靶向表皮生长因子受体的shRNA抑制U251胶质瘤生长的实验研究

目的探讨靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的RNA干涉(RNAi)技术抑制恶性胶质瘤体外细胞系U251的EGFR表达后,在体内外对U251细胞生长抑制作用。方法在人EGFR开放阅读框的细胞内区酪氨酸激酶结构域选择1个siRNA靶序列、进行短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-2400的构建,并以含有随机序列的psiRNA-scr表达质粒为对照进行了脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用RT-PCR检测EGFR表达水平,应用MTT法、流式细胞术和Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的生物学行为。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用。对肿瘤组织应用免疫组化的方法进行EGFR、PCNA和GFAP表达比较。结果脂质体介导、靶向EGFR的shRNA可显著抑制U251细胞ECFR表达,MTT法分析显示psiRNA-2400转染组细胞生长抑制率为68%;与对照组和psiRNA-scr转染组比较,细胞周期分析结果表明psiRNA-2400转染组G_0～G_1期细胞数没有明显变化,进入S期的细胞数较对照组减少了12.7%～13%,而进入G_2期细胞则增加了10.5%～11.7%。Matrigel基质生长实验显示对照组和psiRNA-scr转染组细胞呈正常形态贴壁生长,而psiRNA-2400转染组细胞不能贴壁生长,呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-2400显著抑制皮下肿瘤生长,组织病理学分析显示治疗组EGFR表达下降、PCNA标记指数降低而GFAP表达上调。结论靶向EGFR的RNAi技术可以显著抑制U251细胞的EGFR表达,在体内外对U251细胞生长均产生明显抑制作用。因此,shRNA表达质粒介导的基因治疗可以成为胶质瘤靶向性EGFR治疗的新策略。     

靶向表皮生长因子受体psiRNA抑制人脑胶质瘤细胞系U251生长的体外研究

目的探讨靶向表皮生长因子受体(EGFR)RNA干扰(RNAi)技术抑制人脑胶质瘤细胞系U251EGFR表达后,在体外对细胞增殖活性和侵袭能力的抑制作用。方法应用流式细胞术、Annexin V法、MTT法、Matrigel细胞外基质生长实验和Transwell细胞侵袭实验评价由脂质体Lipofectamine 2000介导转染的人脑胶质瘤细胞系U251转染前后细胞增殖活性和侵袭能力的变化;Western blotting检测EGFR和PI3K/Akt信号转导通路中相关蛋白质的表达水平。结果与对照组和psiRNA-scr组比较,psiRNA-EGFR组EGFR以及PI3K/Akt信号转导通路中相关蛋白质表达水平降低(均P=0.000)。转染后,psiRNA-EGFR组细胞阻滞于G0和G1期,S期细胞数目减少(均P=0.000);其细胞凋亡率为(9.60±0.26)%,高于对照组和psiRNA-scr组(均P=0.000);自培养第2天其细胞增殖速率即呈下降趋势,且低于对照组和psiRNA-scr组(均P=0.001)。结论靶向表皮生长因子受体RNAi技术可以序列特异性地抑制人脑胶质瘤细胞系U251细胞表皮生长因子受体表达,在体外对U251细胞生长具有明显抑制作用。靶向表皮生长因子受体psiRNA基因治疗可能成为脑胶质瘤治疗的新策略。     

miR-7沉默表皮生长因子受体对胶质瘤细胞周期的影响

目的 研究miR-7阻遏脑胶质瘤细胞增殖周期由G1期向S期转化的内在机制.方法 脂质体转染miR-7表达质粒进入人脑胶质瘤细胞株U251,原位杂交和RT-PCR方法检测外源miR-7基因的整合效果;流式细胞术检测细胞周期变化,Western blot方法检测EGFR、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、CDK6、P16、P21和P27的蛋白表达;SPSS13.0软件进行统计学分析.结果 RT-PCR结果显示miR-7基因被成功整合入U251胶质瘤细胞,原位杂交结果示miR-7主要定位于细胞核和细胞质;转染后瘤细胞增殖速度减慢,且大部分阻滞于G1期,处于分裂期S期的细胞比例明显减少(P＜0.05);miR-7转染组EGFR、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4和CDK6蛋白表达水平均有不同程度下降(P＜0.05),其中EGFR、CyclinD1、CDK4和CDK6的降低程度更为显著(P＜0.01),P16水平显著升高(P＜0.01),P21和P27的表达没有明显变化(P＞0.05).结论 miR-7可能通过有效沉默癌基因EGFR的表达途径,抑制细胞周期G1期调节蛋白复合体CyclinD1/CDK4/6的活性,并接受P16的协同作用,共同阻遏胶质瘤由G1期向S期转化,进而抑制肿瘤增殖;miR-7有望成为一种新的胶质瘤治疗候选药物.     

新型超微载体FA-PAMAM介导hTERT-siRNA对人脑胶质瘤细胞系U251抑制作用的体外研究

目的 探讨由叶酸(FA)修饰的聚酰胺-胺型高聚物(PAMAM)制成的新型超微载体FA-PAMAM介导人端粒酶催化亚基(Htert)-siRNA对人脑胶质瘤细胞系U251的抑制作用.方法 人脑胶质瘤细胞系U251被分为FA-PAMAM/Htert-siRNA转染组(干涉组)、FA-PAMAM空载对照组(空载对照组)和空白对照组.利用FA-PAMAM介导Htert-siRNA体外转染胶质瘤细胞系U251,流式细胞仪检测各组细胞转染效率、细胞增殖活性、Htert Mrna表达水平、端粒酶活性以及细胞凋亡率.结果 FA-PAMAM在体外能够有效地将Htert-siRNA转染导入胶质瘤细胞系U251,转染效率为67.36%;干涉组细胞存活率随转染时间的延长而逐渐降低,以转染后48 h最低,仅为(68.97±1.19)%,与同一时限空载对照组比较,差异有统计学意义(P=0.000);转染后72h,干涉组Htert Mrna表达水平较空载对照组和空白对照组下调57%,差异有统计学意义(均P=0.000);转染后72h,干涉组端粒酶活性为(52.57±5.34)TPG,与空载对照组和空白对照组比较明显下调,差异有统计学意义(均P=0.000);转染72h后,干涉组细胞凋亡率为(29.63±2.91)%,高于空载对照组和空白对照组,差异有统计学意义(均P=0.000),肿瘤细胞生长明显受到抑制.结论 FA-PAMAM作为一种新型超微载体可于体外有效转染Htert-siRNA,具有高效、低细胞毒性之优点;Htert-siRNA可作为胶质瘤基因治疗的靶点.     

白藜芦醇抑制U251人胶质瘤细胞增殖及其相关机制的探讨

目的 探讨白藜芦醇（Res）对U251胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机制。方法 将不同浓度Res作用于U251胶质瘤细胞系，相差显微镜下观察其形态的变化，MTT法检测其对细胞生长增殖的抑制作用，流式细胞术（FCM）检测其对细胞周期的影响，用蛋白印迹（Western blot）检测Res处理前后U251细胞表皮生长因子受体（EGFR）、p53、p21、CDK4、CyclinD1、Bcl-2及caspase-3的表达，免疫组化分析MMP9、NFKB、P-AKT及AKT2的表达。结果 U251细胞经Res处理后，细胞形态发生一定变化，U251胶质瘤细胞的增殖被抑制，呈浓度和时间依赖性，细胞周期被阻滞在S期，Western blot检测显示EGFR、CyclinD1、CDK4、Bcl-2的表达降低，p21、p53、caspase-3蛋白表达升高，免疫组化检测显示MMP9，NFKB、P-AKT及AKT2的表达降低。结论 Res有可能通过调节EGFR及p53信号通路而抑制U251胶质瘤细胞的增殖和侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡。     

反义miR -221/222抑制Akt通路活性提高胶质瘤细胞放射敏感性的研究

目的 探讨敲低miR -221/222表达抑制Akt通路活性提高胶质瘤细胞放射敏感性的作用.方法 脂质体共转染反义寡聚核苷酸(反义miR -221/222)下调胶质瘤U251,LN -229细胞miR -221与miR -222的表达.用Northern印迹方法测定转染后细胞miR -221、miR -222的表达水平;克隆形成实验验证各组胶质瘤细胞的放射敏感性;Western印迹分析各组胶质瘤细胞的pAkt蛋白表达变化;反义miR -221/222联合X线照射治疗裸鼠皮下移植瘤,观察肿瘤生长水平;Real - timePCR检测治疗后miR - 221、miR - 222的表达;免疫组化分析肿瘤组织中pAkt蛋白表达水平.结果 Northern印迹分析显示反义miR -221/222可以有效地敲低胶质瘤细胞的miR -221和miR -222的表达水平.克隆形成实验证实反义miR - 221/222联合X线照射可增加胶质瘤细胞放射敏感性.Western印迹分析显示反义miR -221/222可下调pAkt蛋白表达.经反义miR -221/222转染联合X线照射治疗后,裸鼠皮下移植瘤生长明显受抑,肿瘤组织中miR -221/miR -222表达水平下降,pAkt蛋白表达水平也明显降低.结论 反义miR - 221/222通过抑制Akt通路活性增加胶质瘤细胞的放射敏感性.     

表皮生长因子受体靶向药物治疗脑恶性胶质瘤的研究进展

表皮生长因子受体（EGFR）在多数恶性胶质瘤中存在过表达,对肿瘤发生、发展起着重要作用,其靶向药物在基础研究和临床实验中均表现出良好效果。分子靶向治疗可能成为除手术、放疗和化疗之外脑恶性胶质瘤治疗的重要手段。本文对EGFR靶向药物分类及治疗脑恶性胶质瘤的机制进行综述。     

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达

目的构建表达靶向抑制survivin基因的三个短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,使其在胶质瘤细胞发挥干扰效应。方法在survivin全长序列中选取设计3条19个核苷酸靶序列,2条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,加上对应酶切位点,形成3条shRNA的DNA模板,分别克隆到3个干扰载体pG1,pG2和pG3上：采用分布酶切连接的方法,分别将U6启动子以及下游的后2个shRNA模板酶切下来,依次连接到pG1对应酶切位点,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-survivin,测序鉴定：将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251,分别采用RT-PCR以及Western Bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰后效果。结果重组的干扰载体含有3条正确的shRNA模板；RT-PCR以及Western Blotting检测显示,survivin的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制。结论编码3条shRNA的干扰载体pGenesil-survivin介导的RNA干扰技术(RNAi)可以显著的靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达。     

VE-statin/Egfl7-siRNA抑制恶性胶质瘤诱导内皮细胞血管生成能力的体外研究

目的通过细胞培养及RNA干扰技术探讨类表皮生长因子域7(VE-statin/Egfl 7)在恶性胶质瘤血管生成中的作用和机制。方法Transwell培养技术建立U 251-HUVEC共培养系统,体外模拟恶性胶质瘤与内皮细胞的相互作用;并通过构建靶向VE-statin/Egfl7基因的siRNA慢病毒载体抑制U251和HUVEC细胞中该基因的表达。通过内皮细胞增殖、粘附、迁移及成管实验检测该基因在体外恶性胶质瘤微环境中对血管生成的影响。结果沉默VE-statin/Egfl 7基因表达后,HUVEC生长出现暂时性减缓,但很快恢复正常增殖状态,而且内皮细胞的迁移能力不受影响,但是内皮细胞的粘附能力明显受到抑制;成管实验发现,VE-statin/Egfl7基因沉默后内皮细胞不能形成毛细血管样结构。结论 VE-statin/Egfl7可通过调节内皮细胞的粘附性而在恶性胶质瘤血管生成过程的血管管腔形成过程中起着关键性调控作用。     

半枝莲提取物抑制人恶性胶质瘤U251细胞增殖及机制研究

目的 探讨半枝莲提取物(ESB)对人恶性胶质瘤U251细胞体外增殖、凋亡和端粒酶活性的影响. 方法 以50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 mg/mL ESB分别作用体外培养的人恶性胶质瘤U251细胞24、48、72 h,同时设空白对照组,应用MTT法检测ESB对U251细胞增殖的影响,AnnexinV/PI染色检测细胞凋亡率的变化,端粒重复序列扩增法(TRAP-PCR)-酶联免疫吸附试验(ELISA)检测U251细胞端粒酶的活性. 结果 MrT检测结果显示ESB浓度、作用时间因素的交互效应(F=59.908,P=0.000),50 mg/mL ESB作用72 h时对U251细胞的抑制率最大;AnnexinV/PI染色检测显示浓度、时间因素的交互效应(F=6.548,P=0.000),25 mg/mL ESB作用72 h时U251细胞的凋亡率最大;TRAP-RCR ELISA法检测显示ESB浓度、时间因素的交互效应(F=138.433,P=0.000),50 mg/mL浓度ESB作用72 h时U251细胞端粒酶活性最小;细胞端粒酶活性与凋亡率之间呈负相关关系(r=-0.785,P=0.037),与细胞抑制率之间也呈负相关关系(r=-0.278,P=0.042). 结论 ESB可能通过下调端粒酶活性抑制U251细胞的增殖、诱导U251细胞凋亡.     

miR-203靶向抑制survivin影响胶质瘤细胞的生长和增殖

目的 探讨miR - 203靶向抑制survivin对人胶质瘤细胞株U251生长和增殖的影响.方法 利用生物信息学预测miR -203靶基因;通过脂质体将miR - 203模拟物或表达质粒转染至U251细胞,使用Real - time PCR和Western blot检测靶基因survivin的mRNA和蛋白水平,采用双荧光素酶报告基因系统进行功能验证,应用细胞生长曲线、MTT实验、流式细胞术评价细胞生长、增殖和凋亡的变化及对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和塞来昔布的敏感性.结果 TargetScan预测发现survivin是miR - 203的靶基因;转染miR - 203模拟物或表达质粒后,Real - time PCR与Western blot结果分别提示survivin的mRNA和蛋白水平下调(P＜0.05);双荧光素酶报告分析技术证实抗凋亡基因survivin为miR - 203的直接靶点;细胞生长曲线结果显示miR - 203组的生长速度明显受抑(P＜0.05);MTT实验表明miR - 203组的增殖能力减弱(P＜0.05)及药物敏感性增加;流式细胞术结果示miR -203组的凋亡比例明显升高(P＜0.01).结论 miR - 203在胶质瘤细胞中能靶向抑制survivin的表达,是一个抗增殖、促凋亡的miRNA,有可能作为今后胶质瘤干预治疗的新靶点.     

靶向表皮生长因子受体的小分子RNA干扰抑制人脑胶质瘤Notch1表达的实验研究

目的探讨RNA干扰表皮生长因子受体后Notch1在人脑胶质瘤中的表达变化。方法应用免疫组织化学方法检测不同级别脑胶质瘤组织标本中Notch1的表达水平,并进行相关分析。选择人表皮生长因子受体的两个RNA干扰靶序列构建靶向表皮生长因子受体的RNA干扰表达质粒,进行脂质体介导的TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系表达;应用荧光定量逆转录-聚合酶链反应仪观察RNA干扰表皮生长因子受体后TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系Notch1的表达变化。结果免疫组织化学检测显示,在不同级别胶质瘤组织标本中Notch1的阳性表达率分别为Ⅳ级93.33%(14/15);Ⅲ级92.31%(12/13);Ⅱ级68.42%(13/19)。Ⅱ级阳性表达程度较Ⅲ、Ⅳ级弱,组间差异有高度统计学意义(H=6.944,P<0.01),提示高级别胶质瘤Notch1阳性表达率高于低级别。RNA干扰表皮生长因子受体后,Notch1在TJ905胶质母细胞瘤细胞系中的表达下降(F=578.728,P<0.01):TJ905组与TJ905 空载组相比,差异无统计学意义(P>0.05);TJ905 空载组与TJ905 516组相比,差异有统计学意义(q=6.359,P<0.05);TJ905 516组与TJ905 2400组比较,差异有统计学意义(q=4.501,P<0.05);TJ905组与TJ905 2400组相比差异亦有统计学意义(q=10.015,P<0.05)。责任基因相对表达量,TJ905组和TJ905 空载组均为2.48×10-5,TJ905 516组为6.64×10-6,TJ905 2400组为2.08×10-7。结论表皮生长因子受体与Notch1关系密切,对二者关系的进一步研究可为胶质瘤的基因治疗提供新的思路。     

U251胶质瘤荷瘤鼠皮下模型的建立及其表皮生长因子受体通路成员异常表达

目的建立稳定可靠的荷瘤鼠皮下U251胶质瘤实验动物模型，使其良好地用于胶质瘤分子机制的研究。方法取生长状态良好的U251胶质瘤细胞悬液按1×10^6个细胞／50μl接种于10只荷瘤鼠腹腔皮下，待其成瘤后将肿瘤组织块接种于20只实验鼠，观察并记录肿瘤皮下生长情况，于成瘤后第5周处死荷瘤鼠检测是否存在肿瘤远处转移；同时对肿瘤组织行HE和免疫组织化学染色检测胶质瘤的病理学特征，观察表皮生长因子受体、磷酰肌醇3-激酶和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶-2基因阳性表达率，结果与体外培养的U251胶质瘤细胞系的基因异常表达进行比较。结果细胞悬液接种可成功获得皮下U251胶质瘤模型，但潜伏期延长（2～3周），成功率低（6／10）；若将其生成的肿瘤组织块再次接种于荷瘤鼠皮下则可获得高效、稳定的成瘤率（20／20）且潜伏期明显缩短（3d-5d）。荷瘤鼠生长状态良好，无恶病质变化，未发生其他脏器转移。大体标本观察显示，肿瘤体积〉750mm^3时其内部多见坏死伴囊性变，部分肿瘤尚有脂肪浸润或纤维化；肿瘤有假包膜形成，瘤体部分呈鱼肉状，是胶质瘤生发和再移植取材的部位。免疫组织化学检测显示，荷瘤鼠皮下胶质瘤组织和体外培养的U251胶质瘤细胞对表皮生长因子受体、磷酰肌醇3-激酶以及丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶-2基因通路主要成员的基因表达情况相似。结论将U251胶质瘤细胞悬液接种于荷瘤鼠皮下形成的胶质瘤再移植到荷瘤鼠皮下建立U251移植瘤实验模型的方法简便、潜伏期短、成功率高、稳定性好，可以作为胶质瘤体内实验研究的动物模型。     

盐酸氨基酮戊酸介导的光动力疗法增高U251细胞蛋白酶体的表达

目的探讨盐酸氨基酮戊酸(5-ALA)做为光敏剂的光动力疗法(PDT)对人胶质瘤细胞株U251细胞的杀伤效应及其对U251细胞蛋白酶体亚基低分子量多肽(LMP)2、7表达的影响。方法培养U251细胞,利用细胞计数药盒确定的5-ALA-PDT对U251细胞半抑制剂量为试验条件。分别收集5-ALA-PDT处理后3、6、9、12、15、18、21和24 h及对照组U251细胞LMP2和LMP7,RNA与蛋白质,分别行实时PCR、Western Blot分析。结果强度为20 mw/cm2激光照1、2、3和4 min后U251细胞抑制率分别为11.18%、19.6%、48.62%、66.21%。以强度为20 mw/cm2照射3 min为条件,照射后3、6、9、12、15、18、21和24 h,U251细胞蛋白酶体亚基LMP2、LMP7蛋白和mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.01)。结论以5-ALA为光敏剂的PDT能有效抑制体外培养U251细胞生长,并促进蛋白酶体的表达。     

人类重组肝细胞生长因子对人胶质瘤U251细胞系增殖及侵袭的影响

目的探讨人类重组肝细胞生长因子（rhHGF）对人胶质瘤U251细胞系侵袭、增殖的影响及其机制。方法应用细胞培养技术培养U251细胞；用10、20、30μg，L不同浓度rhHGF作用U251细胞48h，以倒置相差显微镜观察、MTT法检测rhHGF对U251细胞增殖的影响；以过河实验、粘附测定、免疫组化法及Western blot检测rhHGF对U251细胞的侵袭力和对增殖细胞核抗原（PCNA）、钙粘素（E-cadherin）表达的影响。结果rhHGF可明显增加U251细胞的增殖和生长，且随浓度提高作用增强，呈剂量效应关系。过河实验、粘附实验显示rhHGF能增强U251细胞的体外侵袭和运动能力，随浓度提高，过河时间缩短，细胞粘附力增加（P〈0．05）。Western blot及免疫组化测定显示rhHGF作用48h后，U251细胞PCNA表达上升，E-cadherin表达下降（P〈0．05）。结论rhHGF可促进人胶质瘤U251细胞的生长和增加其体外侵袭能力，推测其机制与直接增加U251细胞迁移运动，干扰U251细胞PCNA、E-cadherin蛋白表达有关。