腺病毒介导p16基因转染对胃癌细胞作用的研究

目的　观察以腺病毒为载体介导 p16基因转染对胃癌细胞 (MGC80 3)生长的影响。方法　重组腺病毒Ad p16感染胃癌细胞 ,观察胃癌细胞生长情况 ;用Ad p16感染胃癌细胞接种于大鼠体内 ,Ad lacZ为对照组 ,每组大鼠 10只 ,观察大鼠接种的阳性率 ;用重组腺病毒Ad p16作用于胃癌大鼠模型 ,Ad lacZ为对照组 ,每组大鼠 10只 ,观察大鼠肿瘤的生长情况。结果　p16可以抑制胃癌细胞生长 ,促进胃癌细胞的凋亡 ,经Ad p16感染的胃癌细胞肿瘤发生率明显下降 (由 90 %降至 2 0 % )。腺病毒介导 p16基因作用胃癌大鼠模型 2周后肿瘤的重量 ( 2 .2 1± 0 .2 6 )g明显低于对照组 ( 5 .6 4± 0 .5 3)g ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。应用免疫组织化学检查可见肿块有明显的淋巴细胞侵润。结论　腺病毒介导 p16基因对胃癌细胞有明显的抑制作用。     

靶向抑制XIAP基因后结肠癌细胞对凋亡诱导配体耐药性的变化

目的 观察应用短发夹RNA(shRNA)干扰质粒靶向抑制X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因后,结肠癌细胞SW1116对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)耐药性的变化.方法 采用脂质体包裹方法,将干扰质粒转染结肠癌细胞SW1116,48 h后检测转染前后XIAP蛋白表达和结肠癌细胞生长活性的变化;应用TRAIL药物25、50、100、200 μg/L梯度浓度作用于结肠癌细胞,24 h后噻唑蓝(MTT)比色法检测抑制XIAP表达后结肠癌细胞对TRAIL敏感性的变化,并利用蛋白印迹方法检测细胞内凋亡相关因子Caspase-3活性的改变.结果 转染干扰质粒后XIAP的表达能够得到有效抑制(抑制率60%),细胞的生长活性得到抑制(抑制率24%),结肠癌细胞对TRAIL的耐药得到逆转,对TRAIL的敏感性显著提高,在200μg/L浓度下细胞生长抑制率可达64%,肿瘤细胞内的Caspase-3的表达活性得到提高.结论 靶向抑制XIAP基因的表达能够恢复和增强结肠癌细胞对TRAIL的敏感性.     

Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA诱导结肠癌细胞凋亡的作用

目的探讨Livin基因和Survivin基因联合靶向小干扰（si）RNA对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响。方法构建Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体并转染结肠癌细胞．通过RT—PCR和蛋白质印迹方法分别检测Livin和Survivin的表达．通过MTT法检测siRNA对细胞增殖的抑制作用．利用流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡效应。结果经酶切鉴定和测序分析证实Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功。这种联合靶向SiRNA对Livin mRNA及蛋白表达的抑制率分别为27．9％和22．3％．对Survivin mRNA及蛋白表达的抑制率分别为32．2％和40．9％。与对照组相比,联合靶向siRNA可降低肿瘤细胞增殖率．增加细胞凋亡率,但其细胞生长抑制作用和促细胞凋亡作用均弱于单独干扰Livin或Survivin基因．结论Livin和Survivin基因联合靶向siRNA能降低结肠癌细胞中Livin和survivin基因的表达．抑制结肠癌细胞的增殖．并诱导结肠癌细胞的凋亡．但此协同抑制作用较单独干扰Livin或survivin基因为弱。     

HRZ三联抗结核药/TGF-β1 siRNA纳米脂质体对体外BCG感染的人巨噬细胞中Ag85A及TGF-β1表达的影响

目的:探讨异烟肼、利福平、吡嗪酰胺(HRZ)三联抗结核药/表皮转化生长因子(TGF)-β1 si RNA纳米脂质体对体外BCG感染的人巨噬细胞中Ag85A及TGF-β1表达的影响。方法:体外培养人单核细胞株THP-1诱导分化成巨噬细胞,分为4组,空白组为单纯巨噬细胞培养;模型组为巨噬细胞与卡介苗(bacillus calmetteguerin,BCG)以1∶5的比例共培养3h,制备BCG感染的巨噬细胞模型;对照组为BCG感染的巨噬细胞与HRZ三联抗结核药纳米脂质体共培养;实验组为BCG感染的巨噬细胞与三种不同浓度的HRZ三联抗结核药/TGF-β1 si RNA纳米脂质体(C1组为35mg/ml,C2组为40mg/ml,C3组为50mg/ml)共培养。采用RT-PCR检测各组人巨噬细胞中Ag85A及TGF-β1的mRNA表达量,Western-blot方法检测Ag85A及TGF-β1的蛋白表达量。结果:与空白组相比,模型组Ag85A和TGF-β1的m RNA及蛋白量表达明显上调(P0.05);对照组中Ag85A的mRNA及蛋白量和TGF-β1的mRNA水平与模型组相比明显下调(P0.05);实验组3种不同浓度(C1组、C2组、C3组)HRZ三联抗结核药/TGF-β1 si RNA纳米脂质体处理后,Ag85A和TGF-β1的mRNA及蛋白表达量与模型组和对照组相比进一步下调(P0.05),随着纳米脂质体浓度的增加,Ag85A和TGF-β1 m RNA及蛋白表达量有明显下降趋势,C1组与C3组相比Ag85A m RNA及蛋白表达量差异有统计学意义(P0.05);C1组与C2组、C3组相比TGF-β1 mRNA及蛋白量表达差异有统计学意义(P0.05);C2组与C3组相比Ag85A m RNA和TGF-β1蛋白表达量差异有统计学意义(P0.05)。结论:HRZ三联抗结核药/TGF-β1 si RNA纳米脂质体对体外BCG感染的人巨噬细胞具有明显的下调Ag85A基因表达作用及TGF-β1基因沉默作用。     

表皮生长因子受体基因沉默介导酪氨酸激酶/信号转导与转录激活因子信号通路对胶质瘤细胞凋亡的调控机制

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因介导酪氨酸激酶(JAK)/信号转导与转录激活因子(STAT)信号通路对胶质瘤细胞凋亡的调控机制。方法:收集甘肃省人民医院2017年1月至2019年6月胶质瘤患者手术切除的胶质瘤组织及瘤旁组织。细胞进行细胞分组与转染,分成7组：Blank组、NC组、oe-EGFR组、小干扰RNA...     

肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞对结肠癌LoVo细胞的杀伤作用

目的 探讨肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞(DC)作为佐剂对结肠癌LoVo细胞系的杀伤作用.方法 反复冻融法裂解培养的结肠癌LoVo细胞,提取细胞抗原并致敏DC,然后将后者与自身T淋巴细胞共同培养,观察其对自身T淋巴细胞增殖的影响以及活化的T淋巴细胞对LoVo细胞的杀伤作用.结果 结肠癌LoVo细胞裂解物致敏的DC能明显促进T淋巴细胞的增殖,后者对LoVo细胞的杀伤作用明显增强.结论 肿瘤细胞裂解物提取方法简单,易于临床实施,其作为细胞抗原致敏DC制备的肿瘤疫苗能有效活化并产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞,将有很好的临床应用前景.     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体诱导人结肠细胞凋亡的研究

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)肿瘤细胞特异性表达载体,观察其对人结肠癌细胞凋亡的作用.方法 利用hTERT基因核心启动子和FADD基因片段,构建hTERT基因启动子调控FADD 的肿瘤细胞特异性表达载体.用脂质体转染法,将其分别转染人结肠癌细胞和正常细胞,观察人结肠癌细胞和正常细胞的端粒酶活性、细胞周期及凋亡.结果 hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体,在所检测的肿瘤细胞中具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性.Colon320细胞、LoVo细胞、SW480细胞与WI-38细胞凋亡率在不同转染时间比较,差异有统计学意义(P均<0.01).WI-38转染pLNCX-hTERT-FADD与pLNCX-hTERT-GFP在24、48、72、96、120h凋亡率比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体可能是一种新的肿瘤治疗途径.     

重组腺病毒介导Fas基因转染瘢痕疙瘩细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的　制备含人Fas基因的重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后 ,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白 ,并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法　Fas基因自PcDNA3 1 Fas质粒中切取 ,应用PDC315载体系统构建携带Fas基因的重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞 ,检测Fas蛋白的表达及功能。结果　成功地构建了携带Fas基因的重组腺病毒 ,感染后瘢痕疙瘩成纤维细胞能稳定表达的有功能的Fas蛋白。结论　利用重组腺病毒转染可以重建被阻断的瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas死亡信号传导通道 ,并再次估证了Fas基因突变与瘢痕疙瘩之间的联系 ,为瘢痕疙瘩基因治疗展示了一条新途径     

老鹳草提取物对Lewis结肠癌瘤株转染的Livin基因影响的实验研究

为研究老鹳草提取物对Lewis结肠癌瘤株转染的C57BL／6小鼠Livin基因表达的影响,探讨其抗转移机制,本研究成功建立了Lewis结肠癌瘤株小鼠皮下移植瘤模型,并将48只小鼠随机分为空白对照组、老鹳草提取物组和羟基喜树碱组,观察各组移植瘤体生长情况,免疫荧光法检测移植瘤组织中Livin基因表达情况。结果显示,与空白对照组相比,老鹳草提取物组和羟基喜树碱组移植瘤体积均缩小（P〈0．01）,移植瘤组织中Livin基因表达均降低（P〈0．01）;但老鹳草提取物组比羟基喜树碱组移植瘤体积缩小及移植瘤组织中Livin基因表达降低更明显（P〈0．01）。结果表明,老鹳草提取物的抗Lewis结肠癌转移机制可能与降低Livin基因的表达有关。     

转染SSTR2对胰腺癌细胞的促凋亡作用

目的 通过包含SSTR2基因的重组腺病毒(AdCAG-SSTR2)转染人胰腺癌细胞,观察对胰腺癌细胞肿瘤特性的影响.方法 分别应用空载体、AdCAG-SSTR2转染SSTR2阴性的人胰腺癌细胞株BxPC-3.逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分析检测SSTR2在细胞中的表达.非转染细胞、转染空载体细胞和转染AdCAG.SSTR2细胞直接计数测定细胞生长速度.采用膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭(Annexin V/PI)标记法检测细胞凋亡.RT-PCR检测PCNA、bax和bcl-xl的表达.结果 AdCAG.SSTR2转染胰腺癌细胞后可以检测到SSTR2 mRNA和蛋白的稳定表达,转染AdCAG-SSTR2后细胞生长受到抑制,与对照组差异有统计学意义(P＜0.01);细胞凋亡率较对照组明显升高(P＜0.01);PCNA的表达无明显变化,是对照组的1.04倍;bax的表达明显升高,是对照组的3.18倍;bcl-xl的表达明显降低,是对照组的0.34倍.结论 SSTR2通过诱导胰腺癌细胞凋亡发挥抗肿瘤增殖的作用,其机制与上调bax的表达,下调bcl-xl的表达有关.     

脆性组氨酸三联体基因转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体基因(FHIT)转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响.方法 将重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT通过脂质体转染技术导入人结肠癌细胞株SW480,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞(SW480-pRc/CMV2)和正常SW480细胞为对照.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测FHIT基因的mRNA转录水平.以奥沙利铂作用于3组细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测奥沙利铂处理前后各组结肠癌细胞的凋亡率及细胞周期的变化.结果 SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;经奥沙利铂处理后,转染FHIT基因的SW480细胞的凋亡水平与空质粒转染组及结肠癌细胞株组比较明显增高(第2、3、4天A值比较P<0.05),并且FHIT基因与奥沙利铂有轻度的协同促进凋亡作用;同时奥沙利铂处理前后实验组结肠癌细胞的生长周期较对照组均出现了明显的G_0/G_1期阻滞,且细胞的生长抑制率存在浓度和时间依赖性.结论 外源性FHIT基因表达与奥沙利铂协同促进SW480细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性.     

导入野生型p53基因对人胶质瘤细胞生长及放疗敏感性的影响

目的　研究野生型p5 3基因对人胶质瘤细胞生长及放疗敏感性的影响。方法　将野生型 p5 3基因导入U 2 5 1细胞 ,通过逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测 p5 3基因的表达。U2 5 1细胞分为 4组 :对照组、转染组、放疗组、转染联合放疗组。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法 )和流式细胞仪检测p5 3基因或 /和放疗 (3、6、9Gy)对U 2 5 1细胞生长抑制及凋亡的影响。结果　通过RT PCR证实了 p5 3基因在U 2 5 1细胞中的表达。MTT检测发现 p5 3基因对U2 5 1细胞的生长抑制率为 (79.60± 5 .69) %。当放射剂量为 3、6、9Gy时 ,U2 5 1细胞的生长抑制率分别为(17.0 6± 4.3 5 ) % ,(17.3 9± 1.67) % ,(18.73± 4.68) %。当 p5 3基因与放疗 (3、6、9Gy)联合作用时 ,抑制率分别为 (80 .60± 5 .3 5 ) % ,(90 .3 0± 1.67) % ,(91.3 0± 2 .0 1) %。p5 3基因转染所产生的U 2 5 1细胞凋亡率为 17.3 8%。放疗 (3、6、9Gy)引起的细胞凋亡率分别为 4.61% ,4.84% ,5 .40 %。当p5 3基因与放疗 (3、6、9Gy)联合作用时 ,凋亡率分别为17.80 % ,2 0 .0 3 % ,2 2 .3 4%。结论　野生型p5 3基因与放疗对人胶质瘤细胞生长有协同抑制作用     

反义基因转染对人膀胱癌细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的观察以腺相关病毒为载体(rAAV)的血管内皮细胞生长因子(VEGF)反义基因对人膀胱癌细胞中VEGF表达的影响。方法通过用不同量(0、20、100μl)的以腺相关病毒为基因载体的反义VEGF基因转染人膀胱癌细胞T24,采用免疫组织化学和Western blot方法,检测转染前后人膀胱癌T24细胞中VEGF的表达变化。结果免疫组织化学图像分析VEGF平均灰度值分别为364．40±30．31、460．25±36．34、494．18±38．82,Western blot蛋白条带灰度分别为 65 800±13 824、52 470±10 589、31 069±8 642。结果均表明随着转染的反义VEGF基因量的增多, T24细胞中VEGF的表达显著减少。结论反义VEGF基因的转染能显著抑制人膀胱癌T24细胞中VEGF的表达,有望成为膀胱肿瘤基因治疗的一种新方法。     

腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究

目的探讨凋亡素基因转染对人胆管癌细胞凋亡的影响,为胆管癌的治疗探索新方法。方法采用含凋亡素基因的重组腺病毒感染胆管癌细胞株QBC939,在确定其感染复数后通过光镜、荧光观察其凋亡情况,同时通过TUNEL染色统计凋亡率。结果胆管癌细胞株QBC939的重组腺病毒的感染复数为65,在感染后第3天凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡,并且随着时间的推移其作用越明显,在第7天凋亡率达到61.9%。结论凋亡素能明显引发人胆管癌细胞的凋亡,在胆管癌的治疗上具有较大潜力。     

Leflunomide对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:检测Leflunomide对结肠癌细胞增殖和诱导凋亡作用。方法:实验采用结肠癌细胞株SW260,与不同浓度的Leflunomide药物(0、5、10、20、40、80μg/ml)共同培养,以MTT方法和流式细胞仪技术检测细胞的增殖状态,用TUNEL染色和流式细胞仪技术检测细胞的凋亡。结果:Leflunomide在对结肠癌细胞增殖具有双重影响,即在低浓度下(5μg/ml和10μg/ml)有轻度的促进结肠癌细胞SW620增殖的作用,而提高浓度后(>40μg/ml)则表现为明显的抑制细胞的增殖作用,并随着剂量增加和作用时间延长,抑制作用更为明显,即存在着时相性和量-效依赖性。结论:Leflunomide可抑制结肠癌细胞增殖和诱导凋亡。可能对结肠癌病人有潜在的治疗作用。     

RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的 观察RNA干扰对大肠癌细胞中人端粒酶逆转录酶基因(hTERT gene)的抑制效应.方法 大肠癌细胞株HT-29分为Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组;将靶向于hTERT基因的小干扰RNA,转染大肠癌细胞;分别检测大肠癌细胞转染前后的端粒酶活性,hTERTmRNA和蛋白水平,细胞生长增殖和凋亡情况.结果 sihTERT转染大肠癌细胞效率为60%;sihTERT组的端粒酶活性值、hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞凋亡率分别为0.73±0.14、0.47±0.08、0.37±0.07、49.5%,sihTERT组与其他三组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 靶向于hTERT的siRNA能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因,下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平,降低端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡.     

热化疗对结肠癌LOVO细胞胞嘧啶脱氨酶基因表达的影响

目的 探讨温热疗法对转染胞嘧啶脱氨酶基因的基因表达的影响.方法 脂质体法将质粒G1CEACDNa转染结肠癌LOVO细胞,G418筛选抗体克隆并扩增,给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC)进行热化疗;以β-actin为内参照用实时荧光定量PCR检测热化疗前后CD基因表达量的变化.结果 实时荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR)检测得到热化疗前CD基因表达的CT值29.5300±1.1974,B.actinct值20.8200±2.7385;热化疗后CD基因表达的CT值30.285±1.201,β-actinet值21.225±2.237;行ΔΔCt法进行相对定量比较差异无统计学意义(P＞0.05,t=1.4521,v=38).结论 温热疗法对转染G1CEACDNa的LOVO细胞CD基因的表达无明显影响.     

Cortactin过表达对结肠癌细胞转移能力的影响

目的:通过诱导皮层肌动蛋白(cortactin)的过表达分析其在结肠癌细胞侵袭迁移以及肝转移过程中的作用。方法:构建含CTTN基因和绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体,转染293T细胞。取含CTTN基因和绿色荧光蛋白的病毒上清液转染结肠癌细胞株SW1116使cortactin稳定表达。蛋白印迹实验检测cortactin的表达,通过Transwell实验评估结肠癌细胞侵袭迁移能力的改变。利用SW1116细胞株使裸鼠皮下成瘤,取肿瘤组织种植新一批裸鼠结肠壁并观察结肠癌肝转移的情况。结果:成功构建cortactin过表达的SW1116细胞。侵袭和迁移实验中,过表达组穿膜细胞数分别为(147±12)个、(286±17)个,而阴性对照组为(83±10)个、(112±11)个,空白对照组为(75±7)个、(103±9)个,后两组与过表达组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:上调cortactin的表达能显著促进结肠癌细胞的侵袭迁移和肝转移能力,提示cortactin在结肠癌的转移过程中发挥重要作用。     

应用结肠癌基因表达谱数据整合分析筛选肿瘤相关基因

目的 通过结肠癌基因表达谱数据整合分析筛选肿瘤相关基因.方法 基因芯片技术构建的结肠癌基因表达谱与转录组公共数据库SAGE DGED信息相结合,筛选肿瘤相关基因.定量聚合酶链反应(PCR)验证基因差异表达.组织芯片(腺癌22例、腺瘤20例、正常8例)和免疫组织化学技术检测基因蛋白表达.结果 119条基因(上调17条、下调102条)在基因芯片与SAGEDGED中表达变化结果一致.定量PCR检测TGFBI、NME1、IFITM3、FCGBP和TSPAN1基因表达,结果与基因表达谱数据一致.IFITM3蛋白表达在结肠腺瘤(20%,4/20)和腺癌(55%,12/22)中表达较正常结肠组织(0,0/8)明显升高(P<0.05).结论 基因芯片数据和SAGE DGED相结合,可快速、准确筛选结肠癌肿瘤相关基因.     

肿瘤坏死因子凋亡诱导配体诱导结肠癌细胞凋亡的机制

目的探讨肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(TRAIL)诱导结肠癌细胞发生凋亡的机制。方法流式细胞仪技术、酶联免疫吸附技术、荧光显色技术检测500μg／L TRAIL和／或Caspase抑制剂Z-VAD．fmk处理后,结肠癌细胞SW1116在不同时点(0、2、4、6、24 h)凋亡情况、Caspase-3酶活性及4 h线粒体△ψm、cardiolipin、细胞ROS变化。结果 TRAIL可引起结肠癌细胞凋亡,并于 4 h达凋亡高峰,凋亡指数为32．98％;并出现线粒体△ψm下降、cardiolipin丢失增加及Caspase-3酶活性增加,4 h达到最大峰值为(37．56±2．572)μmol／L·hr-1·mg-1蛋白。但TRAIL所诱导的细胞凋亡作用可被Caspase抑制剂Z-VAD．fmk所抑制。同时证实TRAIL所诱导的结肠癌细胞凋亡与细胞氧自由ROS的生成无关。结论 TRAIL通过Caspase依赖方式引起线粒体△ψm下降、cardi- olipin丢失增加导致线粒体内膜损伤,从而诱导细胞发生凋亡。