),半胱氨蛋白水解酶3的活性增加67.6%(P<0.05);K562/A02细胞的凋亡率明显增加(14.48±2.65%vs 2.39±0.47%,P<0.005)。结论:survivin反义寡核苷酸通过抑制survivin表达,上调半胱氨蛋白水解酶3活性而诱导凋亡。     

Livin反义寡核苷酸对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Livin反义寡核苷酸（ASODN）对白血病细胞K562增殖及凋亡的影响。方法设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（MSODN）,脂质体介导转染K562细胞后,采用四甲基偶氮唑盐光吸收法（MTT）检测细胞增殖,AnnexinV—FITC法检测细胞的凋亡,反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测LivinmRNA的表达。结果LivinASODN在终浓度为600nmol／L作用K562细胞48h时,能明显抑制其增殖细胞增殖咖制率（IR）为（52．99±2．67）％],降低LivinmRNA的表达[ODR为（59．75±3．24）％],K562细胞凋亡率显著增加f（36．89±1．08）％]（P〈0．01）,而Lip—MSODN组、Lip对照组与细胞对照组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论LivinASODN可下调Livin基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,并促进K562细胞凋亡。     

端粒酶RNA反义寡核苷酸对白血病细胞K562增殖的影响

目的：探讨人类端粒酶RNA的反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响。方法：采用MTT和试验和平板集落形成实验观察反义寡核苷酸作用后K562细胞的生长情况，采用流式细胞仪分析细胞周期的改变，采用电镜观察细胞超微结构的改变，用PCR－ELISA分析细胞端粒酶活性的改变。结果：端粒酶RNA的反义寡核苷酸作用K562细胞后，细胞超微结构和细胞周期发生明显改变。端粒酶活生到明显抑制，细胞增殖受到明显抑制。结论：靶向于端粒酶RNA的反义寡核苷酸抑制白血病细胞K562的增殖。     

Apolloon反义寡核苷酸对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Apollon反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对白血病细胞K562增殖及凋亡的影响。方法设计合成特异性的Apollon硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（missense oligonucleotide,MSODN）,脂质体介导转染K562细胞后,采用MTT法检测K562细胞增殖,Annexin V-FITC法检测细胞的凋亡。结果Apollon反义寡核苷酸对K562细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性。Apollon ASODN在终浓度为600 nmol/L作用K562细胞时,能明显抑制其增殖,K562细胞凋亡率显著增加（P<0.01）。结论Apollon 反义寡核苷酸可下调Apollon基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,并促进K562细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌耐药细胞COC1/DDP抑制的实验研究

背景与目的: Survivin是近年发现的一种细胞凋亡抑制基因, 它与卵巢癌细胞的生长及耐药性密切相关,本研究探讨经脂质体介导的 survivin反义寡核苷酸 (Lip-ASODN)对人卵巢癌耐药细胞 COC1/DDP生长、凋亡及细胞周期的影响.方法:将脂质体介导的 survivin-ASODN转染 COC1/DDP细胞;细胞动力学检测、 MTT法观察细胞生长情况; RT-PCR检测 survivin mRNA的表达;通过 Western杂交检测 caspase-3蛋白及活性;流式细胞仪分析细胞凋亡率及细胞周期变化.结果:与空脂质体及 SODN组相比,经 survivin-ASODN作用后的 COC1/DDP细胞的生长受到明显抑制, 72 h的细胞生长抑制率可达( 68.3± 6.2)%( P< 0.05). Survivin mRNA的表达明显下降,而 caspase-3的活性增加,并呈时间依赖性. ASODN组细胞周期发生了明显变化,细胞被阻滞于 G0/G1期,占 79.21%, G2/M及 S期分别为 4.92%、 15.87%,均明显下降;细胞凋亡率为 33.18%,明显高于 SODN组及空脂质体组( P< 0.05).结论: Survivin ASODN能抑制人卵巢癌耐药细胞 COC1/DDP生长,降低 survivin mRNA的表达并诱导 COC1/DDP细胞凋亡.     

MicroRNA-17-5p反义寡核苷酸阻滞白血病K562细胞的细胞周期

目的： 以反义寡核苷酸技术研究microRNA-17-5p（miR-17-5p）对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响及其可能的机制。 方法： 脂质体法将miR-17-5p反义寡核苷酸（miR-17-5p antisense oligonucleotide,miR-17-5p-ASO）和对照无义寡核苷酸（control nonsense oligonucleotide,Ctrl-NSO）转染入K562细胞,同时设未转染对照组（Ctrl）。 MTT法检测K562细胞的增殖,TUNEL法检测K562细胞的凋亡,流式细胞术检测K562细胞周期的改变。 结果： MTT检测结果显示,miR-17-5p-ASO组K562细胞增殖活性为Ctrl-NSO组的(61.7±4.7)%,miR-17-5p-ASO转染显著抑制K562细胞的增殖（P<0.05）。TUNEL检测显示,miR-17-5p-ASO转染不影响K562细胞凋亡（P>0.05）;miR-17-5p-ASO组K562细胞G2期细胞比例为(10.8±08)％,显著低于Ctrl-NSO组和Ctrl组的(34.6±0.4)％和(33.9±1.3)％(P<0.05)。 结论： MiR-17-5p反义寡核苷酸可以通过调控细胞周期抑制K562细胞的增殖,有望成为白血病治疗的新手段。     

Bcl-2反义寡核苷酸联合富勒醇对K562细胞凋亡的影响

目的:观察不同浓度的Bcl-2反义寡核苷酸和富勒醇作用后K562细胞的凋亡情况.方法:用0.1、0.2 mg/mL的富勒醇和10μmol/L的Bcl-2反义寡核苷酸以及联合10μmol/L、0.1 mg/mL的Bcl-2反义寡核苷酸和富勒醇分别作用于K562细胞,于作用后12、18和24 h观察K562细胞的凋亡情况.结果:反义寡核苷酸+富勒醇组于作用后12 h细胞增殖受抑最显著.OD值降为0.705±0.003,与空白组OD值1.057±0.007比较,两者差异有统计学意义,P<0.01,且随着时间延长,这种抑制作用有逐渐降低的趋势.反义寡核苷酸+富勒醇组OD值0.705±0.003与反义寡核苷酸组OD值0.704±0.003比较,差异无统计学意义.结论:富勒醇联合Bcl-2反义寡核苷酸在诱导肿瘤细胞凋亡方面无协同作用,富勒醇在自然光照条件下也不能干扰Bcl-2反义寡核苷酸对细胞凋亡的诱导作用.     

Survivin反义寡核苷酸诱导SMMC-7721细胞凋亡及对化疗药物敏感性作用的研究

目的：观察survivin反义寡核苷酸（ASODN）对SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响及其对化疗药物敏感性的作用。方法：设计合成特异性survivin的ASODN，脂质体转染肝细胞癌SMMC-7721细胞，透射电镜观察细胞超微结构变化；RT—PCR法检测survivinmRNA的表达变化；FCM法检测对细胞周期、凋亡及survivin蛋白表达的影响；MTT法测定survivin表达抑制前后细胞对吡柔比星、氟苷、顺铂敏感性的影响。结果：ASODN转染后细胞呈现凋亡的形态学改变，survivin mRNA和蛋白表达减弱（P〈0．05），诱导SMMC-7721细胞凋亡（P〈0．01），细胞周期阻滞于G2／M期（P〈0．05）。ASODN转染组可增加SMMC-7721细胞对吡柔比星、氟苷、顺铂的敏感性（P〈0、01）。结论：Survivin ASODN转染能下调survivin表达，诱导SMMC-7721细胞凋亡，提高对吡柔比星、氟苷、顺铂的敏感性。     

以microRNA-17为靶点的反义核酸对白血病细胞K562的作用

目的 研究以microRNA-17(miR-17)为靶点的反义核酸对人类白血病K562细胞的生长抑制作用.方法 人工合成miR-17的反义核酸,硫代修饰,用Lipofectamine 2000转入K562细胞.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染反义核酸后K562细胞的增殖活性,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡水平,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测反义核酸作用后K562细胞内miR-17的相对表达水平.结果 MTT结果显示,转染反义核酸后的24、48、72 h,K562细胞的增殖活性分别为0.872±0.001、0.710±0.002、0.551±0.001,与随机核酸序列组(随机对照组)(增殖活性分别为1.001±0.002、1.009±0.003、1.211±0.003;t值分别为182.58、269.77、660.40)、空白对照组(增殖活性分别为1.113±0.001、1.114±0.001、1.101±0.001;t值分别为537.98、571.20、1230.51)相比较差异有统计学意义(均P＜0.05);FCM检测结果表明,在转染反义核酸48 h后细胞的凋亡率为(20.14±0.01)％,与随机对照组的(3.54±0.02)％及空白对照组的(1.98±0.01)％比较差异有统计学意义(t分别为2347.6、2568.2,均P＜ 0.01);实时荧光定量PCR结果证实,在反义核酸作用后,K562细胞内miR-17的相对表达水平(0.07)明显下降,与随机组(1.00)、空白组(1.01)相比较差异有统计学意义(t值分别为148.63、147.04,均P＜0.05).结论 以miR-17为靶点的反义核酸可抑制K562细胞的增殖活性,并显著促进细胞的凋亡.     

hTERT基因反义核酸对K562细胞端粒酶活性的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ,ｈＴＥＲＴ）基因的反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ,ＡＳＯＮＤ）对Ｋ５６２细胞端粒酶活性的影响。方法：采用多聚酶链反应－酶联免疫测定（ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ）方法检测人工合成的反义脱氧寡核苷酸处理Ｋ５６２细胞前后端粒酶活性的改变,以逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分     

RNA干扰Apollon基因逆转白血病K562细胞多药耐药

背景与目的：Apollon基因在白血病等多种肿瘤内高表达。本试验通过构建高效干扰Apollon基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,探讨RNA干扰技术能否逆转人髓系白血病K562细胞多药耐药。方法：构建靶向Apollon基因真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-Apollon,应用Lipofectamine^TM2000转染K562细胞,G418稳定筛选。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、细胞免疫荧光法分别检测重组载体稳定转染K562细胞后Apollon mRNA及蛋白的表达情况;四甲基偶氮唑盐(MTT)、流式细胞术检测细胞转染前后对长春新碱(leurocristine,VCR)、足叶乙苷(etoposide,VP16)的敏感性及凋亡率的变化。结果：成功构建了pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体并在K562细胞内稳定表达的细胞克隆,经G418筛选后,重组载体能有效沉默Apollon的表达,Apollon mRNA及蛋白表达水平明显下降。MTT结果显示,基因干扰组细胞对VCR、VP16的敏感性明显增强,其半数抑制浓度(half-inhibitory,IC₅₀)值分别为(0.144±0.018)mg/L、(17.336±3.571)mg/L,明显低于细胞对照组(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明,基因干扰组细胞联合化疗药物后细胞凋亡率显著升高(P<0.05),而转染阴性对照组细胞凋亡率与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体能显著增强VCR和VP16对白血病K562细胞的诱导凋亡作用,提高K562细胞对化疗药物的敏感性,提示RNA干扰Apollon基因表达能一定程度逆转白血病细胞的多药耐药。     

屈洛昔芬与他莫昔芬对K562/A02耐药性影响的比较

目的:比较屈洛昔芬 (droloxifene,DRO)和他莫昔芬 (tamoxifen,TAM)对K562/A02耐 药性的逆转作用。方法:应用 MTT法、RT PCR和免疫细胞化学 染色观察细胞毒活性和MDR1、 GSTpi耐药基因表达变化,采用流 式细胞仪测定细胞内多柔比星 (ADR)浓度。结果:在20、10和5 mmol/L浓度时,DRO和TAM均 显著逆转K562/A02的耐药性, DRO和TAM的逆转倍数相比较 差异无统计学意义。MDR1和 GSTpi的mRNA和蛋白表达在 DRO和TAM处理后第2天开始 降低,第5天出现明显降低。20 mmol/L浓度的DRO和TAM分别 孵育K562/A02,可使其细胞内 ADR积累分别增加2.9和3.0 倍。结论:DRO与TAM类似,有 较强的逆转活性,可明显抑制 MDR1和GSTpi基因的表达及增 加细胞内ADR的积累。     

马钱子碱对白血病K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用

目的：研究马钱子碱（vauqueline）对人白血病K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用。方法：采用噻唑蓝（MTT）法检测马钱子碱的细胞毒作用;采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）分别检测非细胞毒浓度（IC10）的马钱子碱对K562/A02细胞MDR1 （multidrug resistance gene 1）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein,MRP）、拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ,TopoⅡ）、谷胱苷肽-S-转移酶（glutathione s-transferase,GST-π）mRNA及其蛋白表达的影响。结果：非细胞毒浓度（IC10）的马钱子碱作用后,K562/A02细胞中MDR1mRNA及P-gp表达降低（P<0.01）。而MRP、TopoⅡ、GST-π mRNA及其蛋白的表达无明显变化（P>0.05）,同时马钱子碱能增加化疗药物在白血病细胞内的积累。结论：马钱子碱能部分逆转K562/A02细胞的耐药性,其作用机制可能与下调K562/A02细胞MDR1 mRNA的表达,导致细胞膜上P-gp的表达量减少,化疗药物从细胞内溢出减少有关。     

反义寡核苷酸对K562细胞增殖和端粒酶活性的影响

 目的　研究靶向封闭端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASPSODN）对K562细胞目的基因的抑制及其对端粒酶活性及细胞增殖周期和凋亡的影响 。方法　ASPSODN转染到人类红白血病细胞株K562,采用MTT法、酶联免疫吸附（ELISA）法和流式细胞术（FCM）检测K562细胞的增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达。结果　0.6 μmol／L的ASPSODN（0.42±0.16）能明显下调hTERT表达（P＜0.05）,端粒酶相对活性降至52 %;MTT法检测显示明显抑制K562细胞增殖活性;FCM显示细胞凋亡率为10.31 %,PI染色显示细胞被阻止在G1／G0期,S期及G2／M期的细胞减少,但无特征性的凋亡峰。结论　ASPSODN靶向 hTERT 能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调端粒酶活性,抑制K562细胞增殖,并通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞凋亡。     

NF-H基因参与K562/A02细胞多药耐药机制形成的研究

目的 分析K562／A02细胞多药耐药性(MDR)分子机制,寻找可能参与K562／A02细胞耐药机制的新基因。方法 通过长期逐步增加K562细胞培养液中阿霉素(ADM)的浓度,诱导出多药耐药细胞株K562／A02,利用cDNA microarray比较K562和K562／A02基因表达的筹别,从中选择NF-H基因进行RT-PCR和免疫细胞化学验证,并利用反义核酸技术和细胞内ADM浓度的测定,进一步验证该基因与K562／A02细胞多药耐药的关系。结果 通过比较发现,有12个基因可能参与了K562／A02细胞的耐药机制,其中7个基因在K562／A02中被下调,5个基因被上调。本研究结果显示,NF-H基因在K562／A02细胞中高表达,并且,将NF-H和mdrl反义核酸同时转入K562／A02细胞后,可明显提高细胞内ADM浓度,而单独转入NF-H反义核酸效果不明显。结论 K562／A02细胞耐药表型的形成是多因素的．除了P-糖蛋白(P-gp)等常见因素外,可能还有NF-H基因的参与。     

人慢性粒细胞白血病bcr-abl基因反义寡核苷酸对K562细胞株的凋亡诱导作用研究

背景与目的：随着人类基因组计划的完成,人们的研究重点已转向基因功能的研究,反义核酸技术无疑为这项宏伟工程提供了一个新的发展方向。目前,国内关于反义寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的实验研究很少。本实验在体外构建针对人慢性粒细胞白血病(chronic myelogenou leukemia,CML)bcr-abl融合基因mRNA的反义寡核苷酸,探讨bcr-abl反义寡核苷酸对K562细胞凋亡的诱导作用。方法：以bcr-abl融合基因mRNA翻译起始点融合前区19个寡核苷酸为作用靶点,设计反义寡核苷酸,以其反义寡核苷酸序列转染人慢性粒细胞K562细胞,采用Hoechst染色法观察不同浓度寡核苷酸对K562细胞株的凋亡情况,采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测自噬凋亡蛋白LC3-Ⅱ的表达情况,采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期变化,采用JEM-4000EX电镜术检测细胞凋亡形态变化,通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测K562细胞凋亡情况。结果：Hoechst染色结果显示,bcr-abl反义寡核苷酸能显著促进K562细胞的凋亡,且呈现一定的浓度依赖性。Westernblot检测结果显示,bcr-abl反义寡核苷酸各浓度组凋亡自噬蛋白LC3-Ⅱ表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,bcr-abl反义寡核苷酸作用于K562细胞后,细胞周期阻滞于G₀/G₁期。各组G₀/G₁期、S期细胞数量与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。在JEM-4000EX电镜下可见明显的新月型凋亡小体。DNA琼脂糖凝胶电泳显示,10、30 μmol/mL bcr-abl反义寡核苷酸组可以明显观察到以180~200 bp碱基对整倍数出现明暗间隔的DNA梯状条带。结论：Bcr-abl反义寡核苷酸可显著诱导K562细胞凋亡,为临床上基因治疗人CML提供一定的参考。     

氧化苦参碱逆转多药耐药细胞系K562/A02耐药性的研究

目的: 观察非细胞毒性浓度(生长率>95%)氧化苦参碱对耐阿霉素的人白血病细胞系K562/A02多药耐药性的逆转作用,并探讨其逆转机制。 方法: 采用MTT法测定氧化苦参碱的细胞毒性及其对K562/A02细胞敏感性的影响,用流式细胞仪检测非细胞毒性浓度的氧化苦参碱处理后K562/A02细胞膜表面糖蛋白P170表达的变化与细胞内柔红霉素的浓度,应用SPSS13.0软件包对实验结果进行统计学处理。 结果: 氧化苦参碱对K562/A02细胞有一定的细胞毒作用,其非细胞毒性浓度为50μg/ml,低细胞毒性浓度(生长率为85%～90%)为135μg/ml,把非细胞毒性剂量的氧化苦参碱作为最佳逆转浓度,非细胞毒性浓度氧化苦参碱可显著降低阿霉素对K562/A02细胞的IC₅₀,使K562/A02细胞的IC₅₀由原来的(34.9±0.21)μg/ml降低至(13.3±0.21)μg/ml,其逆转倍数为2.62倍;氧化苦参碱作用于K562/A02细胞后,细胞膜糖蛋白P170的表达从90.22%下调至44.24%(P<0.01);柔红霉素外渗试验显示,氧化苦参碱作用于K562/A02细胞后,细胞内化疗药物的浓度明显增加。 结论: 氧化苦参碱可部分逆转人白血病K562/A02细胞对阿霉素的耐药性,氧化苦参碱通过下调K562/A02细胞膜糖蛋白P170的表达,使其将化疗药物泵出细胞外的功能受到了抑制,使化疗药物在白血病细胞内能达到有效浓度,从而可以杀灭耐药的白血病细胞,达到逆转白血病细胞耐药性的目的。