转化生长因子-β1促进失神经骨骼肌肌源性干细胞表达胶原纤维的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对体外失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)表达和合成细胞外基质的影响.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,培养基中加入TGF-β1.将体外培养的细胞分为2组:A组,对照组;B组,10μg/L TGF-β1.在相差显微镜下观察细胞生长情况,利用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测MDSCs中COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表达和合成.结果 在体外,失神经骨骼肌MDSCs低表达和合成COL-Ⅰ和COL-Ⅲ.TGF-β1作用24h后,失神经骨骼肌MDSCs中COL-Ⅰ和COL-ⅢmRNA的表达开始增高,48h时COL-ⅠmRNA表达达峰值,之后一直持续高表达,COL-ⅢmRNA表达缓慢增高,在5d时达最高峰;3d时COL-Ⅰ的合成升高最显著,5d时COL-Ⅲ的合成增加最明显.结论 TGF-β1能加强失神经骨骼肌MDSCs合成和分泌细胞外基质,促进失神经骨骼肌纤维化.     

胰岛素样生长因子1基因转染肌源性干细胞及表达

目的检测胰岛素样生长因子1（IGF-1）转染肌源性干细胞效果及IGF-1基因表达情况。方法取失神经骨骼肌，分离、接种培养肌源性干细胞。取第3代细胞，用Lipofectamine介导，将重组质粒PAD—CMV—IGF-1转染肌源性干细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，酶联免疫吸附试验检测培养上清液中IGF-1的浓度变化，Westernblot及实时荧光定量RT-PCR检测细胞内IGF-1及其mRNA的表达，流式细胞仪检测细胞周期。结果在转染2周内细胞表达绿色荧光蛋白。转染后上清液中分泌IGF-1浓度上升，72h达到高峰为（32．2±5．3）ng／ml，后其浓度逐渐下降。Westernblot证实有与IGF-1大小相符条带出现。实时荧光定量RT—PCR证实mRNA表达明显增高，第3天达到高峰。流式细胞检测表明转染后肌源性干细胞S期比例增加。结论PAD—CMV—IGF-1质粒可有效转染肌源性干细胞。     

丹参抑制骨骼肌肌源性干细胞合成胶原蛋白的机制研究

目的 研究丹参抑制体外骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)合成胶原纤维的机制.方法 采用差速贴壁法分离大鼠骨骼肌MDSCs,利用TGF-β1诱导MDSCs表达胶原纤维,观察丹参对细胞的作用.将体外培养的细胞分为四组,A组:对照组;B组:150 mg/L丹参组;C组:10 μg/L TGF-β1组;D组:10μg/LTGF-β1+ 150 mg/L丹参组.利用免疫细胞化学方法,RT-PCR及Western Blot检测MDSCs中Smad3和COLⅠ表达.结果 在体外,TGF-β1能加强Smad3表达,诱导MDSCs表达胶原蛋白,丹参能拮抗TGF-β1的作用,降低细胞Smad3和COL Ⅰ的表达和合成水平.结论 丹参可以抑制MDSCs表达和合成细胞外基质,其机制是通过干预TGF-β1-Smad3信号通路,抑制MDSCs分化,从而降低细胞合成和分泌胶原纤维.     

丹参抑制骨骼肌肌源性干细胞成纤维样分化作用的研究

目的 研究丹参对体外培养的骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)纤维样分化的作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠MDSCs,利用TGF-β1诱导MDSC向成纤维样细胞分化,观察丹参对细胞成纤维样分化的影响.将体外培养的细胞分为3组:A组,对照组;B组,10 ng/ml TGF-β1组;C组,10 ng/ml TGF-β1+150 mg/L丹参组.在放大400倍相差显微镜下观察细胞生长情况,利用免疫细胞化学方法、RT-PCR、Western Blot检测MDSCs表达CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ的情况.结果 在体外,TGF-β1能加强MDSCs表达结缔组织生长因子(CTGF)和胶原蛋白,丹参拮抗TGF-β1的作用,降低细胞CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ mRNA的表达水平,降低CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ蛋白的水平.结论 丹参可以抑制TGF-β1诱导MDSCs成纤维样分化作用.其机制可能是抑制CTGF表达,从而降低细胞合成和分泌胶原纤维,抑制细胞成纤维样分化.

Abstract：

Objective To investigate the effect of Salvia miltiorrhiza on fibroblastic differentiation of skeletal muscle-derived stem cells (MDSCs) in vitro. Methods MDSCs in rats were isolated by the method of adhering to culture plastic at different time points. Fibroblastic differentiation of MDSCs was induced by TGF-β1 administration and the effects of Salvia miltiorrhiza on fibroblastic differentiation were observed. The cells cultivated in vitro were divided into three groups according the supplement of TGF-β1 and Salvia miltiorrhiza in culture media: group A (control group) had no TGF-β1 and Salvia miltiorrhiza;group B had 10 ng/ml TGF-β1;group C had 10 ng/ml TGF-β1 and 150 mg/L Salvia miltiorrhiza. Cell growth was observed using phase contrast microscope. The expressions of CTGF,COLⅠand COL Ⅲ in each group were detected by immunocytochemistry,RT-PCR and Western Blot. Results In vitro,TGF-β1 promoted the expression of CTGF and collagens of MDSCs. However,the effect of TGF-β1 could be inhibited by Salvia miltiorrhiza,resulting in decreased mRNA and protein expression of CTGF,COLⅠand COL Ⅲ. Conclusion Salvia miltiorrhiza could inhibit fibroblastic differentiation of MDSCs induced by TGF-β1. The mechanism might be that inhibition of CTGF expression reduces the synthesis and secretion of collagen fibers and in turn inhibits the fibroblastic differentiation.     

转化生长因子β1不同作用时间对体外培养小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞内结缔组织生长因子的影响

目的观察转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）对失神经骨骼肌肌源性干细胞（muscle derived stem cell,MDSC）内结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的影响,探讨TGF-β1-CTGF通路致失神经骨骼肌纤维化的作用及机制。方法采用差速贴壁法分离培养并鉴定小鼠失神经骨骼肌MDSC,用浓度为10ng/ml的TGF-β1培养24h前、后分别作表型鉴定。体外MDSC分别在TGF-β1浓度为10ng/ml的培养基内培养0、3、6、12、24和48h,按时间点分为A～F组,Western blot检测CTGF蛋白表达,实时荧光定量RT-PCR检测CTGF mRNA水平。结果免疫组织化学观察示,加入TGF-β1干预前MDSC高度表达Sca-1,阳性率96%;TGF-β1干预后Sca-1表达阳性率明显降低,阴性率〉99%。Western blot检测A～F组CTGF与β-actin的平均吸光度（A）值比值分别为0.788±0.123、1.063±0.143、2.154±0.153、2.997±0.136、3.796±0.153和3.802±0.175,A～D组间两两比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,D～F组间两两比较差异无统计学意义（P〉0.05）。A～F组RT-PCR的Ct值分别为1.659±0.215、1.897±0.134、2.188±0.259、2.814±0.263、2.903±0.126和3.101±0.186,A～D组组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）,E组和F组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论TGF-β1能促进体外培养小鼠MDSC生成CTGF,在3～12h时间范围内呈时间依赖关系。     

MDR1 shRNA表达质粒的构建

Q-ZsGreeen-A和pSIREN-RetroQ-ZsGreeen-B)经酶切与测序证实两段寡核苷酸片段成功插入到预计位点,序列完全一致,无任何碱基突变. 结论 MDR1 shRNA的表达载体pSIREN-RetroO-ZsGreeen-A和pSIREN-Ret-roQ-ZsGreeen-B成功构建,为进一步研究肿瘤多药耐药逆转奠定了实验基础.     

丹参抑制转化生长因子-β1诱导的肌源性干细胞向肌成纤维母细胞分化

目的 观察丹参对失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向肌成纤维母细胞分化的抑制作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,加入转化生长因子-β1(TGF-β1)和丹参进行干预,将细胞分为3组:A:对照组;B:10 μg/L TGF-β1组;C:10 μg/L TGF-β1+ 150 mg/L丹参组.荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞在干预后5个时间点α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin) mRNA和蛋白表达.结果 与A组比较,B组和C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA在干预后第2、3、5、7天均明显升高(P＜0.05),其蛋白表达在干预后第3、4、6、8天亦显著升高(P＜0.05);与B组比较,C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA和蛋白在对应时间点均明显降低(P＜0.05).结论 丹参能抑制TGF-β1诱导的失神经骨骼肌MDSCs向肌成纤维母细胞的分化.     

转化生长因子-β1诱导体外失神经骨骼肌肌源性干细胞分化的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对体外失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)分化方向的作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞,利用TGF-β1诱导分化.将细胞随机分为两组:A,对照组;B,10 ng/ml TGF-β1处理组.在相差显微镜下观察细胞生长情况,用免疫细胞化学法、RT-PCR和Western blot检测两组细胞中Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅲ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)和干细胞抗原-1(Sca-1)的表达水平变化.结果 在体外,对照组失神经骨骼肌MDSCs表达和合成COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA和vimentin的水平极低,而表达和合成Sca-1的水平很高.10 ng/ml TGF-β1处理后,失神经骨骼肌MDSCs能高表达COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA和vimentin,而低表达Sca-1.在TGF-β1的作用下,失神经骨骼肌MDSCs中COL-Ⅰ的表达水平在第2天时达最高值(12.5591±0.3389),约为对照组的3倍;COL-Ⅲ在5d时达最高值(0.8956±0.0438),约为对照组的23倍;α-SMA在第5天时达最高值(1.1090±0.0018),约为对照组的18倍;vimentin在5d时达最高值(0.1794±0.0019),约为对照组的8.5倍;Sca-1在第2天时开始降低,第5天时降低最显著(0.0636±0.0015).结论 TGF-β1能诱导体外失神经骨骼肌MDSCs向肌成纤维母细胞(myofibroblasts)分化,促进细胞合成和分泌细胞外基质.     

Erk和p38信号转导通路对大鼠肌源性干细胞内结缔组织生长因子表达的调控作用

目的 探讨肌源性干细胞(muscle derived stem cells,MDSC)受转化生长因子β1(transforming growth factor-1,TCF-β1)刺激产生结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的过程中,Erk信号转导通路和p38信号转导通路是否发挥作用.方法 采用细胞差速贴壁法,从新生大鼠骨骼肌中分离提取肌源性干细胞,进行细胞表型鉴定后传代培养.实验设空白组、对照组和实验组共8组:空白组,添加液为基础培养基;对照组,基础培养基中加TGF-β1;PD98059实验组,分别用20、40、80μM的PD98059预处理;SB203580实验组,分别用0.2、0.5、1.0μM的SB203580预处理.用Real Time-PCR和Western Blot分别检测细胞中CTGF mRNA和蛋白质的水平.方果 空白组、对照组和PD98059实验组间CTGF mRNA和蛋白质的相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05),对照组和SB203580实验组间差异均无统计学意义(P>0.05).方论 TGF-β1诱导NDSC产生CTCF的过程中,存在着Erk信号转导途径,不存在p38信号转导途径.     

大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞向内皮细胞分化的研究

目的 观察大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞(MDSCs)在血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)共同作用下向内皮细胞分化的潜能.方法 采用Preplate差速贴壁法结合密度梯度离心法分离、纯化大鼠阴茎海绵体MDSCs,获得差速贴壁细胞(PP1-PP6),免疫荧光细胞化学法检测PP6细胞干细胞抗原-l(Sca-1)和结蛋白(Desmin)的表达,并传代培养.取PP6第3代细胞在VEGF和bFGF共同诱导21 d后,免疫荧光细胞化学法鉴定内皮细胞标志物[CD31、胎肝激酶-l(Flk-1)]的表达;分别在诱导0、5、10、15、21 d,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测干细胞标志物(Oct-4)和内皮细胞标志物[CD31、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、Flk-1] mRNA的表达量;通过Dil-Ac-LDL摄取实验检测细胞吞噬低密度脂蛋白的能力;划痕24h后观察划痕空白处的距离,评估细胞的迁移能力.结果 PP6细胞表达肌源性干细胞标志物Sca-1和Desmin;PP6诱导21 d后表达内皮细胞标志物(CD31和Flk-1),诱导21 d后与诱导0d比较,干细胞标志物Oct-4的mRNA表达量下降(下降倍数为0.445±0.025),而内皮细胞标志物mRNA表达量升高(CD31、eNOS、Flk-1升高倍数分别为2.541±0.146、2.364±0.175、2.538±0.100),差异均有统计学意义(P＜0.05).Dil-Ac-LDL摄取实验提示诱导后的细胞具有吞噬低密度脂蛋白的能力;划痕实验观察到诱导组空白处距离为282.01±3.84,未诱导组空白处距离为450.35±1.86,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 大鼠阴茎海绵体MDSCs在VEGF和bFGF的共同诱导下可分化为内皮细胞,且具有成熟内皮细胞的功能.     

靶向人肝素酶短发卡状RNA表达载体的构建及其沉默作用

目的 构建靶向人肝素酶(HPSE)的短发卡状RNA(shRNA)表达载体,探讨其基因沉默作用.方法 根据人肝素酶mRNA序列设计shRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil-1载体,转化扩增后进行测序鉴定;重组质粒在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下,瞬时转染人胃癌细胞株SGC-7901、人前列腺癌细胞株PC-3、人膀胱癌细胞株EJ,每种细胞分别设空白对照组、空载体pGenesil-Negative转染组、pGenesil-HPSE shRNA转染组3组,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测各种细胞中肝素酶基因表达水平,黏附实验和transwell小室实验检测癌细胞游走、侵袭能力.结果 所构建的shRNA载体插入基因片段与设计序列完全匹配,载体构建成功;重组质粒转染SGC-7901、PC-3、EJ细胞后,肝素酶mRNA表达分别下调78.6%(P<0.01)、82.6%(P<0.01)、81.9%(P<0.01),肝素酶蛋白表达分别下调76.4%(P<0.01)、85.9%(P<0.01)、83.3%(P<0.01),细胞黏附能力分别下降37.7%(P<0.01)、44.6%(P<0.01)、43.8%(P<0.01),细胞侵袭能力分别下降66.8%(P<0.01)、76.6%(P<0.01)、80.5%(P<0.01).结论 成功构建了靶向人肝素酶的shRNA表达载体,沉默肝素酶基因表达后,能抑制多种癌细胞的游走和侵袭能力.     

含人β1转化生长因子短发夹RNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建含人β1转化生长因子(TGF-β1)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的复制缺陷型腺病毒载体.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)法将带有TGF-β1 shRNA 序列构建至U6启动子(U6sh TGF-β1)下游,与T载体连接,将质粒转化人大肠杆菌.将U6sh TGF-β1连到穿梭质粒pDC316上,与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1、3Cre共转染293T细胞,得到重组腺病毒载体(rAd TGF-β1).经PCR鉴定正确后,进行扩增、纯化、滴度测定及感染性鉴定.结果 PCR法得到目的 片段U6sh TGF-β1,经测序,序列与设计方案完全一致.rAd TGF-β1具有良好的感染性,腺病毒滴度可达107.3TCID50/ml.双引物PCR法鉴定Ad TGF-β1可扩增出腺病毒E2b区片段及特异性片段U6sh TGFβ1.结论 成功构建了能表达TGF-β1 shRNA 的重组腺病毒载体rAd TGF-β1(A)及对照载体rAdTGF-β1(B),可能为临床应用RNA干涉--新的基因技术防治瘢痕疙瘩提供高效的方法.     

转化生长因子β1短发夹RNA对白蛋白刺激人肾近曲小管上皮细胞细胞因子表达的影响

目的 研究pcDU6载体质粒介导的转化生长因子β1（TGF-β1）短发夹RNA（shRNA）对人血清白蛋白（HSA）致人肾近曲小管上皮细胞（HK2细胞）增殖，TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）和纤连蛋白（FN）表达的影响，并探讨有关机制。方法 构建TGF-β1shRNA的pcDU6载体质粒，体外培养HK2细胞株。采用脂质体转染将表达TGF-β1shRNA的pcDU6质粒载体（pcDU6-A1-A2和peDU6-B1-B2）分别导人实验组细胞。用HSA（5g／L）刺激HK2细胞12h或24h。四甲基偶氮唑盐（MTF）比色法测定细胞增殖水平。RT-PCR半定量分析HK2细胞中TGF-β1、CTGF和FNmRNA的表达水平；双抗夹心酶联免疫吸附法检测HK2细胞培养液中TGF-β1及FN蛋白质水平。结果 HK2细胞在HSA刺激下，其TGF-β1、CTGF及FNmRNA的表达明显上调，培养液中TGF-β1和FN的蛋白质含量亦明显升高（P〈0．05）。与pcDU6空载体组比较，pcDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA干扰组TGF-β1、CTGF及FNmRNA的表达明显下调（P〈0．05）。TGF-β1shRNA转染HK2细胞后12h或24h，细胞培养液中TGF-β1和FN蛋白质含量明显下降，HK2细胞增殖被部分抑制（P〈0．05）。在细胞增殖、TGF-β1、CTGF及FN基因表达方面，TGF-β1shRNA干扰组组间比较，以及pcDU6空载体转染组与HSA刺激组比较，差异均无统计学意义。结论 peDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA能够明显抑制HSA刺激下HK2细胞增殖、TGF-β1、CTGF和FN基因的表达。HSA刺激HK2细胞增殖及CTGF和FN基因的过表达可能通过TGF-β1介导。     

转化生长因子-β1及其Ⅱ型受体在肝细胞癌中的基因表达

目的 探讨转化生长因子－β１（ＴＧＦ－β１）及其Ⅱ型受体（ＴＧＦ－βＲⅡ）在肝细胞癌中的基因表达。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ和免疫组化技术,分别检测３０例肝癌组织和癌旁肝组织中ＴＧＦ－β１及ＴＧＦ－βＲⅡ在ｍＲＮＡ和蛋白水平的表达。结果 （１）ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ阳性表达,在肝癌组织中为２４／３０,癌旁肝组织中为２６／３０,Ｐ〉０．０５;但ＴＧＦ－β１蛋白水平在肝癌组织阳性表达低于癌旁肝组织（Ｐ〈０．０     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

靶向性蛋白激酶B1和环氧合酶-2 shRNA腺病毒载体的构建和在人胃癌细胞的表达

目的 构建靶向性蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)和环氧合酶-2(COX-2)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,观察其在人胃癌细胞株SGC-7901中的表达.方法 利用同源重组技术构建重组腺病毒载体pGSadeno-Akt1+COX-2(pGSadeno-A+C),经酶切及测序鉴定后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组rAd5-A+C腺病毒,并测定病毒的滴度.体外转染人胃癌细胞株SGC-7901后,Real-time PCR和蛋白印迹分别检测Akt1和COX-2 mRNA和蛋白质的表达.结果 成功构建rAd5-A+C重组腺病毒,测定包装的病毒滴度为1.0×1010pfu/ml.转染组Akt1和COX-2 mRNA表达明显下调,其△Ct值分别是(12.26±0.05)和(5.41±0.09),比rAd5-HK空载组(10.63±0.02)、(3.75±0.08)和对照组(10.57±0.02)、(3.73±0.08)增高(P<0.01),而空载组和对照组比较ΔCt值无明显变化(P>0.05).同样转染组Akt1和COX-2蛋白表达量与空载组和对照组比较分别下调70.5%和63.7%(P<0.01),空载组和对照组比较Akt1和COX-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 靶向性Akt1和COX-2的shRNA腺病毒载体可以特异性抑制Akt1和COX-2的表达,可能成为胃癌靶向性Akt1和COX-2基因治疗的新策略.     

鼠转化生长因子-β1基因的克隆及其在成骨细胞中的表达

目的 克隆鼠转化生长因子－β１（ＴＧＦ－β１）基因并研究其在转染的成骨细胞中表达情况。方法 采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）可从大鼠淋巴细胞中扩增出１．２ｋｂ特异性片段,经酶切鉴定证实为鼠ＴＧＦ－β１ ｃＤＮＡ。将此片段插入５．４Ｋｂ的ｐｃＤＮＡ表达载体,构建得到６．６Ｋｂ的ｐｃＤＮＡ－ＴＧＦ－β１重组质粒。应用脂质体介导的基因转移技术将ＴＧＦ－β１表达载体导入鼠成骨细胞,４８ｈ后用ＳＡＢ     

沉默RANK真核表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的构建沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK,筛选沉默RANK的最佳干扰序列。方法针对小鼠RANK基因设计并合成3对干扰序列,将其连接到真核表达载体pSuper上,酶切及测序鉴定正确后命名为pSuper-shRANK,后将其用脂质体瞬时转染小鼠骨髓巨噬细胞,用荧光显微镜观察转染情况,用Real-timePCR和Westernblot分析干扰效率。结果酶切分析与测序结果表明重组载体pSuper-shRANK构建成功,脂质体共转染后,Real-timePCR和Western blot分析结果显示shRANK-3干扰效果最好,干扰效率达88.7%,筛选出shRANK-3为最佳干扰序列。结论成功构建了沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK;筛选出了沉默小鼠RANK的最佳干扰序列,为研究抑制该基因在破骨细胞分化及活化作用机制中奠定了基础。     

大鼠小肠转化生长因子β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的构建可调控性大鼠小肠TGF-β1表达的重组腺病毒载体。方法按RNA提取试剂（TRIzol Reagent）说明书步骤从大鼠小肠组织抽提总RNA，克隆TGF-β1基因；经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接，鉴定后在HEK293细胞包装。获得高滴度病毒后。取上清检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达，观察目的基因的表达情况。结果扩增出与预期大小一致的cDNA片段，其中TGF-β1大小为1173bp；其基因序列与GenBank登录的大鼠TGF-β1基因序列完全一致。重组TGF-β1腺病毒获得的滴度约为10nPFU／ml；病毒包装后绿色荧光蛋白表达的检测结果显示，绿色荧光蛋白随着时间的延长，表达量逐渐增高；与预期结果一致。结论构建的可调控性大鼠小肠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达，为进一步研究TGF-β1干扰树突状细胞分化成熟诱导小肠移植免疫耐受提供了依据。