过表达核转录因子Kr(u)ppel样因子4下调胃癌AGS细胞血管内皮生长因子的表达

目的 观察过表达核转录因子Kr(u)ppel样因子4(KLF4)是否下调胃癌AGS细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达.方法 体外培养人胃癌AGS细胞,分为4组:转染空质粒24 h对照组、转染空质粒48 h对照组、转染KLF4表达质粒24 h组、转染KLF4表达质粒48 h组.构建KLF4表达质粒,脂质体LipofectamineTM2000分别转染空质粒、KLF4表达质粒到AGS细胞,24、48 h后提取总RNA和蛋白,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、Western blot法分别检测KLF4和VEGF mRNA和蛋白水平的表达.结果 AGS细胞在24 h转染率为65%-75%,48 h转染率为40%～45%.实验组与对照组转染24、48 h后,KLF4 mRNA的表达量分别为:563.584±250.744比4.997±5.729(P＜0.05);351.852±212.439比2.4420±1.3770(P＜0.05).VEGF mRNA表达量分别为:0.008 929±0.003 810比0.002 294±0.000720(P＜0.05);0.018 375±0.008 263比0.002 193±0.001 698(P＜0.05);胃癌AGS细胞KLF4蛋白表达量显著性增加,相对应地VEGF蛋白表达水平显著性降低(P＜0.05).结论 体外胃癌AGS细胞过表达KLF4导致VEGF mRNA和蛋白表达下调,KLF4可能参与抑制调节胃癌AGS细胞VEGF的表达.     

整合素连接激酶对瘢痕成纤维细胞VEGF的调控作用

目的 探讨整合素连接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)在人瘢痕成纤维细胞中的表达及对成纤维细胞VEGF的调控作用.方法 8例人增生性瘢痕标本采用组织块法分离培养瘢痕成纤维细胞,选取第5～6代细胞备用.实验分为3组①对照组:不做任何处理,只用含10%FCS的DMEM培养液同步培养;②空质粒组:用空质粒转染人瘢痕成纤维细胞;③ILK cDNA表达质粒转染组:用ILK cDNA表达质粒转染人瘢痕成纤维细胞.首先通过免疫细胞化学染色法检测ILKcDNA转染前后成纤维细胞ILK、VEGF的表达变化;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot检测成纤维细胞ILK、VEGF的mRNA和蛋白水平变化;最后采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测3组成纤维细胞上清液中的VEGF蛋白含量.结果 免疫细胞化学染色结果显示瘢痕成纤维细胞胞浆中ILK表达阳性,VEGF表达不明显,经ILK cDNA转染细胞后ILK与VEGF表达均增强;RT-PCR显示ILK cDNA转染组VEGF mRNA表达(0.338±0.060)均高于对照组(0.022±0.001)和空质粒组(0.028±0.005,P＜0.05);Western blot结果显示ILK cDNA转染组VEGF蛋白表达(0.819±0.019)显著高于对照组(0.607±0.033)和空质粒组(0.591±0.024,P＜0.05);ELISA法检测ILK cDNA转染组的VEGF蛋白含量高于其他两组(P＜0.05).结论 ILK可以上调VEGF mRNA及蛋白水平,并且促进成纤维细胞分泌VEGF,ILK可能通过提高瘢痕成纤维细胞合成分泌VEGF而促进增生性瘢痕血管生成.

Abstract：

Objective To explore the expression of intergrin-linked kinase (ILK) and its effect on VEGF expression in fibroblasts from human hypertrophic scar. Methods Fibroblasts were isolated from hypertrophic scar of 8 patients and cultured in vitro. Then the cells were divided into three groups: ① Cells were cultured only in DMEM containing 10% FCS in the control group; ② Cells were transfected with empty plasmid in the empty plasmid group; ③ Cells were transfected with plasmid experessing ILKcDNA in the ILK cDNA plasmid transfection group. First, the expression of ILK and VECF was observed by immunocytochemistry before and after ILK cDNA transfection. Second, ILK and VEGF mRNA expression was investigated by real-time PCR ( RT-PCR). Third, the protein expression of ILK and VEGF was detected by Western blot. Finally, the protein level of VEGF in supernatant of fibroblasts was measured by ELISA. Results Before ILK cDNA transfection, the expression of ILK was positive and the VEGF expression was weak in cytoplasm of fibroblasts . After ILK cDNA transfection, both the expression of ILK and VEGF was enhanced. The level of VEGF mRNA was significantly higher in ILK cDNA transfection group (0.338 ±0.060) than that in control group (0.022 ±0.001) and empty plasmid group (0.028 ± 0. 005 , P ±0. 05 ). The level of VEGF protein was significantly higher in ILK cDNA transfection group (0. 819 ±0. 019) than that in control group (0. 607 ±0. 033) and empty plasmid group (0. 591 ±0. 024, P ＜0. 05). Secretion of VEGF increased remarkably in ILK cDNA transfection group comparing with the other two groups (P＜0. 05). Conclusions ILK could up-regulate the VEGF mRNA and protein level in human scar fibroblasts. It may play an important role in the angiogenesis in hypertrophic scar.     

小干扰RNA特异性沉默c-myc基因对人胰腺癌SW1990细胞生物学影响

目的 观察小干扰RNA(siRNA)沉默c-myc基因的表达对人胰腺癌细胞株SW1990细胞生物学影响.方法 用siRNA沉默胰腺癌SW1990细胞中c-myc基因,用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot技术检测c-myc mRNA及蛋白的表达量;噻唑蓝(MTT)法检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞增殖的影响;膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)双染流式细胞术检测沉默c-myc基因细胞凋亡水平;Transwell细胞迁移实验检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞迁移能力的影响.结果 靶向c-myc的特异性siRNA可以高效抑制人胰腺癌SW1990细胞c-myc基因表达,在mRNA水平(0.263±0.048)较转染对照质粒组(0.970±0.012)明显降低,c-myc蛋白质表达量及细胞增值率均较转染对照质粒组明显降低;转染后48 h c-myc siRNA组细胞凋亡率为(19.90±2.09)％,明显高于siRNA阴性对照组(4.93±0.25)％和空白对照组(4.40±0.34)％;Transwell实验结果示细胞穿膜数c-myc siRNA组[(34.3±1.2)个]较siRNA-NC组[(68.3±5.8)个]和空白组[(72.3±1.2)个]均明显降低.结论 c-myc siRNA能够显著抑制c-myc基因在人胰腺癌SW1990细胞中的表达,降低细胞的增殖和迁移能力,促进细胞的凋亡.     

短发夹RNA干扰质粒与粉防己碱对结肠癌耐药细胞多药耐药性的逆转作用

目的 比较短发夹RNA干扰质粒与粉防已碱对结肠癌LoVo/5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药细胞多药耐药性(MDR)的逆转作用.方法 用粉防己碱和靶向MDR1的短发夹RNA干扰质粒分别对结肠癌LoVo/5-FU耐药细胞进行处理,实验分为对照组(空白对照)、粉防己碱组和转染组(短发夹RNA干扰质粒).应用MTT法检测细胞对5-FU的敏感性;流式细胞仪检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白的阳性表达率;RT-PCR法检测MDR1 mRNA的表达情况;Western blot检测P-糖蛋白的表达情况.多组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验.结果 (1)细胞对5-FU的敏感性:对照组、粉防己碱组、转染组的药物半数抑制浓度( IC50)分别为(7.3±0.3)、(4.4±0.7)、(2.4±0.4) mmol/L,3组比较,差异有统计学意义(F =65.27,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=6.67,P＜0.05).(2)细胞周期的变化:对照组、粉防己碱组、转染组G1期和S期细胞所占比例分别为38.13％±3.75％、51.36％±2.76％、59.24％±4.31％和20.46％±2.23％、14.32％±1.91％、9.40％±1.65％,3组比较,差异有统计学意义(F =25.23,24.37,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=3.67,4.35,P＜0.05).(3)细胞凋亡情况:对照组、粉防己碱组、转染组细胞凋亡率分别为1.32％±0.47％、3.24％±0.26％、5.88％±0.44％,3组比较,差异有统计学意义(F=99.26,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=11.48,P＜O.05).(4)P-糖蛋白的表达:对照组、粉防己碱组、转染组细胞P-糖蛋白的阳性表达率分别为96.9％±2.3％、61.6％±4.9％、76.6％±3.6％,3组比较,差异有统计学意义(F =67.83,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=6.97,P＜0.05).(5)MDR1 mRNA表达情况:对照组、粉防己碱组、转染组细胞MDR1 mRNA的相对表达量分别为1462±161、570±85、233±81,3组比较,差异有统计学意义(F=90.59,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=5.12,P＜0.05).结论 粉防己碱和靶向MDR1的短发夹RNA干扰质粒均能逆转LoVo/5-FU耐药细胞的MDR,且后者逆转作用更强,逆转机制与抑制P-糖蛋白表达及下调MDR1 mRNA表达有关.     

分化和DNA结合抑制因子1基因对乳腺癌细胞株MCF-7增殖活性及分泌血管内皮生长因子的影响

目的 观察分化和DNA结合抑制因子1(Id1)基因对人乳腺癌细胞增殖活性以及分泌血管内皮生长因子(VEGF)能力的影响.方法 将正义、反义Id1基因真核表达载体以及空载体分别转染乳腺癌MCF-7细胞株,经潮霉素筛选获得稳定细胞株;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学染色检测Id1 mRNA及Id1蛋白、VEGF蛋白表达;细胞计数、噻唑蓝(MTT)比色法及流式细胞仪检测细胞增殖活性及细胞周期;酶联免疫吸附试验( ELISA)检测细胞上清液中VEGF浓度.结果 与空载体转染细胞比较,转染正义Id1载体的MCF-7细胞中Id1 mRNA和Id1蛋白、VEGF蛋白表达水平上调,细胞生长加速(P＜0.05);而反义Id1载体转染组细胞Id1、VEGF表达下降,细胞增殖速度降低(P＜0.05).流式细胞检测结果显示,正义Id1转染组增殖期细胞(S+G2+M)比例为(48.45 ±2.97)％,空载体组为(32.40±0.49)％,反义Id1组为(23.08±1.56)％,各组间差异有统计学意义(P＜0.01);3组细胞凋亡指数分别为(3.26±1.28)％、(7.42±1.04)％和(11.83 ±1.59)％,组间差异有统计学意义(P＜0.01);正义Id1转染组细胞上清液中VEGF浓度较空载体组显著增高(P＜0.01),反义Id1组VEGF分泌量则较空载体组显著降低(P＜0.05).结论 Id1基因与乳腺癌MCF-7细胞增殖活性、细胞周期调控及VEGF分泌能力相关.     

LRIG3基因过表达对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原和Ki-67表达的影响

目的 探讨过表达LRIG3基因对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki-67表达的影响及其机制。方法 用携带LRIG3过表达特异性序列和只含空白载体的质粒用慢病毒法感染胶质瘤细胞株U251与U87,筛选稳定株,分别分成实验组和对照组,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测各组细胞LRIG3表达的变化,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测病毒感染后对胶质瘤细胞株U251与U87增殖的影响,用免疫组织化学链霉亲和素生物素复合物(SABC)法分别检测各组细胞中PCNA和Ki-67的表达差异。结果 LRIG3过表达组细胞中LRIG3 mRNA水平与对照组比较分别升高67.6％( U251)和79.9％ (U87),LRIG3蛋白表达水平分别升高62.3％(U87)和91.0％( U251)。MTT法结果显示两实验组细胞增殖率均低于相应对照组。U251细胞对照组PCNA阳性率为(47.81 ±4.67)％,实验组为(27.49±3.17)％,U87细胞对照组PCNA阳性率为(55.50±4.01)％,实验组为(33.60±4.82)％,差异均有统计学意义(P＜0.05)。U251细胞对照组中Ki-67的阳性率为(48.50±6.11)％,实验组为(24.30±3.76)％,U87细胞对照组Ki-67阳性率为(55.20±4.19)％,实验组为(23.50±4.60)％,差异均有统计学意义(P＜0.0l)。结论 LRIG3基因过表达可减少胶质瘤细胞的增殖。     

降钙素基因相关肽促进大鼠BMSCs迁移及VEGF的表达

目的观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在大鼠BMSCs迁移中的作用及对VEGF、血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)表达的影响,探讨CGRP通过BMSCs促进血管生成的作用机制。方法全骨髓法分离、培养SD大鼠BMSCs,采用Western blot法于传代培养1、2、3周时检测BMSCs中CGRP受体(CGRP receptor,CGRPR)蛋白的表达。使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP作用于BMSCs作为实验组,单纯BMSCs作为对照组,在培养72 h时采用细胞趋化实验检测CGRP对BMSCs迁移的影响;在培养1、3、5、7 d采用实时荧光定量PCR检测CGRP作用后VCAM-1 mRNA的表达变化,采用免疫细胞化学染色、Western blot法检测CGRP作用后VEGF的表达变化。结果 Western blot检测示BMSCs稳定表达CGRPR,2周时表达最高。细胞趋化实验显示,实验组CGRP刺激后穿膜迁移细胞数(3.20±1.77)个/HP,较对照组(1.11±0.49)个/HP明显增多(t=4.230,P=0.001)。实时荧光定量PCR检测示,实验组VCAM-1 mRNA表达随时间延长逐渐增加,7 d时最高;实验组3、5、7 d的VCAM-1 mRNA表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞化学染色示,培养1、3 d两组均无阳性染色;培养5、7 d实验组VEGF染色呈阳性,对照组无阳性染色。Western blot检测示,培养1、3 d两组均未检测到VEGF蛋白表达;培养5、7 d实验组VEGF蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05);实验组5 d的VEGF蛋白表达量明显高于7 d(P<0.05)。结论 CGRP能促进BMSCs迁移及VEGF表达,这可能是CGRP调节骨内部血流变化而影响骨代谢的机制之一。     

血管内皮生长因子反义RNA对EC9706人食管癌细胞抑制的作用

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)反义RNA对EC9706人食管癌细胞的抑制作用.方法 用脂质体法将反义VEGFcDNA质粒转染至EC9706人食管癌细胞,用噻唑蓝还原法(MTT法)检测EC9706细胞增殖,免疫组化SABC和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测VEGF蛋白和VEGF mRNA表达水平.流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布.并将转基因EC9706细胞接种于BALB/C裸鼠后肢皮下,4周后观察皮下成瘤情况.结果 被反义VEGFcDNA质粒转染的EC9706食管癌细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达,该细胞VEGF mRNA及蛋白的表达水平降低,但细胞生长增殖能力和增殖周期无明显改变,未发生明显凋亡现象;接种裸鼠28 d后,EC9706-wt组、EC9706-A组及EC9706-E组皮下移植瘤的潜伏期分别为(5.8±2.4)、(12.4±3.6)、(5.3±2.2)d,瘤体重量分别为(2.83 ±0.32)、(0.87±0.14)、(2.62 ±0.68)g,EC9706-A组与其他两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 VEGF反义RNA可抑制EC9706食管癌细胞VEGF表达和裸鼠体内肿瘤生长.     

氧化还原酶基因对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨氧化还原酶基因(WWOX)对甲状腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 将携有WWOX基因的真核表达载体体外转染甲状腺乳头状癌细胞株K1(重组质粒组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(空质粒组)及未经转染(空白对照组)的K1细胞作为对照.合成针对WWOX的靶向小干扰RNA(WWOX siRNA组)转染甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1,以空白细胞(空白对照组)和转染脂质体试剂(脂质体对照组)作为对照组.采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测转染前后WWOX基因mRNA水平.采用Western blot法分析WWOX基因对甲状腺乳头状癌凋亡相关蛋白的影响.结果 重组质粒组细胞中WWOX mRNA能稳定表达,是空质粒组及空白对照组细胞WWOX mRNA表达的4.5倍(P＜0.05).WWOX siRNA组WWOX mRNA表达明显下降,是对照组的0.2倍(P＜0.05).重组质粒组较空质粒组及空白对照组凋亡相关蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).相反,WWOX siRNA组与对照组比较,细胞凋亡相关蛋白表达明显下降(P＜0.05).结论 WWOX基因能促进甲状腺癌细胞的凋亡,其机制可能与激活线粒体凋亡信号通路有关.     

胶质瘤中Hedgehog/Gli1信号通路活性变化与血管内皮生长因子表达的关系

目的 探讨胶质瘤中Hedgehog/Gli1信号通路的活化与肿瘤微血管新生之间的关系.方法 54例手术切除的胶质瘤肿瘤标本,免疫组织化学检测胶质瘤组织中Gli与肿瘤微血管密度(MVD)表达的关系;运用Western blot法及定量聚合酶链反应(PCR)检测U87、SHG44、U251及A172胶质瘤细胞中Gli1与血管内皮生长因子(VEGF)在蛋白及mRNA水平的表达;U87、SHG44中通过环巴胺(Cyclopamine)处理胶质瘤细胞束抑制Hedgehog/Gli1信号通路,观察这一信号通路活性下降后对胶质瘤中VEGF表达的影响.结果 随着Hedgehog/Gli1信号通路中Gli1表达数量的增加,MVD也相应地升高;在胶质瘤细胞株U87、SHG44、U251及A172中,U87及SHG44中Hedgehog/Gli1信号通路的活化程度较高,同时VEGF基因及蛋白的表达水平较高;通过Cyclopamine抑制这一信号通路可明显下调胶质瘤细胞中VEGF的表达,其中5μmol/L Cyclopamine组VEGF的表达分别下降至(33.3±3.3)％(U87细胞),(27.1±3.0)％(SHG44细胞);10 μmol/L组VEGF的表达分别下降至(14.7±29)％( U87),(16.3±2.4)％(SHG44).结论 部分胶质瘤中存在Hedgehog/Gli1信号通路活化,而且这一信号通路活化程度与胶质瘤的血管新生密切相关.     

血管内皮生长因子对关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶的影响

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)对体外培养的关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法 体外培养SD乳鼠关节软骨细胞,用白细胞介素(IL)-1β诱导的方法建立骨关节炎(OA)体外模型,实验分为4组,每组加入不同处理因素进行干预,A组:(正常对照组)不加任何处理因素;B组:10 μg/L VEGF;C组:10 μg/L IL-1β;D组:10 μg/L VEGF+ 10 μg/LIL-1β。采用实时荧光定量PCR( Real Time PCR)检测iNOS mRNA的表达,采用蛋白免疫印迹法( Western blot)检测iNOS蛋白的表达。结果 iNOS mRNA的表达:A组iNOS mRNA无表达,B组(9.64±1.64)、C组(17.27±2.01)及D组(28.93±6.63),3组的iNOS mRNA表达量显著升高,进一步组间比较,D组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平明显高于B组(P＜0.01)及C组(P＜0.05),C组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平高于B组(P＜0.05)。iNOS蛋白的表达:A组iNOS蛋白无表达,B组(0.44±0.12)、C组(0.74±0.07)及D组(1.38±0.38),3组的iNOS蛋白表达量显著升高,进一步组间比较,D组软骨细胞iNOS的蛋白表达水平明显高于B组(P＜0.01)及C组(P＜0.05),C组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平高于B组(P＜0.01)。结论 在OA的发病过程中,VEGF可能通过上调软骨细胞iNOS的表达发挥重要作用。     

LAMP2A和MEF2D在增龄过程中大鼠髓核组织的表达及其意义

目的 探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中LAMP2A和MEF2D的表达及其意义.方法 3、12、24月龄SD大鼠各8只,建立青年大鼠组、中年大鼠组和老龄大鼠组模型,透射电镜检测髓核细胞中自噬体的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法测定髓核组织中LAMP2A和MEF2D的表达.结果 不同年龄组大鼠髓核细胞中均有自噬体的表达;RT-PCR和Western blot法显示LAMP2A在3、12、24月龄组中均有表达(0.91±0.07、1.12±0.11、1.32±0.28和0.45±0.06、0.55±0.08、0.63±0.11),且在老龄组表达较青年组表达明显增高(P＜0.01和P＜0.05),在3、12、24月龄组中,RT-PCR和Western blot法亦显示MEF2D均有表达(0.66±0.10、0.55±0.08、0.52±0.08和0.46±0.03、0.43±0.02、0.41±0.04),且24月龄组表达明显较青年组低(P均＜0.01).结论 自噬存在于椎间盘退变过程中;分子伴侣介导的自噬活性的增加可能与椎间盘退变的发展进程有关.LAMP2A介导的分子伴侣自噬性细胞死亡可能通过MEF2D进行调节.     

消炎痛抑制肝细胞肝癌生长转移的研究

目的 观察消炎痛(Indomethacin)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖侵袭的影响和对裸鼠肝癌生长和转移的抑制作用.方法 (1)体外实验:采用0.2 mmol/L的消炎痛分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、侵袭实验、运动实验和血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达[酶联免疫吸附试验(ELISA)].(2)体内实验:建立转移性人肝癌裸鼠原位模型后,将裸鼠随机分为对照组和消炎痛组.6周后处死动物,测量肿瘤体积,计算抑瘤率、肺转移灶数目及肺转移率.免疫组织化学方法检测VEGF、MMP-2、环氧合酶-2(COX-2)蛋白的表达.结果 (1)体外实验:0.2mmol/L消炎痛明显抑制MHCC97L细胞增殖(P值均＜0.01),消炎痛组穿过人工基底膜(侵袭实验)和上室底膜(运动实验)的细胞数分别为2.2±1.3和4.4±1.1,明显低于对照组(11.4±1.9和12.8±1.8,P值均＜0.01);ELISA法检测发现,消炎痛组VEGF蛋白和MMP-2蛋白含量和对照组比较明显降低(P值均＜0.01).(2)体内实验:对照组、消炎痛组肿瘤体积分别为(1700 ±422)mm3 和(1170±585)mm3(P＜0.05),肺转移率分别为75%和50%(P＞0.05),平均肺转移灶数目分别为2.92±2.07和1.33±1.56(P＜0.05);与对照组比较,消炎痛组的抑瘤率为31.2%.免疫组织化学染色显示,消炎痛组VEGF、MMP-2、COX-2蛋白的表达和对照组比较均有降低(P值均＜0.01).结论 在一定条件下,消炎痛可抑制肝细胞肝癌的生长转移,其作用和抑制VEGF蛋白和MMP-2蛋白的表达有关.

Abstract：

Objective To study the effects of indomethacin on proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma (HCC) cell line MHCC97L with metastatic potential and the effect of indomethacin on the growth and metastasis of HCC. Methods (1) In vitro; Proliferation, Transwell invasion assay, cell motility assay, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) protein activity were evaluated after cells were treated with 0. 2 mmol/L indomethacin. (2)In vivo: Mice bearing xenografts in the liver were randomly divided into control and indomethacin groups. At the end of sixth week, the mice were killed and tumor volume, inhibitory rate, immunohistochemistry assay (IHA) and metastasis were evaluated. Results (1)In vitro; 0. 2 mmol/L indomethacin could inhibit the proliferation of MHCC97L cells markedly (P ＜0. 01). The average amount of invading cells per field in cell invasion assay and motility assay was 2. 2 ± 1. 3 and 4.4 ± 1. 1 respectively in indomethacin group, significantly less than in control group ( 11. 4 ± 1. 9 and 12. 8 ± 1. 8 respectively, P ＜0. 01). The expression of VEGF and MMP-2 in cells treated with indomethacin was significantly lower than in control group (P ＜0. 01). (2)In vivo; Tumor volume, incidence and number of lung metastases in control and indomethacin groups were (1700 ±422) mm3 and (1170 ± 585) mm3 (P ＜ 0. 05), 75% and 50% ( P ＞ 0.05), 2. 92 ± 2. 07 and 1.33 ±1.56 (P＜0. 05) , respectively. Inhibition rate in indomethacin group was 31.2%. IHA showed that the expression of VEGF, MMP-2, and cyclooxygenase-2 ( COX-2) was down-regulated in indomethacin group (P ＜0.01). Conclusion Indomethacin could inhibit the growth and metastasis of HCC, which was in part mediated by down-regulation of VEGF and MMP-2.     

食管鳞癌与细胞因子信号转导负调控因子3及其DNA甲基化的关系

目的 检测食管鳞癌(ESCC)组织中细胞因子信号转导负调控因子3(SOCS3)的DNA甲基化、mRNA及蛋白表达水平,探讨其在食管鳞癌发生、发展、浸润和转移中的作用.方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、Real-Time聚合酶链反应(PCR)和Western blot法分别检测43例食管鳞癌组织中SOCS3的DNA甲基化、mRNA和蛋白表达水平,并与相应的癌旁正常食管组织进行对照研究,分析其与临床病理参数的关系.结果 (1)食管鳞癌组织SOCS3 DNA甲基化的阳性率(79.1%)明显高于癌旁组织(14.0%,P＜0.01);(2)食管鳞癌组织SOCS3 mRNA相对表达强度比值(0.53±0.30)明显低于癌旁组织(1.15±0.44,P＜0.01),食管鳞癌组织中甲基化组的SOCS3 mRNA表达(0.45±0.24)显著低于非甲基化组(0.86±0.29,P＜0.05);(3)食管鳞癌组织SOCS3蛋白表达(1.66±0.22)显著低于癌旁组织(1.83±0.15,P＜0.01),食管鳞癌组织中甲基化组SOCS3蛋白表达(1.61±0.21)显著低于非甲基化组(1.87±0.15,P＜0.01);(4)在TNM分期中Ⅲ期组表达均低于Ⅰ～Ⅱ期组(P＜0.05),伴有淋巴结转移组表达也都低于无淋巴结转移组(P＜0.05),未发现其在性别、年龄、家族史、吸烟史中有明显差异(P＞0.05);(5)食管鳞癌组织中SOCS3mRNA表达及其蛋白表达水平与肿瘤分化级别呈正相关(0.301＜r＜1,P＜0.05),与TNM分期、淋巴结转移呈负相关(-1＜r＜-0.301,P＜0.05).结论 食管鳞癌组织中SOCS3 DNA甲基化阳性率高,导致SOCS3基因表达下调,与食管鳞癌的分化、浸润和转移密切相关.     

MS-275阻断STAT3信号通路诱导U251细胞凋亡

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对脑胶质瘤细胞株U251细胞增殖的影响及促凋亡机制.方法 以不同药物浓度梯度和U251细胞分别共培养24、48、72 h后,应用CCK-8法检测肿瘤细胞增殖,瑞氏-姬姆萨染色法观察细胞形态变化,PI单染法检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI法经流式检测细胞凋亡率,免疫印迹检测STAT3蛋白和PARP蛋白表达.结果 MS-275能显著抑制U251细胞的增殖,药物浓度40 nmol/ml,培养72 h,抑制率为(79.0±1.7)%;经药物作用后,细胞呈现凋亡形态,胞质和胞核浓缩或碎裂;G0/G1期细胞由(66.320±0.456)%降至(38.288±1.242)%(P＜0.01),G2/M期细胞由(19.940±0.580)%升高至(35.650±0.507)%,而后降至(22.343±1.224)%(P＜0.01),亚G0凋亡峰由(0.230±0.035)%增高至(18.393±1.449)%(P＜0.01);总凋亡率由(2.133±0.416)%增高至(29.000±2.307)%(P＜0.01);免疫印迹检测提示磷酸化STAT3表达水平降低,PARP被剪切.结论 MS-275对胶质瘤细胞的增殖抑制作用具有浓度和时间依赖性,它通过阻断STAT3磷酸化,诱导激活Caspase-3凋亡途径.

Abstract：

Objective To investigate the effect of MS-275 on the proliferation of brain glioma cells. Methods U251 cells were respectively cultured for 24, 48, 72 h, with different concentrations of MS-275. CCK-8 assay was used to assess the proliferation of U251 cells. The morphological changes of U251 cells were observed by Wright-Giemsa staining. The cell cycle was analyzed by PI dyeing. The apoptosis rate was assayed by flow cytometry using annexin V-FITC/PI. The protein expression of STAT3 and PARP was detected by Western blotting. Results MS-275 could significantly inhibited proliferation of U251 cells. After treatment with MS-275, apoptosis of U251 cells was seen; The ratio of G0/G1 was decreased from ( 66.320 ± 0.456 ) % to ( 38. 288 ± 1. 242 ) % ( P ＜ 0. 01 ), the percentage of G2/M cells was increased from ( 19. 940 ± 0. 580 ) % to ( 35.650 ± 0. 507 ) %, then decreased to ( 22. 343 ± 1. 224 ) %(P＜0.01), and ratio of sub-G0 was increased from (0.230 ±0.035)% to (18.393 ±1.449)% (P＜0. 01 ); Total apoptosis rate was increased from ( 2. 133 ± 0.416 ) % to ( 29. 000 ± 2. 307 ) % ( P ＜ 0. 01 );The expression level of phosphorylated STAT3 was significantly downregulated, and the cleavage of PARP was detected by Western blotting. Conclusion MS-275 inhibites proliferation of brain glioma cells in a time- and dose-dependent manner, which is achieved by inducing apoptosis.     

人血管内皮生长因子165基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

Objective To establish an effective method of transfecting human marrow mesenchymal stem cells (MSC) with human vascular endothelial growth factor 165 ( VEGF 165) gene. Methods MSCs isolated and cultured in vitro were divided into transfection group (pShuttle-CMV/VEGF 165 plasmid was transfected into MSCs through liposome-mediating method), empty plasmid group (pShuttle-CMV vehi-cle was transfected into MSCs as control), liposome group (liposome was transfected into MSCs as control) and control group(normal culture). Expressions of Mrna and protein of MSCs were determined by RT-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay and Western Blot. Sensitivity to MSCs on VEGF plasmid transfec-tion was detected by MTT test. Results Expression level of VEGF 165 gene Mrna in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively 0.89 ± 0.03, 0. 34 ± 0.04, 0.40 ± 0.03, and 0.30 ± 0.03, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0. 01 ). Content of VEGF protein in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively (778 ± 35 ), (543 ± 24), (561 ± 28), (571 ± 23) pg/Ml, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0.01 ). In the transfection group, expression level of VEGF protein peaked on 7th day after transfec-tion, which was decreased gradually later. In transfection group, expression level of V EGF 165 protein was obviously higher than that of the other three groups ( P <0. 01 ), and no inhibitory effect of VEGF plasmid transfection on MSCs proliferation was found. Conclusions The method for transfecting human VEGF 165 gene into MSCs is established in this research, through which target gene and protein can express effectively.     

血管内皮生长因子在脑胶质瘤中自分泌研究

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)在脑胶质瘤中自分泌现象.方法 采用免疫组织化学及图像分析方法 ,检测74例脑胶质瘤中肿瘤细胞上血管内皮生长因子受体VEGFR1和VEGFR2的表达,取其中42例检测VEGF的表达的情况.结果 VEGF在胶质瘤中表达强度与肿瘤病理级别明显相关(P＜0.05,r=0.331);VEGFR1、2在胶质瘤瘤细胞中表达强度吸光值分别为:正常组织(0.2104±0.0297)和(0.2100±0.0257);WHO I(0.2328±0.0194)和(0.2324±0.0186);WHOⅡ级(0.2533±0.0155)和(0.2514±0.0147);WHO Ⅲ级(0.2709±0.0203)和(0.2720±0.0149);WHOⅣ级(0.2906±0.0282)和(0.2834±0.0285);表达强度与胶质瘤病理级别明显相关(P＜0.01,r=0.748;P＜0.01,r=0.754).结论 在脑胶质瘤中存在VEGF的旁分泌和自分泌现象,并与病理级别有关.