乙型肝炎病毒X基因诱导卵圆细胞恶性转化的研究

目的 研究乙型肝炎病毒X(HBx)基因对卵圆细胞转化和分化的影响.方法 用稳定表达HBx的转基因即圆细胞株pEGFP-HBx卵圆细胞作为实验组,pEGFP卵圆细胞及LE/6卵圆细胞作为对照组,运用倒置相差显微镜和透射电镜、流式细胞术、糖原染色、软琼脂生长、实时定量PCR、细胞免疫化学技术观察和检测pEGFP-HBx卵圆细胞在细胞形态、细胞周期、分化标志物、癌基因c-myc及TGF-α的变化.结果 (1)与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞体积增大,核具有明显异型性;(2)流式细胞仪检测显示,与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞G0/G1期细胞百分比下降,S期和G2/M期细胞百分比明显升高,而且非整倍体细胞明显增多;(3)糖原染色显示,pEGFP-HBx卵圆细胞胞质内可见大量糖原颗粒;(4)软琼脂中可见pEGFP-HBx卵圆细胞克隆形成;(5)癌基因c-myc及TGF-α表达量明显增高,卵圆细胞分化指标HNF-4α、AFP表达上升,CK-7、CK-19表达下降,未见有cps1 mRNA表达.结论 HBx基因可以引起卵圆细胞异常分化,并直接诱导卵圆细胞发生恶性转化.     

肝细胞生长因子在肝星状细胞调控卵圆细胞凋亡中的作用

目的 探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)调控卵圆细胞凋亡中的作用.方法 将健康雄性SD大鼠随机分为实验组、条件对照组和假手术组.三组大鼠均接受2-AAF灌胃,实验组和条件对照组进行2/3肝切除,而假手术组仅进行开关腹.于术后第0、1、3、6、9、12和15天提取HSCs,收集该细胞的条件培养液,将HGF受体抑制剂PHA665752(5 μmol/L)加入条件对照组的条件培养液中,用各时间点的条件培养液作用于LE6卵圆细胞系24 h,经PI/Annexin-Ⅴ染色后采用流式细胞术检测LE6细胞的凋亡情况.提取第9天条件培养液处理后的LE6细胞蛋白,采用Western Blotting检测Bim和cleaved-Casepase 3蛋白的表达.结果 经第6、9、12天条件培养液处理后,实验组LE6细胞的凋亡率显著低于假手术组和条件对照组(P＜0.05),其中第9天差异最显著,而且第9天实验组的Bim和cleaved-Casepase 3蛋白的表达量均低于假手术组和条件对照组(P＜0.05).结论 HGF可能通过降低Bim蛋白表达和抑制Caspase 3活性参与HSCs对卵圆细胞凋亡的负调控.     

肝癌组织中livin基因表达及与乙型肝炎病毒X蛋白的关系研究

目的 探讨livin基因在肝癌组织中的表达及乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus Xprotein,HBx)对其表达的影响.方法 采用免疫组化染色法检测10例正常肝组织和30例肝癌组织中livin基因的表达.建立稳定转染HBx基因的L02(L02-X)细胞系,采用Real-time PCR和Western blot检测L02-X)细胞系转染HBx基因前后livin基因表达的变化.结果 Livin基因在肝癌组织的表达明显高于正常肝组织,且livin基因的表达与肝癌的大小、病理分级无明显相关性(t=1.688,P=0.103;γ=-0.137,P=0.471;P＞0.05),与门静脉癌栓有关(t=2.24,P=0.033;P＜0.05).转染HBx基因后livin基因mRNA表达水平上调(t=6.73,P＜0.05).结论 livin基因高表达引起的凋亡抑制可能在肝癌的发生、发展中起重要作用,HBx基因可以在转录水平上调其表达.     

乙型肝炎病毒X蛋白抑制足细胞增殖

目的 通过构建复制缺陷型腺病毒载体将乙型肝炎病毒（HBV）X基因（即HBx基因）导入足细胞株,探讨HBx蛋白对足细胞增殖的影响及其分子机制。 方法 采用pAdxsi系统构建携带HBx基因的复制缺陷型腺病毒载体。以瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态。以MTT检测和羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）荧光染料示踪细胞增殖的方法,对细胞增殖进行定量评估。采用流式细胞仪检测细胞周期分布。采用cyclin/DNA双参数流式细胞术和Western印迹检测细胞周期调控蛋白的表达。 结果 PCR和基因测序鉴定证实,Ad.HBx构建成功。Western印迹显示,足细胞感染Ad.HBx（感染复数MOI =100）后第3、5天均可表达相对分子质量为17 000的HBx蛋白,表明HBx可在足细胞株稳定表达。细胞形态学观察显示腺病毒感染后第5天Ad.HBx组细胞呈现明显的有丝分裂障碍特征,双核、多核和多形核细胞比例明显增加。MTT检测结果显示空白组和Ad组足细胞的生长曲线基本吻合,而Ad.HBx组细胞的生长曲线自第4天起较前两组偏低,至第5天时该差异具有统计学意义（P < 0.01）;同时,CFDA-SE细胞增殖示踪实验也证实,于腺病毒感染后第3天Ad.HBx组细胞的增殖速度已明显低于空白组和Ad组（增殖指数11.2比15.4、13.3）,且随时间推移进一步减慢（增殖指数32.5 比 61.6、54.0）,表明HBx可显著抑制足细胞增殖。细胞周期分析和细胞周期调控蛋白检测的结果显示,HBx可诱导足细胞周期G2/M阻滞,同时伴有cyclin B1、p21的表达上调及cyclin A的下调。 结论 乙肝病毒基因编码的HBx蛋白可使cyclin B1降解受阻,同时下调cyclin A和上调细胞周期负调蛋白p21的表达,导致细胞周期阻滞于G2/M期,从而抑制足细胞增殖。这可能是乙型肝炎病毒相关性肾炎患者肾小球足细胞缺失,肾脏病变慢性进展的重要机制之一。     

ABCG2/Bcrpl基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达

目的探讨ABCG2／Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达及意义。方法建立大鼠2-乙酰氨基芴／三分之二肝切除模型，二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心分离大鼠肝脏卵圆细胞，采用荧光定量PCR技术检测ABCG2／Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞和肝细胞中的表达水平，免疫组织化学、免疫荧光双标染色和Westernblot方法检测该转运蛋白的表达。结果大鼠肝卵圆细胞中ABCG2／Bcrp1基因的表达水平是肝细胞的13．8倍，ABCG2／Bcrp1蛋白相对分子质量大小为72000，定位于卵圆细胞膜。其表达位于门脉区周围，并向肝小叶延伸。免疫荧光双标染色显示与OV-6共表达。结论大鼠肝卵圆细胞表达高水平的ABCG2／Bcrp1，后者参与肝干细胞免受外源性化学物质损伤的自我保护机制。     

肝卵圆细胞分化调控机制的研究进展

肝卵圆细胞是存在于肝脏中的一类肝干细胞,目前已证实了它在人及多种动物中存在。卵圆细胞来源并定位于肝内的胆管系统中,具有多向分化潜能,正常时处于静止状态,只有当肝脏发生严重损伤且肝细胞再生障碍时才受到激活并大量增殖,可分化为肝细胞和胆管细胞,以修复重建肝脏组织,恢复生化功能。随着研究的深入,卵圆细胞必将在移植、生物人工肝、各种终末期肝病的治疗等方面开辟新的途径。     

肝卵圆细胞来源分化增殖的研究进展

卵圆细胞为肝内一种祖细胞，在肝细胞严重受损或分裂增生受抑制时可向肝细胞和胆管上皮细胞分化，是一种具有双向分化潜能的祖细胞。卵圆细胞的分化增殖受多种因素调控．新近研究认为SDF-1-CXCR4生物学轴在卵圆细胞增殖过程中起非常重要的作用。肝癌的发生与卵圆细胞的分化异常有一定的关系。卵圆细胞分化为肝细胞和胆管上皮细胞使其可能成为旰脏细胞移植的重要细胞来源，在治疗终末期肝病、生物人工肝及基因治疗的研究领域有着广阔的应用前景。     

端粒酶在大鼠肝卵圆细胞中表达的意义

目的 检测大鼠肝卵圆细胞端粒酶活性,探讨端粒酶表达与卵圆细胞增殖分化的关系.方法 采用2-AAF/PH模型诱导大鼠卵圆细胞增殖,改良的胶原酶灌注结合密度梯度离心法分离,用细胞免疫荧光和电镜鉴定卵圆细胞.采用免疫组织化学、RT-PCR、荧光定量PCR等方法检测卵圆细胞端粒酶的表达,组间比较采用t检验分析其意义.结果 采用2-AAF/PH模型成功诱导大鼠卵圆细胞增殖.分离的卵圆细胞核大,卵圆形,胞质少,呈铺路石样生长.电镜发现细胞核质比大,胞质内细胞器少且发育不成熟.细胞免疫荧光结果表达OV-6、AFP、CK-19、albumin、c-kit.端粒酶逆转录酶(TERT)表达在门静脉周围增殖的卵圆细胞核内,随着卵圆细胞逐渐向肝细胞方向分化,TERT阳性细胞数逐渐减少.大鼠正常肝组织TERT mRNA表达水平最高,为LE-6卵圆细胞的2.27倍;分离的卵圆细胞TERT mRNA表达水平为LE.6卵圆细胞的1.26倍;采用2μg和4μg细胞提取物分析细胞的端粒酶活性,随着LE-6卵圆细胞传代次数的增加,由24代传至40代,端粒酶活性由△A=1.05、1.15降低到△A=0.25、0.45(t=17.74,12.38,P<0.05).结论 卵圆细胞具有端粒酶活性,端粒酶可能是卵圆细胞维持其增殖能力和多分化潜能的一个必要条件.     

表皮生长因子对卵圆细胞p21ras蛋白表达的影响

卵圆细胞 (OVC)为肝脏的干细胞 ,与肝癌发生关系密切[1,2 ] 。我们应用Westernblot法通过对大鼠肝脏卵圆细胞在表皮生长因子 (EGF)干预下 p2 1ras表达的影响进行比较分析 ,同时运用四唑盐比色法 (MTT)法观察细胞活力 ,以揭示EGF对卵圆细胞活性及 p2 1ras蛋白表达变化的影响。一、材料与方法1.材料 :SD大鼠 6只 ,体质量 (12 0± 2 0 )g ,第一军医大学动物所提供。 3’ 甲基 4 二甲基偶氮苯 (日本东京化成工业株式会社 ) ,脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸 (美国Sigma公司 ) ,F12及DMEM /F12 (1∶1) (美国Gib co公司 ) …     

大鼠肝卵圆细胞中matrilin-2的表达及其意义

目的探讨大鼠肝脏再生过程中肝卵圆细胞matrilin-2的表达及其意义。方法利用大鼠部分肝切除(PH)或2-乙酰氨基芴灌胃+/部分肝切除(2-AAF/PH)建立大鼠肝脏再生模型,并设正常对照组。应用免疫组织化学和RT-PCR方法研究肝脏组织中matrilin-2表达情况。结果免疫组化发现正常对照组及PH组肝脏组织中只有极少量的matrilin-2表达位于胆管血管周围及肝窦状隙内,而在2-AAF/PH模型中可见matrilin-2表达位于门静脉周围的肝窦状隙内,RT-PCR发现2-AAF/PH组肝卵圆细胞中matrilin-2mRNA高表达,而PH组及正常对照组成熟肝细胞中无matrilin-2mRNA表达。结论matrilin-2是肝卵圆细胞在肝脏再生过程中产生的重要的细胞外基质蛋白,与肝卵圆细胞的增殖分化过程有密切关系。     

乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶3A/3B表达的影响

目的观察乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）3A/3B表达的影响。方法本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆（pcDNA-X/QSG7701）及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆（pcDNA3.0/QSG7701）。采用RT-PCR、Westernblot分别检测转染细胞中HBxmRNA和HBx蛋白的表达。Real-timePCR检测3种细胞DNMT3A/3BmRNA的表达情况。免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况。结果RT-PCR、Westernblot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBxmRNA及HBx蛋白的表达。Real-timePCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3BmRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701（P〈0.05）。免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞（P〈0.05）。结论稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3BmRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否能进一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究。     

乙型肝炎病毒X蛋白在肝外胆管癌及癌旁胆管组织中的表达和意义

目的 探讨肝外胆管癌组织中乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白（HBx)的表达及意义。方法 应用免疫组织化学S-P法对71例肝外胆管癌和39例癌旁胆管组织中的HBx表达进行检测。并与临床病理资料进行相关分析。结果 71例肝外胆管癌组织中HBx表达阳性率为75%（53/71）；而39例癌旁胆管组织中的HBx表达阳性率仅为26%（10/39），且阳性信号全部见于伴有不典型增生的胆管上皮细胞内，统计学分析显示胆管癌组织中HBx表达和分布与临床病理参数无相关性。结论 肝外胆管癌组织中有HBx的高表达，后者极有可能参与胆管癌的病理发生发展过程。     

乙肝病毒X 蛋白对正常肝细胞生物钟基因表达的影响

目的：探讨乙肝病毒X蛋白（HBx）对人正常肝细胞中生物钟基因表达的影响。 方法：分别将HBx表达质粒（pcDNA3.1-HBx）与空载体质粒（pcDNA3.1）转染入人正常肝细胞系L02后,用RT-PCR与Western blot法检测细胞HBx mRNA与蛋白的表达;real-time PCR检测细胞中生物钟基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε的表达。 结果：RT-PCR与Western blot结果显示,L02细胞转染HBx表达质粒后有明显的HBx mRNA与蛋白表达,而转染空载体质粒的L02细胞无HBx mRNA与蛋白表达。与转染空载体质粒的L02细胞比较,转染HBx表达质粒的L02细胞CLOCK与Cry1的mRNA表达明显升高,而BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry2、CKIε的mRNA表达明显降低,差异均有统计学意义（均P<0.05）。 结论：HBx能使正常肝细胞中的生物钟基因表达发生改变,破坏肝细胞正常的生物节律,这可能为其导致肝癌形成的机制之一。     

维持性血液透析患者感染乙型和丙型肝炎的分析

目的为了评价血液透析（血透）患者乙型和丙型肝炎（HBV、HCV）感染状态及对临床情况和肝功能的影响。方法对62例血透患者应用ELISA法和RT-PCR法检测抗-HCV和HCVRNA，采用斑点杂交法和固相放免法检测HBV标志，并检测肝功能和血浆蛋白电泳。结果62例患者中，抗-HCVIgM阳性27例（43．6％），抗-HCVIgG阳性29例（46．8％），HCVRNA阳性34例（54．8％），三项任一项阳性37例（59．7％），5例（8．1％）HBsAg阳性，其中HBeAg和HBVDNA阳性3例。结论向透患者中HCV感染严重，临床情况及预后差，检测血浆蛋白和电泳较肝功能酶学能更好地作为肝炎诊断和反映病情的指标。     

乙型肝炎病毒X基因对肾小管上皮细胞间质转分化的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因表达蛋白HBX对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)细胞形态及转分化的影响.方法 用分子克隆的方法构建pcDNA3.1-myc-HBX质粒,采用脂质体转染法瞬时转染HK-2细胞,Q-PCR及Western印迹法验证HBX在HK-2细胞中的表达.以未转染质粒和转染空载质粒pcDNA3.1-myc作为对照.用显微镜观察转染pcDNA3.1-myc-HBX质粒后HK-2细胞形态,用Western印迹及Q-PCR法检测细胞转分化标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达;ELISA检测细胞上清液中白细胞介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达.结果 转染HBX后的HK-2细胞中存在HBX的高表达,证实转染成功.转染pcDNA3.1-myc-HBX质粒的HK-2细胞数量明显下降,细胞形态不规则,细胞状态受损;转染pcDNA3.1-myc-HBX质粒的HK-2细胞可上调E-cadherin及α-SMA表达;细胞上清液中高表达IL-1、IL-6和TNF-α(P＜ 0.01).结论 HBX质粒转染HK-2细胞后可引起细胞数目和形态的变化,并促进肾小管上皮细胞发生上皮间质转分化,肾小管上皮细胞周围炎性微环境的改变可能是其发生上皮间质转分化的原因之一.     

乙型肝炎病毒感染对结直肠癌组织中血小板反应蛋白—2基因表达的影响及其意义

目的 研究乙型肝炎（乙肝）病毒对结直肠癌组织中血小板反应蛋白－2（TSP－2）基因表达的影响。方法 运用RT－PCR技术对18例乙肝病毒感染、25例非乙肝病毒感染的结直肠癌切除标本测定TSP－2的表达，比较两组间的差异性。结果 乙肝病毒感染组癌组织中的TSP－2阳性表达率为56％，明显高于非乙肝病毒感染组的24％（P＜0．05）。结论 乙肝病毒感染结直肠癌组织中的TSP－2表达上调，从而可能降低结直肠癌肝转移的发生。     

小儿肾病患者肾组织病毒基因表达及临床意义

目的：探讨病毒感染在小儿肾脏病发病中的致病作用及临床意义。方法：应用聚合酶链反应（PCR）检测了224例小儿肾病患血清及肾活检组织中乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、EB病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）基因表达情况。结果：小儿肾病患血清和肾组织中HVB DNA检出阳性率分别为21.4%和19.6%;HCVRNA阳性率为4.0%和3.1%;EBVDNA阳性率为1.8%和0.5%;CMV DNA阳性率为0.9%和0.5%。结论：HBV感染在小儿肾脏疾病发病因素上起着重要的作用,HCV感染与小儿肾病的关系尚不明确,而EBV和CMV感染导致小儿肾病比较罕见。     

干扰素-α对CCL13/HBx细胞生长及侵袭转移潜能的抑制作用

目的 观察干扰素-α对恶性转化的CCL13/HBx细胞的生长和侵袭转移潜能的抑制效应.方法 采脂质体法将pcDNA3.1-HBx质粒转入CCL13细胞,将CCL13/HBx细胞分别在普通条件下培养或与干扰素-α共培养,采用绘制生长曲线、平板集落形成实验、划痕愈合实验、体外侵袭力、体内裸鼠成瘤实验分别检测CCL13/HBx、INF-α-CCL13/HBx、CCL13/PcDNA3.1细胞在体内、体外的生长及运动迁移能力的差异.结果 pcDNA3.1-HBx质粒转染CCL13细胞后在该细胞中稳定表达,CCL13/HBx细胞生长明显快于INF-α-CCL13/HBx和CCL13/PcDNA3.1细胞,克隆生成率明显增高(31.2%比10.8%比12.4%,P<0.05),划痕愈合能力明显增强,穿过人工基底膜的细胞数明显增多[(41.6±3.1)/HP比(7.4±1.2)/HP比(9.2±1.6)/HP,P<0.05].干扰素-α治疗组CCL13/HBx细胞裸鼠皮下成瘤体积减小[(2.4±0.2)cm3比(4.2±0.3)cm3,P<0.05].结论 CCL13/HBx细胞较CCL13/pcDNA3.1细胞具有更强的生长和侵袭转移潜能,干扰素-α能明显抑制HBx蛋白所诱导的细胞恶性表型.