表皮生长因子受体/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶途径在三苯氧胺耐药人乳腺癌细胞株MCF-7形成中的作用

目的 观察表皮生长因子受体( EGFR)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)途径在三苯氧胺(TAM)耐药人乳腺癌细胞株MCF-7形成过程的变化,及抑制该途径对肿瘤细胞周期的影响.方法 用1×10-7 nmoL/L的三苯氧胺诱导、建立三苯氧胺耐药细胞(TAM-R)细胞株,以荧光定量逆转录聚合酶链反应( fqRT-PCR)、Western blot法、流式细胞术检测MCF-7与TAM-R细胞中EGFR mRNA、p-AKT蛋白的表达及TAM-R细胞给予EGFR及AKT抑制剂后对细胞周期的影响.结果 TAM-R细胞中EGFR mRNA和p-AKT蛋白的表达较MCF-7显著提高(P＜0.05);给予ZD1839和SH-6阻断EGFR/AKT信号通路后,p-AKT表达受到抑制(P＜0.05),TAM-R细胞的G0～G1期比例提高,其中20 μmol/L ZD1839组高达88％,细胞增殖指数下降(P＜0.05).结论 EGFR/AKT信号通路在MCF-7细胞对TAM耐药的形成中提供了非雌激素途径的生长信号.     

腺病毒介导的靶向survivin的siRNA上调乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体表达

目的 探讨腺病毒介导的靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体(ER)表达的影响.方法 构建靶向survivin的siRNA腺病毒载体并转染乳腺癌MCF-7细胞,采用Western blot法检测MCF-7细胞转染腺病毒后survivin、ER表达的变化.结果 实验组、阴性组、空白组survivin的表达强度分别为0.09 ±0.04、0.86±0.08、0.82 ±0.17;ER的表达强度分别为1.57 ±0.09、1.16±0.10、1.23±0.01.统计学分析表明,本研究中所构建的靶向survivin的siRNA腺病毒载体可以高效地抑制survivin的表达,抑制survivin的表达可以显著上调乳腺癌MCF-7细胞ER的表达(P＜0.05).结论 在乳腺癌MCF-7细胞中,survivin与ER信号通路之间可能存在着某种相互调节机制,提示靶向survivin的siRNA在ER阳性乳腺癌的内分泌治疗中可能具有潜在的重要意义.     

c-Src在TAM治疗耐药的人乳腺癌MCF-7细胞株中的表达及其意义

目的:探讨c-Src在乳腺癌三苯氧胺(TAM)中耐药的表达及意义.方法:用Western blot法检测TAM治疗耐药与敏感的两种人乳腺癌MCF-7细胞中c-Src的表达及其磷酸化水平;用c-Src阻滞剂PP2处理两种细胞后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法检测细胞凋亡情况.结果:与TAM敏感MCF-7细胞比较,TAM耐药MCF-7细胞c-Src的表达量及其磷酸化水平均明显增高;PP2处理后,TAM敏感MCF-7细胞的富集指数(EF)及细胞凋亡率高于TAM耐药MCF-7细胞(均P＜0.05).结论:c-Src在TAM治疗耐药的人乳腺癌MCF-7细胞株中处于高表达及高活性状态,并可能参与乳腺癌内分泌治疗耐药的机制.     

乳腺浸润性导管癌中CD74的表达及临床意义

目的:研究乳腺浸润性导管癌中CD74的表达及其临床意义.方法:用免疫组化技术检测45例乳腺浸润性导管癌组织中CD74,雌激素受体(ER),孕激素受体(PR)及c-erbB-2的表达,分析CD74表达与ER,PR及c-erbB-2表达及临床病理特征和预后的关系;观察乳腺癌MB-MDA-435细胞(高侵袭性),MCF-7细胞(低侵袭性)和转染CD74表达质粒的MCF-7细胞中CD74蛋白的表达,并用Transwell小室检测3种细胞的侵袭能力.结果:乳腺浸润性导管癌中,CD74的表达量与病理分级有关(P＜0.01),癌细胞分化愈差则CD74表达愈高;CD74在受体阳性组中的表达率明显低于受体阴性组(P＜0.01);三阴乳腺癌中CD74的阳性表达率明显高于非三阴乳腺癌组(P＜0.01);CD74阳性患者淋巴结转移率明显高于阴性表达者(P＜0.01);CD74表达阳性与否与患者的5年生存率未见明显关系性.高侵袭性MB-MDA-435细胞CD74蛋白表达量明显高于低侵袭性MCF-7细胞;MCF-7细胞转染CD74表达质粒后侵袭能力明显增强.结论:CD74可能在乳腺癌的侵袭和淋巴结转移中起着重要作用,并有可能成为一种潜在的高侵袭性乳腺癌特别是三阴乳腺癌的标志物.     

CD326在乳腺癌细胞系的表达及其与乳腺癌细胞耐药的关系

目的 探讨上皮细胞黏附分子(CD326)在乳腺癌细胞系中的表达及其与乳腺癌细胞耐药的关系.方法 流式细胞仪分析MCF-7、MCF-7/ADR及MDA-MB-231中cD326表达情况;细胞计数法(CCK-8法)检测流式细胞仪分选获得的CD326阳性和阴性细胞亚群体外对表阿霉素、多西他赛耐药情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同细胞亚群中多药耐药基因(MDR1)及乳腺相关耐药基因(BCRP)的表达情况.结果 MCF-7/ADR中CD326的表达(31.03%)明显高于亲本株MCF-7(27.02%),MDA-MB-231中CD326的表达(33.43%)明显高于MCF-7及MCF-7/ADR;MCF-7和MDA-MB-231中CD326阳性细胞亚群对表阿霉素及低浓度多西他赛(0.25～1.0*IC50)的体外耐受性明显高于阴性细胞亚群(P＜0.01),但对高浓度多西他赛(1.5～2.0* IC50)的体外耐受性差异无统计学意义(P＞0.05);CD326阳性与阴性细胞亚群间MDR1、BCRP基因表达差异元统计学意义(P＞0.05).结论 CD326与乳腺癌化疗药物的耐药有关,其诱导耐药并不是通过经典的耐药途径.     

ERβ蛋白在原发性乳腺癌中的表达及其意义

采用免疫组化PV 90 0 0法检测 46例原发性乳腺癌组织中的ERβ蛋白的表达 ,分析ERβ蛋白与乳腺癌临床病理生物学参数的关系。结果示 46例原发性乳腺癌组织中 ,ERβ的阳性表达率为5 8.7% (2 7/ 46) ,ERβ与ERα表达相关 ,在ERα( )组和ERα(-)组中其阳性表达率分别为 71%和3 3 .3 % ,两组差别有显著性 (P <0 .0 5 )。ERβ的表达与患者的年龄、绝经与否、肿瘤大小、淋巴结状况、组织学分级及PR均无关 (P >0 .0 5 )。ERβ表达与ERα相关 ,提示其在原发性乳腺癌的预后与内分泌治疗耐药中可能有一定价值     

Ad-p53对乳腺癌阿霉素耐药细胞株多药耐药基因1/P-gp表达的影响

目的 观察腺病毒介导的p53基因(Ad-p53)逆转乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药作用及其对MDR1 mRNA/P-gP表达的影响.方法 以人乳腺癌MCF-7细胞及其阿霉素耐药株MCF-7/Adr为实验对象,以50 MOI Ad-p53感染MCF-7/Adr细胞,CCK-8法观察Ad-p53对多药耐药的逆转作用,实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测MDR1 mRNA变化,免疫荧光组织化学及Western blot检测P-gP蛋白表达的变化.结果 50 MOI Ad-p53能使MCF-7/Adr细胞阿霉素IC50由(4.54±0.91)mg/L降到(0.26±0.11)mg/L,逆转耐药倍数为18.1倍(P《0.01);MDR1 mRNA相对表达量由1.32下降至0.85(P《0.01),P-gP蛋白表达量亦下降.结论 Ad-p53具有对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药的逆转作用,其可下调MDR1 mR-NA/P-gP表达.     

GSDME启动子甲基化通过细胞焦亡调控乳腺癌细胞化疗敏感性

目的探讨GSDME启动子甲基化通过细胞焦亡调控乳腺癌(breast cancer, BC)细胞化疗敏感性的机制。方法收集经过化疗治疗的54例BC患者组织, 分为化疗耐受组与敏感组。使用多西他赛(docetaxel, DTX)处理BC细胞以建立耐药BC细胞。CCK8检测细胞耐药性。qRT-PCR检测组织与细胞中GSDME的表达。亚硫酸盐测序法检测GSDME启动子甲基化位点的甲基化水平。干预DTX处理的BC细胞中的GSDME的表达水平, qRT-PCR检测细胞中Caspase-1、Caspase-4、IL-1β、IL-18水平, 评估细胞焦亡程度。结果相对于化疗敏感组, GSDME在化疗耐受组中的表达下调(t=6.54,P<0.001)。与MCF-10A细胞相比, MCF-10A/DTX细胞中Caspase-1(t=9.14,P<0.001)、Caspase-4(t=9.35,P<0.001)、IL-1β(t=6.13,P=0.004)、IL-18(t=5.49,P=0.005)水平均下降, 但在MCF-10A/DTX细胞中过表达GSDME后以上指标上调。GSDME启动子...     

Notch1在人乳腺癌细胞中的表达及其与乳腺癌耐药的关系

目的 检测乳腺癌细胞株MCF-7与MCF-7/ADR的 Notch1 表达、成球能力、干细胞池比例及干细胞内Notch1的表达,探讨Notch1 在逆转乳腺癌化疗耐药中的意义.方法 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot 法检测乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADR 及表型为ALDH1+/CD44+/CD24- 乳腺癌干细胞中Notch1 的表达;无血清培养检测MCF-7及MCF-7/ADR 的成球能力;流式细胞仪检测MCF-7与MCF-7/ADR的干细胞比例并分选干细胞.结果 MCF-7/ADR的Notch1 的表达明显高于MCF-7(0.0748±0.0043比0.0461±0.0022,P＜0.05),微球体形成能力也明显高于MCF-7 (P＜0.05);流式细胞仪检测干细胞比例,MCF-7/ADR高于MCF-7(11.40％比1.89％);分选出的干细胞Notch1 的表达明显高于非干细胞(0.3096±0.0324比0.0428±0.0061,P ＜0.05).结论 Notch1 在乳腺癌及乳腺癌干细胞中高表达,干预Notch1 可能可以逆转乳腺癌治疗的耐药.     

雌激素受体亚型对人乳腺癌细胞株MCF-7生物学特性的影响

目的构建雌激素受体(ER)亚型ERα/ERβ不同表达状态的人乳腺癌细胞株MCF-7,观察其生物学特性。方法采用RNA干扰技术沉默ERα或ERβ基因表达,获得不同ERα或ERβ表达状态的MCF-7细胞株。运用MTT法、流式细胞术、RT-PCR法、双层软琼脂集落形成实验和体外细胞黏附实验方法检测细胞增殖、凋亡、体外成瘤和黏附能力。结果 构建稳定表达ERαlow/ERβhigh或ERαhigh/ERβlow的MCF-7细胞株。ERα基因沉默后,细胞生长减慢,受阻于G0~G1期,细胞凋亡增加,体外成瘤能力和黏附能力减弱;ERβ基因沉默后,细胞生长加快,S期细胞比例增加,细胞凋亡受到抑制,体外成瘤能力增强,而黏附特性无变化。结论 ERα基因沉默可抑制肿瘤的形成;而ERβ基因沉默可促进肿瘤生长、侵袭和转移。调节ERα/ERβ表达状态可能会成为一种有效的乳腺癌治疗手段。     

N-乙酰氨基半乳糖转移酶7在乳腺癌中的表达及临床意义

目的检测N-乙酰氨基半乳糖转移酶7(GALNT7)在乳腺癌与正常组织和细胞中的表达,并分析其表达水平与临床病理特征间的关系。方法采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-QPCR)法检测GALNT7在40对乳腺癌组织和癌旁正常组织中的表达,运用Mann-Whitney法分析乳腺癌组织中GALNT7表达与患者临床病理特征之间的相关性。培养乳腺癌细胞株(MCF-7和MDA-MB-231)和正常乳腺上皮细胞株(MCF-10A)并采用实时荧光定量PCR方法检测GALNT7表达量。结果 GALNT7在乳腺癌组织中的相对表达量为1.09917±0.01756,癌旁正常组织为0.65218±0.07652,两组比较差异有统计学意义(P0.01),且乳腺癌组织中GALNT7表达量与患者ER受体表达呈负相关(P=0.016),与其他临床病理资料如年龄、肿瘤大小、PR和HER-2受体表达、临床分期及淋巴结转移无相关关系(P0.05)。GALNT7在乳腺癌细胞系中的表达量高于正常乳腺上皮细胞系(P0.001),且ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的GALNT7表达量是ER阳性乳腺癌细胞系MCF-7的2.06倍(P0.05)。结论 GALNT7在乳腺癌组织和细胞株中均高表达,其在乳腺癌组织和细胞系中的表达与ER受体的表达密切相关,GALNT7与乳腺癌的发生发展相关。     

c-Src 介导的ERα 与EGFR 互作关系在乳腺癌三苯氧胺耐药中的作用

目的：探讨雌激素受体（ER）与表皮生长因子受体（EGFR）的关系及其在乳腺癌三苯氧胺（TAM）治疗耐药中的作用与机制。 方法：选用TAM治疗敏感（TAM-S）与耐药（TAM-R）的两种人乳腺癌MCF-7细胞,用免疫沉淀（IP）法检测ERα和EGFR在两种细胞中的结合情况,以及c-Src与前两者的结合情况,并用Western blot法检测两种细胞中c-Src的磷酸化水平;c-Src阻滞剂PP2处理两种细胞后,IP法再次检测ERα和EGFR结合情况。 结果：ERα和EGFR在两种细胞中均以复合物的形式结合,但在TAM-R细胞中的结合量明显高于TAM-S细胞（P<0.05）;c-Src与ERα、EGFR在两种细胞中均以复合物的形式结合,其磷酸化水平在TAM-R细胞中明显高于TAM-S细胞（P<0.05）;PP2阻断c-Src的活性后,两种细胞中ERα和EGFR结合量均降低,且在TAM-R细胞中的降低程度明显大于TAM-S细胞（P<0.05）。 结论：ERα和EGFR之间存在结合的现象,且两者的互作关系可能在乳腺癌TAM治疗耐药中起了重要作用,而c-Src的活化（磷酸化）是可能是介导了两者结合的关键机制。     

DJ-1 shRNA靶向逆转人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药性

目的探讨干扰癌基因DJ-1表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM多药耐药性(multi-drug resistence,MDR)的影响。方法将构建的DJ-1 shRNA真核表达载体,用脂质体转染至人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM;用RT-PCR和Western blot法分别检测细胞MDR 1 mRNA和P-糖蛋白(P-glycopro-tein,P-gp)的表达;MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性。结果 DJ-1 shRNA靶向干预MCF-7/ADM细胞DJ-1表达后,DJ-1 shRNA组细胞MDR 1 mRNA和P-gp表达水平较空白与阴性对照组明显下降(P0.0 1);细胞内Adriamycin浓度明显增加;细胞对Adriamycin的敏感性增强2.6 8倍。结论 DJ-1shRNA可降低乳腺癌MCF-7/ADM细胞的MDR,为研究逆转乳腺癌化疗耐药提供了新方法。     

去甲二氢愈创木二酸对乳腺癌细胞系ERα和ERβ mRNA表达水平的调节及对增殖的影响

目的探讨植物雌激素木质素类物质去甲二氢愈创木二酸(NDGA)对乳腺癌细胞系MCF-7中雌激素受体(ER)α、ERβmRNA的调节作用,及对其增殖的影响,探讨木脂素类植物雌激素是否通过选择性ER调节剂的机制起作用。方法培养乳腺癌细胞系MCF-7,用不同浓度NDGA处理细胞系3 d后,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,观察不同剂量NDGA对两种ER亚型表达的影响。结果NDGA中等、较大剂量时对MCF-7细胞系的增殖有明显抑制作用。实时荧光定量PCR结果表明NDGA处理细胞系3 d后ERα表达先下降后上升,ERβ表达渐上升。结论木脂素类植物雌激素NDGA明显抑制乳腺癌细胞系MCF-7的增殖,且能够改变其ER不同亚型的表达,ER表达趋势改变提示NDGA具有ER调节剂的作用。     

肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对人乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA (siRNA)对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP4基因siRNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力.结果 人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-35、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株TROP-2 mRNA分别是1.362±0.057、2.207±0.056、2.997±0.052、0.136±0.045、0.122±0.025、0.194±0.028和2.706±0.039,以MCF-7细胞最高;以TROP-2 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附实验结果显示,5、10、20 nmol/L siRNA组黏附率分别为(52.9±2.5)％、(25.6±2.3)％、(12.8±2.2)％(P＜0.01);Transwell实验结果显示,5、10和20 mol/L siRNA组穿过滤膜的细胞分别为78±17、39±15、19±16,而对照组分别为136±25、139±21(P＜0.01).结论 TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力.     

ER基因CpG岛甲基化的表达及其临床意义

目的:研究ER基因表达及CpG岛甲基化状况与胃癌生物学行为和预后的关系.方法:分别应用免疫组化SP法和限制性内切酶PCR法分析91例胃癌ER的表达和30例胃癌ER墓因CpG岛甲基化的状况.结果:胃癌ER阳性率为38%(35/91),其中高分化腺癌10%(3/30),分别与低分化腺癌43%(13/30)、未分化腺癌53%(8/15)、粘液癌63%(5/8)及印戒细胞癌75%(6/8)比较皆具有显著性差异(P＜0.05);伴淋巴结转移组为55%(11/20),未转移组22.5%(9/40),差异有显著性(P＜0.05).正常胃粘膜ER基因CpG岛未甲基化,而胃癌呈高度甲基化40%(12/30)(P＜0.05).结论:ER在胃癌中的表达与浸润、转移有关,ER阳性胃癌生物学行为差,ER基因CpG岛甲基化可能是胃癌中ER失表达的分子机制.     

Cdc42在人乳腺癌细胞MCF-7阿霉素敏感株和耐药株中的表达

目的探讨细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在乳腺癌细胞MCF-7阿霉素敏感株和耐药株MCF-7/Adr中表达的变化以及对细胞耐药性的影响。方法将Cdc42 siRNA转染MCF-7/Adr细胞株后,用RT-PCR和Weastern Blot方法检测MCF-7组,MCF-7/Adr组,MCF-7/Adr siRNA干扰组细胞Cdc42的转录以及蛋白的表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定siRNA处理后阿霉素(ADM)对MCF-7/Adr细胞的杀伤作用;用荧光分光光度计测定细胞内ADM药物浓度。结果 MCF-7/Adr细胞中Cdc42 mRNA及蛋白表达量显著高于MCF-7细胞(P0.05);siRNA干扰后Cdc42表达受到明显抑制(P0.05),并显著提高细胞内ADM的浓度(P0.05)。结论特异性siRNA能明显抑制Cdc42 mR-NA及蛋白表达,并逆转细胞耐药性。     

槲皮素对内分泌耐药乳腺癌三苯氧胺治疗增敏作用的体内研究

目的:探讨槲皮素(QUE)对内分泌耐药乳腺癌三苯氧胺(TAM)治疗的增敏作用。方法:用大剂量TAM冲击法构建TAM耐药乳腺癌细胞株MCF-7/TAM-R并移植裸鼠后,将荷瘤鼠随机分为4组,分别给予溶媒(对照组)、QUE 50 mg/kg 1次/2 d(QUE组)、TAM 5 mg/kg 1次/d(TAM组)、QUE 50 mg/kg 1次/2 d+TAM 5 mg/kg 1次/d(QUE+TAM组)处理,动态观测各组荷瘤鼠的一般情况与瘤体体积的变化,于给药21 d后,处死各组荷瘤鼠,检测瘤体质量及瘤组织ERα、HER-2、pMAPK、MAPK、pAkt、Akt蛋白的表达。结果:给药过程中,QUE+TAM组和QUE组裸鼠摄食减少、体质量减轻,对照组与TAM组裸鼠无明显异常;至第12天开始,QUE+TAM组瘤体生长呈下降趋势,且第21天明显下降(P0.05),其余各组瘤体均呈持续增长。与对照组比较,QUE+TAM组瘤体质量明显减轻(P0.05),而其余两组均无统计学差异(均P0.05);QUE+TAM组和QUE组瘤组织中ERα蛋白高表达,HER-2、pMAPK、pAkt蛋白低表达,而TAM组上述蛋白表达均无明显差异,各组非磷酸化的MAPK、Akt蛋白表达均无明显差异。结论:QUE能恢复内分泌耐药乳腺癌对TAM的敏感性,可能与其下调HER-2及其下游信号pMAPK、pAkt的表达,并上调ERα的表达有关;QUE有潜在的毒副作用,其安全范围及有效剂量有待进一步探讨。     

雌激素受体亚型在人乳腺癌的表达及意义

目的　研究人乳腺癌组织以及癌旁正常乳腺组织中雌激素受体 (ER)亚型ERα和ERβ的表达 ,及其在乳腺癌发生发展中的作用。方法　应用逆转录聚合酶链反应方法检测 30例患者乳腺癌组织以及相应癌旁正常组织中ERα和ERβ的mRNA的表达情况。结果　ERα在人乳腺癌组织的表达明显高于癌旁正常组织 (t=7 399,P <0 0 1) ,ERβ在人乳腺癌组织的表达明显低于癌旁正常组织 (t=- 3 2 36 ,P <0 0 1) ,ERα/ERβ比值在人乳腺癌组织明显高于癌旁正常组织 (t =6 385 ,P <0 0 1) ;没有淋巴结转移的乳腺癌患者ERα/ERβ比值明显高于有淋巴结转移的乳腺癌患者 (t =2 6 0 2 ,P <0 0 5 ) ;在分期较晚的肿瘤ERα/ERβ比值明显低于分期较早的肿瘤 (t =3 75 4 ,P <0 0 5 )。结论　ERα在乳腺癌发生发展过程中与ERβ发挥不同的作用 ,并有可能成为乳腺癌基因治疗的新靶点。