未成熟树突状细胞联合雷帕霉素诱导小鼠肤移植免疫耐受

状细胞组、联合组的皮肤移植物存活时间分别为(6.9±1.9)、(10.3±3.0)、(17.0±3.4)、(20.8±3.6)d.方差分析提示组间差异有统计学意义(P＜0.05);S-N-K检验提示各组之间的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 供者骨髓来源未成熟树突状细胞可诱导小鼠皮肤移植免疫耐受;联合使用雷帕霉素可延长免疫耐受的持续时间.     

雷帕霉素对大鼠心脏移植的免疫抑制效果

为了探讨雷帕霉素对ＳＤ、Ｗｉｓｔａｒ大鼠心脏移植的免疫抑制效果，将大鼠分为３组，实验组给ＲＰＭ，对照且包括未治疗组及环孢素组。结果显示ＲＰＭ为一强效免疫抑制剂，治疗优于ＣｓＡ。ＲＰＭ具有强大的免疫抑制效果，可显著延长心脏移植物的存活时间。     

雷帕霉素对肝移植大鼠皮下移植瘤生长的影响

目的探讨雷帕霉素对肝移植大鼠皮下移植瘤生长的影响。方法建立大鼠肝移植模型后实验分为五组,Ⅰ组:以Wistar大鼠作为供体,SD大鼠作为受体,术后不接受任何治疗作为急性排斥对照组。Ⅱ组:以SD大鼠作为供体及受体,术后3 d在左肩胛区皮下接种腹水瘤Wlaker- 256细胞,生理盐水灌胃作为皮下肿瘤生长的对照组。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组:均以Wistar大鼠作为供体,SD大鼠作为受体,术后分别服用环孢素(每日20mg,/kg体重,灌胃)、他克莫司(每日1 mg/kg体重,灌胃)和雷帕霉素(每日1 mg/kg体重,灌胃),术后3 d在左肩胛区皮下接种腹水瘤Wlaker-256细胞。每周3次记录Ⅱ-Ⅴ组受体大鼠皮下肿瘤生长情况,绘制成瘤曲线;并于皮下接种肿瘤后14 d处死大鼠,检测受体大鼠的肝功能、移植肝病理及皮下肿瘤大小。结果与急性排斥大鼠(Ⅰ组)比较,接受免疫抑制剂治疗的各组受体大鼠(Ⅲ～Ⅴ组)均未出现严重的急性排斥反应;同时,与生理盐水灌胃的同基因肝移植术后皮下荷瘤大鼠(Ⅱ组)比较,雷帕霉素明显抑制了大鼠皮下肿瘤的生长[(1.41±0.87)与(3.65±0.87)cm3,P<0.05],环孢素及他克莫司则促进了皮下肿瘤的生长[(9.56±2.81)与(3.65±0.87)cm3,P<0.01;(8.11±1.69)与(3.65±0.87)cm3,P<0.01]。结论雷帕霉素在有效保护移植物的同时抑制了移植受体体内肿瘤的生长;环孢素和他克莫司抑制了机体的排斥反应,但也同时促进了受体体内肿瘤的生长。     

雷帕霉素对人骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察雷帕霉素(RAPA)对人骨肉瘤细胞U-2OS和Saos-2增殖和凋亡的影响并探讨其机制.方法 体外培养骨肉瘤细胞株U-2OS和Saos-2;噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测不同浓度雷帕霉素对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响;Western blot检测雷帕霉素作用后骨肉瘤细胞Fas蛋白表达的变化.结果 MTT检测显示雷帕霉素可抑制入骨肉瘤细胞增殖,在雷帕霉素浓度达到20 nmol/L时,抑制作用显著提高(P＜0.05),增殖抑制率分别达到31.2％和28.7％.流式细胞检测显示在雷帕霉素浓度达到20 nmol/L时,其诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用显著增强(P＜0.05).Western blot检测显示经雷帕霉素作用48 h后的骨肉瘤细胞Fas蛋白的表达明显增强.结论 雷帕霉素对入骨肉瘤细胞株U-2OS和Saos-2的增殖有抑制作用并可诱导其发生凋亡,其可能是通过上调Fas蛋白的表达而发挥作用的.     

转染RhoA基因对树突状细胞抗胃癌功能的影响

目的 研究转染RhoA基因对树突状细胞(DC)免疫功能的影响,观察修饰后的DC在体外诱导高效而特异的抗胃癌免疫效应.方法 用增强型绿色荧光蛋白标记的RhoA重组腺病毒载体作为介质,将RhoA基因转染入DC,用RT-PCR法检测培养上清RhoA基因的表达.检测这种DC分泌细胞因子IL-12、TNF-α的功能,以及表面分子CD1α、CD83、MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达,用MTT法诱导人特异的细胞毒性T淋巴细胞的能力. 结果培养上清中均可以检测到RhoA基因表达;在这种转基因DC的上清中IL-12、TNF-α 含量分别为(301±24)和(418±64)pg/ml,明显比非转染的DC组高,P＜0.05;转基因DC表面高表达CD1α(70.13±0.03)、CD83(68.10±0.03)、MHC-Ⅱ(69.73±0.13)、CD80(78.73±0.25)、CD86(74.20±0.05),而在非转染的DC中是低表达的;经转染RhoA基因的DC提呈的T细胞对胃癌细胞的杀伤率为87%,而未修饰的DC杀伤作用较低. 结论RhoA基因转染修饰的DC能诱导细胞毒性T淋巴细胞的特异性,显著地提高DC的抗原提呈功能,在体外能诱导高效而特异的抗胃癌免疫效应.     

衣霉素诱导内质网应激对树突状细胞成熟分化的影响

目的:内质网应激(ERS)是真核细胞中普遍存在的适应性应激反应,本研究应用ERS特异性诱导剂衣霉素(TM)体外刺激小鼠脾脏树突状细胞(DC),观察DC功能状态的改变情况.方法:分离正常BALB/c小鼠脾脏DC进行体外培养,给予ERS特异性诱导剂TM刺激,观察不同剂量、不同作用时间TM刺激与DC表面共刺激分子表达及分泌功...     

雷帕霉素在临床肝移植中应用的进展

1999年9月，美国食品与药品管理局(FDA)批准雷帕霉素(Rapamycin，Sirolimus)用于防治临床肾移植的急性排斥反应。目前，大多数关于雷帕霉素在移植方面应用的报道来自肾移植。在分析雷帕霉素在肝移植的应用时，必须考虑到肝移植与肾移植的明显不同。首先，肝移植受者的免疫抑制剂需要量较肾移植受者少，这样，较低的药物水平也表现出不     

不同细胞因子诱导对树突状细胞体外分化的影响

目的 观察不同细胞因子诱导对于体外培养的树突状细胞(DC)免疫刺激活性的影响.方法 通过1000 U/ml人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和500 U/ml白细胞介素(IL)-4体外诱导的人单个核细胞来源的DC,经1000 U/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α、1 mg/L脂多糖(LPS)、1 mmol/L丁酸钠、细胞因子鸡尾酒法诱导成熟,分别以流式细胞仪、FITC-Dxtran内吞检测、混合淋巴细胞反应(MLR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DC的表面标志、内吞能力、刺激淋巴细胞增殖能力和IL-12分泌的变化.结果 鸡尾酒法诱导下的DC成熟标志显著上调,内吞能力减弱186.74±38.66,刺激淋巴细胞增殖能力增强18.23 ±2.22,并且IL-12的分泌能力增加(656.18±38.52)ng/L,说明其显著促进DC成熟.而丁酸钠诱导下的各项成熟指标均下调,导致DC免疫刺激源性减弱.结论 细胞因子鸡尾酒法是诱导DC成熟的最佳方法;而丁酸钠可以抑制DC成熟,改变DC的免疫状态.

Abstract：

Objective To investigate the immune effect of different cytokines on immature dendritic cells (DC) in vitro. Methods The human monocyte-derived DCs were induced in the presence of recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF, 1000 U/ml) and interleukin (IL)-4 (500 U/ml). The effects of tumor necrosis factor (TNF) -α (1000 U/ml) , lipopolysaccharide (LPS) (1 mg/L), the cocktail of cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2) , and sodium butyrate (1 mmol/L) on the DCs were detected by flow cytometry (FCM), endocytic activity, T cells stimulatory proliferation capacity, and IL-12 production. Results The cocktail of cytokines could up-regulate the major histocompatibility complex (MHC) class Ⅱ and costimulatory molecules of DCs, decrease the endocytic activity 186. 74 ±38. 66, induce a stage of Tcell stimulation 18. 23 ± 2. 22 and promote the T helper cell type 1-skewing factor IL-12 production (656. 18 ±38. 52) ng/L. But the sodium butyrate induced reverse result on DCs compared to cocktail of cytokines. Conclusion The most effective method for inducing dendritic cells maturation was cocktail of cytokines. The sodium butyrate could inhibit the development of mature DCs, resulting in impaired DC function, and modify the outcome of the subsequent immune response.     

树突状细胞的诱导及在慢性髓性白血病中的应用

本文就树突状细胞的特性，各种细胞因子及其组合以及钙载体在树突状细胞诱导产生中的作用和树突状细胞在慢性髓性白血病中的作用特点做一综述。     

RNA干扰沉默雷帕霉素靶蛋白基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的 构建靶向雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的RNA干扰表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖活性的影响。方法 根据大鼠mTOR基因序列设计2个短发夹环RNA（shRNA）序列，化学法合成单链寡核苷酸序列，将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN，脂质体介导转染包装细胞PT67后获得mTOR的重组逆转录病毒shRNA表达载体，感染VSMC，Northern blot和Western blot法检测mTOR及其下游底物真核细胞启动子4E结合蛋白（4E-BP1）、p70s6k等表达的变化，流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化，噻唑蓝（MTT）法检测VSMC增殖活性的改变。结果 shRNA序列插入pLXIN载体并感染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR的mRNA和蛋白产物表达，mTOR通路下游的核糖体蛋白S6激酶（p70s6k）表达相应减少，而4E-BP1的表达却显著增强；感染前VSMC细胞G1／Go期比例为71％，S期为15％，凋亡细胞为2％；转染后72h，G1／岛期比例为87％，S期为6％，凋亡细胞为6％（P＜0．01）；表明G0／G1→S过程受阻，VSMC的分裂、增殖受到抑制，凋亡机制启动，更多细胞停滞在G0／G1期。结论 成功构建靶向mTOR基因的shRNA表达载体，能够明显抑制VSMC分裂、分化和增殖。     

大鼠骨髓来源树突状细胞体外培养体系的优化

目的 探讨优化大鼠骨髓来源树突状细胞(DC)体外培养体系的方法.方法 应用重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant rat GM-CSF,rrGM-CSF) 20 μg/L和重组大鼠白介素(recombinant rat interleukin,rrIL)- 4 10 μg/L诱导分化Lewis大鼠...     

IKK2dn转染树突状细胞诱导产生的CD4+CD25-T细胞的筛选及鉴定

目的 探讨从转染IKK2dn并负载供者抗原的未成熟树突状细胞(imDC)诱导产生的调节性T细胞(Treg)中筛选CD4+ CD25 - Treg的方法,并进行鉴定.方法 Lewis大鼠骨髓源性imDC,转染IKK2dn后负载供者BN大鼠抗原,与Lewis大鼠T细胞进行体外混合淋巴细胞反应(MLR)诱导产生Treg,用免疫磁珠法(MACS)筛选出CD4+ CD25 -T细胞,流式细胞仪(FCM)检测细胞纯度.加入CD4+ CD25 -T细胞行再次MLR检测其抑制T细胞增殖的作用.结果 经MACS筛选,CD4+ CD25 -T细胞纯度为(95.78±1.25)％.再次MLR结果显示CD4+ CD25 -T细胞组的吸光度值为(0.106±0.006),低于BN抗原组(0.189±0.007)、Adv0-CD4+T细胞组(0.419±0.014)及第三方供者抗原组(0.200±0.008),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 转染IKK2dn并负载抗原的imDC诱导产生的Treg,经MACS筛选可以获得高纯度的CD4+CD25-T细胞,对同种T细胞增殖具有针对供者的特异性免疫抑制作用.     

腹膜透析患者血中树突状细胞数量及活性研究

目的:了解腹膜透析患者血中树突状细胞(DC)的数量及活性.方法:取正常人23例和尿毒症患者21例外周血,患者分为未透析和腹膜透析组,分离外周血单个核细胞,细胞因子[粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)]体外诱导培养,流式细胞仪检测细胞表面标志表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定DC分泌白介素12(IL-12)的量;混合淋巴细胞反应评价细胞的抗原递呈能力.结果:与正常组比较,尿毒症患者血中DC表达CD1a、CD11c、CD123、CD40、CD80、CD83较低, 腹膜透析组DC表达CD1a、CD11c、CD123接近正常,但表达CD40、CD80、CD83仍较低(P<0.05);尿毒症患者DC分泌IL-12减少及刺激淋巴细胞增殖的能力均减低 (P<0.01).结论:尿毒症患者血中DC数量减少且不成熟,抗原递呈功能缺陷,腹膜透析患者DC数量正常,但DC抗原递呈活性仍低.     

小鼠骨髓源性树突状细胞的体外诱导培养及功能分析

目的:建立小鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)体外培养和扩增方法,为以DCs为靶点的免疫治疗研究提供基础。方法:从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中提取骨髓细胞,以含重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,400U/ml)和IL-4(200U/ml)的RPMI 1640(含10%FBS)进行诱导培养,于培养第4天加入脂多糖(LPS)继续培养2d。利用倒置相差显微镜和透射电子显微镜观察细胞生长状态和超微结构,流式细胞术鉴定培养第6天时DCs纯度及免疫表型,流式细胞微球捕获芯片技术检测第2、4、6天培养上清中细胞因子IL-6、IL-10、巨噬细胞趋化因子-1(MCP-1)、干扰素-1(IFN-1)、TNF-α、IL-12p70含量。结果:重组小鼠GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓细胞4d,加入脂多糖(LPS)继续培养2d,近90%细胞高表达DCs特征性标志物CD11c,高表达抗原提呈分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86、CD80,具有典型的树突状形态学特征和分泌炎症性细胞因子IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α和IL-12p70的功能。结论:小鼠骨髓细胞以重组小鼠GM-CSF和IL-4体外诱导培养的DCs具有较高的纯度,保持了体内的形态学、免疫表型及功能特征。     

白三烯C4增强小鼠骨髓来源树突状细胞迁移及肿瘤免疫治疗作用

目的应用白三烯C4（LTC4）调节体外培养DC表面CCR7表达，观察对其迁移能力和抗肿瘤免疫作用的影响。方法体外培养小鼠骨髓细胞来源DC，负载乳腺癌抗原后，加入LTC4培养。检测其表型、CCR7表达及其功能的变化。结果与对照组相比，LTC4组DC表达CD80、CD86增高，CCR7mRNA和蛋白表达上调（P〈0．05），但MLR和CTL活性不受影响。LTC4使DC对其配体CCL19反应性增强（P〈0．05）。在乳腺癌动物模型中，LTC4培养DC抑制肿瘤生长作用比对照组好。结论以LT巳培养可以通过增强DC表面CCR7表达，促进其在体内迁移能力，提高抗乳腺癌DC疫苗的功效。     

霉酚酸酯对未成熟树突状细胞抗原递呈功能的影响

目的研究霉酚酸酯(MMF)在体外对小鼠未成熟树突状细胞抗原递呈功能的影响。方法在骨髓来源未成熟树突状细胞的培养过程中加入MMF，表型鉴定之后，做抗原递呈功能分析，观察抗原特异性增殖反应、混合淋巴细胞反应以及T淋巴细胞抗原特异性低反应性。结果以MMF处理的未成熟树突状细胞向T淋巴细胞递呈可溶性抗原的能力减弱，在同基因型的树突状细胞和T淋巴细胞接触条件下不能刺激致敏T淋巴细胞的有效增殖；MMF处理的树突状细胞在体外的同种混合淋巴细胞培养反应中能够维持树突状细胞于未成熟状态，不能充分活化CD4^ T淋巴细胞和诱发TH1反应，诱导了T淋巴细胞对同种抗原的低反应性；MMF处理的树突状细胞诱导的T淋巴细胞低反应性具有同种抗原特异性。结论在体外培养过程中给予MMF干预能够降低未成熟树突状细胞的抗原递呈能力，增强同种未成熟树突状细胞的免疫耐受诱导作用。     

慢性乙型肝炎患者DC/CIK体外经HBsAg活化后自体回输的疗效和对机体免疫的影响

目的研究慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血来源的树突状细胞(DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)自体回输治疗的疗效和对机体免疫的影响。方法 95例CHB患者随机分为3组,即A组(33例),行DC/CIK治疗;B组(22例),行核苷酸类抗病毒治疗;C组(20例),未进行抗病毒治疗。用CHB外周血培养和扩增DC和CIK,成熟前给予HBsAg刺激。自体静脉回输(DC/CIK细胞数量109/100 ml),1次/3 d,共3次。各组均于治疗前、治疗后第1、3、6、12个月分别检测肝功能、HBV DNA、IFN-γ、IL-4和IL-12水平。其中IFN-γ、IL-4和IL-12均采用双抗体夹心ELISA法进行检测。结果治疗前各组患者病毒载量无显著差异。治疗各阶段B组患者血清HBV DNA水平均低于A组和C组患者(P均<0.001);A组患者治疗后3、6个月时病毒载量显著下降(P均<0.05)。各组患者治疗前后ALT和TBil水平差异无统计学意义。治疗后1个月后,A组患者血清IL-12水平显著高于B组和C组(9.32±2.07 pg/ml vs6.96±2.17 pg/ml,9.32±2.07 pg/ml vs 7.32±2.36 pg/ml,P<0.05),其他时间阶段各组比较,IL-12水平差异无统计学意义。各组患者之间血清IFN-γ、IL-4水平差异均无统计学意义。结论 DC/CIK细胞治疗对HBV有一定的抑制作用;推测DC/CIK细胞治疗对辅助T细胞的失衡无显著影响。     

前列腺素E2对小鼠树突状细胞迁移能力及抗乳腺癌免疫作用的影响

目的观察前列腺素E2（PGE2）对体外培养的乳腺癌抗原负载小鼠树突状细胞（DC）迁移能力及抗乳腺癌免疫作用的影响.方法用重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组小鼠白细胞介素-4培养BALB/c小鼠骨髓来源DC,负载乳腺癌抗原后加入PGE2,进行表型、CCR7mRNA及蛋白、同种异体混合淋巴细胞反应、特异性淋巴细胞（CTL）杀伤活性测定.将TM40D接种于小鼠左侧胸壁皮下制作乳腺癌动物模型,1周后皮下接种PGE2组及对照组DC,观察肿瘤抑制状况.结果体外实验显示,PGE2不影响DC的刺激淋巴细胞增殖能力和同种异体特异性杀伤活性.与对照组DC相比,PGE2培养组DC的CD80、CD86阳性细胞数增多,CCR7mRNA和蛋白表达上调（P＜0.05）.体外趋化试验显示,PGE2使DC对其配体CCL19和CCL21反应性增强（P＜0.05）.在乳腺癌动物模型中,PGE2培养组DC抑制肿瘤生长作用优于对照组.结论PGE2可以通过促进DC成熟并促进其体内迁移能力,提高抗乳腺癌DC疫苗的功效.     

转染增殖细胞核抗原肽表位融合白细胞介素-18基因的树突状细胞对T细胞增殖的影响

目的 观察转染增殖细胞核抗原(PCNA)肽表位、白细胞介素(IL)-18融合基因的树突状细胞(DCs)对T淋巴细胞增殖的诱导作用.方法 实验分为DCs组、空载体组、PCNA肽表位基因转染组、PCNA肽表位融合IL-18基因转染组共4组,分别将空质粒(pIPES-EGFP)、PCNA肽表位质粒[pIPES-EGFP-PCNA(6)]和PCNA肽表位融合IL-18基因质粒[pIRES-EGFP-PCNA(6)/IL-18]通过脂质体转染DCs.每组按照DCs∶T淋巴细胞1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80的比例分为4个浓度梯度,将DCs与T淋巴细胞共培养.采用CCK-8法检测T细胞增殖.结果 各组DCs均能刺激T淋巴细胞增殖,DCs∶T为1∶10时,转染pIPES-EGFP-PCNA(6)/IL-18的DCs刺激指数为2.62,优于DCs组(1.70)、空载体组(1.78)和pIPES-EGFP-PCNA(6)组(1.93).结论 转染pIRES-EGFP-PCNA(6)/IL-18的DCs刺激T淋巴细胞增殖的作用最强,DCs:T为1∶10时最佳.

Abstract：

Objective To investigate the proliferation activity of T lymphocytes induced by dendritic cells modified by proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-Epitope and interleukin (IL)-18 genes.Methods The experiment was divided into four groups, including DCs group, empty vector group, PCNAEpitope transfection group and PCNA-Epitope plus IL-18 gene group, and every group was assigned to four EGFP), PCNA-Epitope plasmid [pIRES-EGFP-PCNA(6)] and plasmid loaded PCNA-Epitope and IL-18 gene [pIRES-EGFP-PCNA(6)/IL-18] were transfected into peripheral blood-derived dendritic cells, then cocultured with T lymphocytes respectively. T lymphocytes proliferation was determined by CCK-8 assays.Results The index of stimulation of the pIRES-EGFP-PCNA(6)/IL-18 group was 2. 62 when the ratio transfection group (1. 93). Conclusion DCs treated with the PCNA-Epitope and IL-18 gene could stimulate T lymphocytes proliferation more effectively,and the optimal rio of DCs:T was 1:10.