体外稳定表达DMBT1对胆囊癌细胞系GBC-SD趋化迁移的影响

目的 建立稳定表达候选抑癌基因DMBT1(deleted in malignant brain tumours 1)的胆囊癌细胞系GBC-SD,研究其迁移能力并探讨分子机制.方法 以脂质体为介导在体外建立稳定表达DMBTl的胆囊癌细胞系.细胞分组:(1)GBC-SD/DMBT1为转染DMBT1组;(2)GBC-SD/Vector为转染空载体组;(3)GBC-SD为未处理组.免疫组化、Western blot及RT-PCR检测DMBT1蛋白、mRNA表达,确证转染成功,划痕法与Transwell法检测细胞迁移能力,Western blot检测E-钙粘蛋白、CD44V6、CD15等黏附转移分子表达.统计学采用配对或独立样本t检验,P＜0.01为差异有统计学意义.结果 稳定转染后,实验组DMBT1蛋白及mRNA表达较对照组分别提高3.2倍、2.7倍;划痕法显示实验组细胞在迁移距离、迁移速率、迁移面积均显著小于对照组(P＜0.01);Tnmswell法表明转染DMBT1后,迁移细胞数亦显著少于对照组(P＜0.01);免疫印迹表明转染实验组较对照组E-钙粘蛋白表达上调,CD15表达量减少(P＜0.01),而CD44V6、α与β连环素、整合素α5在转染前后表达量无明显差异.结论 在体外成功建立稳定表达DMBT1的胆囊癌细胞系;DMBT1在体外过表达显著抑制GBC-SD的迁移,至少部分依赖于上调E-钙粘蛋白表达,下调CD15表达.     

体外稳定表达DMBT1胆囊癌细胞株GBC-SD的建立及其特性

目的 建立稳定表达脑恶性肿瘤缺失基因1(DMBTl)的胆囊癌细胞株GBC-SD,研究其增殖特点.方法 将DMBTl全长表达质粒以脂质体为介导转染胆囊癌细胞株GBC-SD,G418筛选阳性克隆5～6周,免疫组织化学、Western blot及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测DMBT1蛋白及mRNA表达,噻唑蓝(MTT)绘制生存曲线及、血清下测细胞生存抑制率及免疫荧光观察细胞凋亡.结果 稳定转染后,实验组DMBT1蛋白相对表达量为0.82±0.11,对照组为0.24±0.03,实验组mRNA相对表达量为0.87±0.12,对照组为0.29±0.03,差异均有统计学意义(P<0.01);实验组无明显对数生长期且较早进入衰亡期,在无血清培基中增殖抑制率随时间增高,72 h达(43.3±5.0)%;实验组无血清培基中凋亡率达(22.0±2.5)%,对照组(7.0±1.1)%,差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功在体外建立稳定表达DMBT1的胆囊癌细胞株,DMBT1在体外抑制胆囊癌细胞增殖,无血清下诱导其凋亡.     

细胞周期蛋白D1在三氧化二砷抑制人胆囊癌细胞生长中的作用

目的 探讨细胞周期蛋白(Cyclin)D1在三氧化二砷(As2O3)抑制人胆囊癌细胞体外生长中的作用.方法 不同浓度的As2O3作用于胆囊癌细胞GBC-SD,MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期分布.Western印迹和RT-PCR检测Cyclin D1、D2、D3和CDK4、K6的蛋白和mRNA表达.构建Cyclin D1的表达质粒并转染GBC细胞,观察Cyclin D1过表达时细胞周期的变化.结果 As2O3能抑制胆囊癌细胞生长,作用呈时间、剂量一效应关系;流式细胞仪检测发现As2O3可将增殖过程中的胆囊癌细胞阻滞于G1期;Western印迹及RT-PCR检测显示Cyclin D1表达下降;过表达Cyelin D1逆转了As2O3对细胞周期的改变.结论 Cyclin D1在As2O3抑制人胆囊癌细胞的生长中起重要作用.     

尿液纤维连接蛋白糖链结构在膀胱癌患者中的变化及意义

目的寻求诊断膀胱癌的检测新方法。方法收集8例膀胱癌患者术前和术后3个月（正常）尿液标本16份，提纯纤维连接蛋白（Fn），辣根过氧化物酶（HRP）标记的凝集素作探针，连接到已固定在膜上的Fn糖链，检测已结合的HRP代表Fn糖链与凝集素的结合力，增强化学发光法（ECL）检测已结合HRP的结合力。高效液相（HPLC）和荧光标记底物测定膀胱癌和癌旁正常组织N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT）活力。结果用伴刀豆球蛋白凝集素（ConA）-HRP作探针时，膀胱癌尿液Fn结合力仅为正常膀胱尿液Fn的0．18，而用蔓陀罗凝集素（DSA）-HRP和麦胚凝集素（WGA）-HRP作探针时，膀胱癌组的结合力为正常组的3．34倍和3．26倍。膀胱癌患者尿液中FnN-糖链的天线数和平分型GlcNAc结构都升高。尿Fn与WGA的结合力与病理分期、分级相关。膀胱癌组织GnT-Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的酶活力比癌旁正常组织分别增加34．0、18．1和1．6倍。结论凝集素-HRP检测分析尿液Fn的N-糖链结构改变有可能是一种简单和精确诊断膀胱癌的方法。     

胆汁成核活性蛋白中糖链的致石作用

目的 探讨糖链在胆石形成中的作用。方法 分别将5mg辣根过氧化酶（HRP）标记蔓陀罗凝集素（DSA）、麦胚凝集素（WGA）和伴刀豆凝集素（ConA），鉴定糖链结构与类型，并在透射电镜下观察亲和染色的模拟胆汁泡形态学变化；通过结晶生长试验检测胆汁泡蛋白（0.1g／L）促成核活性及其糖链水解、多肽降解产物的活性改变。结果 胆汁泡蛋白糖链为DSA强结合、ConA(一），属多天线复杂型聚糖。HRP－DSA标记的泡蛋白糖链，直接反映泡蛋白促进胆汁泡聚集、融合及胆固醇单水结晶析出的动态过程。胆汁泡蛋白具明显促成核活性，其It、Ig、Ic分别为0.57、1.52及1.63（P＜0.05）。糖苷酶切、肽链酶解后其成核活性均几乎丧失。结论 糖链可能参与成核效应蛋白的致石作用过程。     

乙酰肝素酶与多配体蛋白聚糖1在胆囊癌细胞中表达的关系及意义

目的:探讨乙酰肝素酶与多配体蛋白聚糖1在胆囊癌细胞中表达的关系及临床意义。方法:将人胆囊癌细胞系GBC-SD转染乙酰肝素酶过表达质粒后,分别采用Western blot和RT-PCR方法以及Transwell侵袭转移试验检测细胞多配体蛋白聚糖1表达量以及细胞侵袭和转移能力的变化。结果:与未转染的GBC-SD细胞比较,转染乙酰肝素酶过表达质粒的GBC-SD细胞的多配体蛋白聚糖1蛋白与mRNA表达量均明显降低,但侵袭性和转移能力明显增强(均P0.05)。结论:胆囊癌细胞中乙酰肝素酶与多配体蛋白聚糖1的表达呈负向关系;乙酰肝素酶高表达能下调多配体蛋白聚糖1的表达,从而增强胆囊癌细胞的侵袭性和转移能力。     

Survivin shRNA表达质粒的构建及其抑制survivin表达的初步研究

目的： 探讨survivin短发夹RNA(shRNA)的表达质粒对胆囊癌细胞survivin mRNA及蛋白表达的抑制作用。方法：构建pshRNA-survivin重组质粒，在脂质体的介导下转染胆囊癌细胞株GBC-SD。RT-PCR分析survivin mRNA的表达;Western blot 检测survivin蛋白表达。结果：PCR和DNA测序证实表达质粒构建成功，并能明显地抑制GBC-SD/survivin mRNA的表达。结论：构建的pshRNA-survivin表达质粒能有效地抑制转染细胞survivin mRNA的表达，从而为肿瘤的生物学治疗提供新的方法和材料。     

胆石症病人和正常人胆汁泡蛋白成核活性及糖链结构的比较

目的 比较胆石症病人和正常人胆汁泡蛋白促成核活性,并分析其糖链结构特点.方法 进行胆固醇结晶生长试验,检测胆石症病人和正常人相对分子质量为33 500的泡蛋白成核时间,并计算其促成核活性.采用HRP凝集素探针介导的Western-Blot印迹法分析不同来源泡蛋白糖链的结构特点.结果 胆石症病人来源的33 500泡蛋白具有明显的促成核活性,其平均成核时间为(3.75±0.66)d,成核活性为0.303±0.075;而正常人来源者则仅具较弱的促成核活性,平均成核时间为(8.38±0.86)d,成核活性为0.677±0.086,两者比较,差异显著(P＜0.05).胆石症病人来源的33 500泡蛋白DSA(+)、ConA(-),属于复杂型多天线聚糖;而正常人来源者为ConA(+)、DSA(-)的二天线糖链.结论 胆石症病人来源的33 500泡蛋白较正常人来源者具有更强的促成核活性,两者糖链结构特点亦有明显不同,提示泡蛋白促成核活性的改变可能由于其糖链结构特点的变化引起.     

RNA激活技术上调p21WAF1/CIP1基因表达对胆囊癌细胞增殖、侵袭与迁移能力的影响

目的利用RNA激活技术上调人胆囊癌细胞(GBC-SD)中p21基因的表达,观察其对GBS-SD细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法将与p21基因启动子DNA序列互补的双链RNA分子(dsRNA)转染入人胆囊癌细胞中,采用RT-PCR法和Western blot分别检测p21基因mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测细胞增殖活性;Transwell小室法检测RNAa后细胞侵袭、迁移能力的变化。结果 dsRNA转染GBC-SD细胞72h后能显著上调p21基因mRNA和蛋白的表达,与空白组和对照组比较,转染dsp21后,GBC-SD细胞的增殖活性明显受到抑制,细胞侵袭及迁移能力明显下降。结论 RNAa技术能有效上调p21基因的表达并抑制细胞的增殖活性,降低其侵袭及迁移能力,为胆囊癌疾病的基因治疗提供依据。     

胆管癌胆汁中糖蛋白的糖链结构特点

目的：探讨与胆管癌相关的胆汁糖蛋白的糖链结构特点。方法：对15例胆管癌胆汁及10例良性胆道疾病的胆汁蛋白进行蛋白质电泳考马斯亮蓝及银染色，并用4种识别不同糖链结构的辣根过氧化酶标记的凝集素（ConA-HRP,WGA-HRP,LCA-HRP,DSA-HRP）进行凝集素印迹分析。结果：胆管癌胆汁和良性胆汁蛋白SDS－PAGE谱基本相同，ConA结合的胆管癌相关糖蛋白有4种（－138，－122，－108，－101kDa)，WGA结合胆管癌相关糖蛋白1种（－201kDa);LCA结合胆管癌相关糖蛋白1种（－122kDa);DSA结合胆管癌相关糖蛋白3种（－201，－163，－122KDa)。结论：胆管癌胆汁中一些糖蛋白的糖链结构发生了改变，主要表现为唾液酸含量增加及天线数，高甘露糖型糖链增多，可能与胆管上皮的恶性转化有关。     

人胆囊癌SP细胞的分离及ABCG2和Oct-4的表达

目的 探索在人胆囊癌细胞系中是否存在具有干细胞特性的SP细胞(side populationcells)以及SP细胞、非SP细胞、GBC-SD细胞系之间在耐药基因ABCG2和胚胎干细胞表面标志Cot-4表达方面的差异性.方法 采用FACS(流式激活细胞分选)技术分选出人胆囊癌SP细胞和非SP细胞.通过RT-PCR、Western blot以及流式技术来检测SP细胞、非SP细胞以及GBC-SD细胞系在ABCG2和Oct-4表达方面的差异情况.结果 人胆囊癌GBC-SD细胞系中存在着具有干细胞潜能的SP细胞.其所占的比例为(0.64±0.08)%,并且ABCG2在胆囊癌SP细胞中呈现出高表达的状态[(89.56±3.86)%],在非SP细胞中几乎不表达[(1.32±0.49)%],两者之间的差异具有统计学意义(P<0.05),在GBC-SD细胞系中呈弱表达[(12.37±1.61)%].Oer-4在三种细胞中的表达分别为:(94.87±1.40)%、(88.16±2.34)%、(90.17±1.61)%,三者之间差异没有统计学意义(P>0.05).结论 人胆囊癌的起源与肿瘤干细胞密切相关并且在胆囊癌细胞系中存在着具有干细胞特性并且高表达耐药基因ABOG2的人胆囊癌SP细胞.     

去甲斑蝥素对人原发性胆囊癌GBC-SD细胞系增殖及相关基因的干预效应

目的　研究去甲斑蝥素 (NCTD)对人原发性胆囊癌GBC SD细胞系增殖及相关基因的干预效应。方法　实验分NCTD组 (7个浓度梯度组 ,每组 6孔 )和对照组 (n =6) ,分别应用四唑盐比色法和链霉素亲合生物素复合物法测定NCTD对体外培养GBC SD细胞的体外杀伤效应和对增殖细胞核抗原 (PCNA)、Ki 67表达的影响。结果　NCTD分别在浓度 10mg/L、时间 6h时 ,即对GBC SD细胞增殖有抑制作用 ,且随浓度升高、时间延长作用增强 ,呈剂量 时间效应关系 ;实验组PCNA和Ki 67表达的棕褐染色细胞数和阳性指数 (PCNA :0 .93 2± 0 .0 3 1vs 0 .3 18± 0 .0 2 3 ;Ki 67:0 .964± 0 .0 92vs 0 .2 97± 0 .0 18;n =10 )与对照组比较均显著减少 (P <0 .0 5 )。结论　NCTD能抑制人原发性胆囊癌GBC SD细胞的生长和PCNA、Ki 67增殖相关基因蛋白的表达。     

人胆囊癌细胞系GBC-SD中侧群细胞的耐药性研究

目的 研究人胆囊细胞系GBC-SD中侧群细胞(side population cells,SP)的耐药特性,并探讨其耐药机制.方法 利用流式细胞术分选SP、非SP细胞,采用MTT检测2种细胞亚群对5种化疗药物吉西他滨、顺铂、5-氟尿嘧啶、表阿霉素、米托蒽醌的药物敏感性;利用流式细胞术检测吉西他滨处理的人胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞比例的变化,并通过RT-PCR、Western印迹检测SP、非SP细胞亚群中ABCG2 mRNA和蛋白的表达.结果 吉西他滨、顺铂、5-氟尿嘧啶、米托蒽醌以对胆囊癌细胞系GBC-SD的IC50浓度分别作用SP、非SP细胞亚群1 d后,SP细胞的增殖能力高于非SP细胞,两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05),而表阿霉素处理水平的两组间差异无统计学意义(P>0.05);人胆囊癌细胞系GBC-SD经过吉西他滨处理3周后,SP细胞的比例显著升高(8.02%±0.13%比0.62%±0.08%,P<0.05),且SP细胞明显高表达ABCG2基因.结论 人胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞具有类似干细胞的耐药特性,耐药基因ABCG2高表达是其耐药的重要机制.

Abstract：

Objective To investigate the drug resistance of side population cells in human gallbladder cancer cell line GBC-SD and explore its mechanism. Methods Drug sensitivity assays of 5chemotherapeutic agents were performed on side population cells (SP) and non-SP cells of GBC-SD.GBC-SD was cultured and then treated with the chemotherapeutic agent gemcitabine. The frequency of SP by FACS was measured. RT-PCR and Western blotting were used to detect the expression of AB-CG2 in both the SP and the corresponding non-SP subsets. Results After 1 d treatment with 4 chemotherapeutic agents (gemcitabine, cisplatin, 5-fluorouracil and mitoxantrone) in IC50 concentration to GBC-SD cell line, the reproductive ability of SP was higher than that of non-SP (P<0.05). However, statistical significance was not achieved when compared with epirubicin (P>0.05). The percentage of SP in GBC-SD treated with chemotherapeutic agent gemcitabine after 3 weeks was sharply elevated by FACS (8.02% ±0.13% vs 0.62% ±0.08%, P<0.05), and the expression of ABCG2mRNA and protein were increased in SP as compared with non-SP. Conclusion SP from human gallbladder cancer cell line GBC-SD, like stem cell, showed a heighten resistance to drugs. Increased expression of ABCG2 was largely responsible for the multi-drug resistance.     

选择性Cox-2抑制剂Celebrex对人胆囊癌GBC-SD细胞系生长的抑制作用

目的: 探讨选择性环氧合酶-2(Cox-2)抑制剂Celebrex对体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞系增殖的影响。方法:采用MTT比色法检测Celebrex对细胞系生长的影响;TUNEL染色法观察细胞凋亡指数,并用流式细胞仪定量分析；透射电镜和荧光显微镜检测细胞凋亡。结果:Celebrex抑制GBC-SD细胞系的生长呈剂量依赖性;40,80,120,160μmol/L浓度的Celebrex对GBC-SD细胞的生长抑制率分别是18.77%,25.32%,46.58%和52.19%（P<0.01）。流式细胞仪定量分析在40,80,120,160μmol/L浓度下的细胞凋亡率分别为（8.51±1.44）%,（12.40±0.87）%,（26.37±1.72）%和（43.21±0.39）%，与对照组（4.87±0.55）%比较有显著的统计学差异；各组间两两比较差异亦有显著性(均P<0.01)。透射电镜和荧光显微镜下能观察到胞核浓缩、碎裂以及凋亡小体的形成。结论:Celebrex 可以有效地抑制人胆囊癌GBC-SD细胞系的增殖并诱导其凋亡。     

CO2气腹对胆囊癌细胞survivin表达的影响

目的探讨CO2气腹对胆囊癌细胞抗凋亡能力的影响。方法建立腹腔镜CO2气腹体外模型,以12mmHg(1mmHg=0.133kPa)的CO2气腹气压对胆囊癌细胞进行不同时间(1,2,3,4h)的处理。设未处理为对照组。采用RT-PCR检测CO2气腹处理后各组细胞survivin mRNA的表达情况。结果当压力为12mmHg时,survivin的表达随气腹处理时间的延长而呈上升趋势(P0.05)。结论在CO2气腹(12mmHg)下作用3～4h能提高胆囊癌细胞的抗凋亡能力。这可能是CO2气腹促肿瘤生长的机制之一。     

胆囊癌细胞株GBC-SD类肿瘤干细胞筛选的研究

目的 筛选胆囊癌GBC-SD系中具有干细胞特性的细胞克隆.方法 在肿瘤干细胞培养基加入不同剂量的顺铂悬浮培养GBC-SD,将悬浮细胞收集后注射裸鼠,并持续瘤内注射顺铂,成瘤后取瘤内细胞继续原培养基培养,获得悬浮生长的克隆,分别测定其干细胞标志物(CD133、CD44、CD24)、耐药基因ABCG2细胞株MDR-1和转录因子OCT-4、Nanog的表达.结果 在肿瘤干细胞培养基和顺铂的筛选压力下,GBC-SD细胞能有效形成悬浮生长的克隆球,流式检测结果表明克隆球高表达CD133+(97.6%)、CD44+(77.9%),低表达CD24+(2.3%),同时表达耐药基因ABCG2和MDR-1,定量聚合酶链反应(PCR)及免疫荧光方法检测发现,与普通胆囊癌细胞株GBC-SD比较,克隆球干细胞基因OCT-4、Nanog表达分别增强266、284倍.结论 顺铂结合无血清培养基悬浮培养法筛选GBC-SD,作为一种新的干细胞分选方法,可以分离出具有肿瘤千细胞特征的胆囊癌克隆球.     

人胆囊癌细胞系GBC-SD侧群细胞致瘤特性的实验研究

目的 研究人胆囊癌细胞系GBC-SD侧群细胞(side population cells,SP)的致瘤特性。方法 利用流式细胞术从GBC-SD中分选SP、非SP细胞(non-SP),分别进行软琼脂克隆形成实验和非肥胖性糖尿病联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的移植瘤形成实验。通过流式细胞术检测5例人胆囊癌组织中SP细胞的比例。结果人胆囊癌细胞系GBC-SD中存在SP细胞,其比例约为0.87％;SP细胞的克隆形成率高于non-SP细胞（14.74％±3.53％比5.17％±1.05％,t=2.75,P＜0.05）。NOD/SCID小鼠移植瘤实验表明,5×103个SP细胞可成瘤(4/7),而non-SP细胞成瘤则需要1×105个细胞(1/7),且来源于SP细胞亚群的NOD/SCID小鼠移植瘤中存在SP、non-SP细胞。SP细胞存在于人胆囊癌组织中,其范围为0.27％～2.3％。结论来源于GBC-SD的SP细胞亚群具有类似肿瘤十细胞的高致瘤性。     

胆囊癌细胞系GBC-SD的生物学行为研究

目的：建立人体胆囊癌细胞系,研究胆囊癌细胞的生物学行为。方法：应用组织块法建立细胞系,通过细胞形态学、增殖动力学、染色体分析、细胞上清液ＣＥＡ、ＣＡ１９－９检测及异种种植等对其生物行为进行研究。结果：ＧＢＣ－ＳＤ细胞以方形、多角形和梭形为主,倍增时间约２１．４ｈ,染色体３７～１４５条,众数８１条,具维持分泌ＣＥＡ、ＣＡ１９－９的功能,裸鼠种植肿瘤与来源肿瘤组织类型相似。结论：ＧＢＣ－ＳＤ是一新的人体胆囊癌细胞系,可作为研究胆囊癌的实验模型。