抗汉滩病毒双链抗体重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达

目的应用Bac—to-Bac杆状病毒表达系统构建具有抗汉滩病毒(HTNV)G2糖蛋白(GP)鼠源性mAb 3G1与抗HTNV核蛋白(NP)鼠源性mAb 1A8嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达抗HTNV双链抗体并对表达产物进行初步鉴定。方法构建含有嵌合基因的杆状病毒表达载体ScFv-pFBD-ScFv‘,转化DH10Bac致敏菌,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上,快速筛选出含有抗HTNV双链抗体嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中进行表达,并利用间接免疫荧光试验检测表达产物。结果构建了含抗HTNV双链抗体嵌合基因之重组杆状病毒,并在昆虫细胞中表达出特异性抗体,该抗体能被兔抗人Q抗体所识别并可与HTNV NP和GP特异性结合。结论成功地在昆虫细胞中表达出抗HTNV双链抗体,且该抗体具有与HTNV NP抗原和GP抗原结合的活性。     

在昆虫细胞表达汉坦病毒的核蛋白及其在血清检测中的初步应用

杆状病毒是应用广泛的真核表达系统 ,利用杆状病毒核多角体启动子 ,可以在昆虫细胞高效表达外源基因。由于在昆虫细胞中表达的蛋白可以进行翻译后修饰 ,是表达汉坦病毒结构的理想系统。我们用昆虫细胞分别表达了姬鼠型和家鼠型汉坦病毒的糖蛋白和核蛋白 ,并进行了检测抗体的研究。使用PCR分别扩增姬鼠型汉坦病毒A9株、家鼠型汉坦病毒L99株的M和S片段编码区序列 ,克隆到昆虫细胞表达穿梭质粒pAcUW5 1,在杆状病毒核多角体启动子控制下。将质粒转Sf9细胞 ,通过 3轮空斑筛选重组病毒 ,用Western blot和免疫荧光证实了这些基因在昆虫细胞得…     

我国D2—43株PrM—E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性研究

目的 通过观察含我国登革2型病毒株（D2－43）的PrM-E基因的复制型SFV重组质粒DNA的免疫原性,为登革新型疫苗的研制提供依据。方法 将PrM-E基因自T载体上切下,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中。将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK21细胞,表达产物的特异性用间接免疫荧光法进行鉴定。采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA,然后以不同剂量通过肌肉注射途径免疫Balb/c鼠,鼠血清中的抗体用间接免疫荧光法进行检测。结果 含PrM-E基因的重组SFV质粒DNA在BHK21细胞中可表达登革2型病毒的特异蛋白;经免疫Balb/c鼠后,鼠血清可与登革D2－43感染的C6／36抗原片起特异的抗原抗体反应。结论 含登革2型病毒PrM-E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb/c鼠中可诱导登革2型病毒特异抗体的产生,但抗体水平较低。     

重组人凝血因子Ⅷ在昆虫表达系统的分泌表达及鉴定

目的克隆人凝血因子Ⅷ（Human Coagulation FactorⅧ,rhFⅧ）基因cDNA,利用bac-to-bac杆状病毒表达系统制备具有高凝血活性rhFⅧ。方法利用PT-PCR和overlap PCR技术扩增人FⅧ基因,亚克隆至转移载体pFastBac HTB,进一步转化至感受态细菌DH10Bac（含穿梭载体Bacmid）中,同源转座、氨苄青霉素及蓝白斑筛选阳性克隆质粒Bacmid/rhFⅧ;PCR法鉴定重组质粒后转染昆虫细胞Sf9;利用病毒感染High five细胞进行蛋白表达,通过SDS-PAGE、Western blot及凝血活性检测方法分析蛋白表达。结果完成了rBac-rhFⅧ重组杆状病毒的制备,实现了rhFⅧ在昆虫细胞中的重组表达,rhFⅧ相对分子质量为184 kDa左右,SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致,同时具有良好的促凝血作用。结论利用杆状病毒-昆虫表达系统成功制备了具有一定促凝血活性的rhFⅧ,为人凝血因子Ⅷ进一步的开发及应用奠定了基础。     

在昆虫细胞中表达HSV糖蛋白单域抗体的重组杆状病毒的构建

设计一对含EcoRⅠ—起始码和终止码—SalⅠ的鼠抗体V_H引物,用PCR法对重组质粒p1A12V_H中插入基因1A12V_H进行突变,突变的PCR产物的序列测定表明,在1A12V_H基因两端成功地插入了EcoRⅠ—起始码和终止码—SalⅠ。将突变后1A12V_H依次克隆入pSL301质粒和pAcEEUL8质粒中,使ⅠA12V_H基因两端均接上BamHⅠ接头,用BanHⅠ酶切,将1A12V_H基因克隆入杆状病毒表达载体pAcCL29质粒的多角体基因中的唯一BamHⅠ切点处,经计算机分析,用BamHI;EcoRV/EcoRⅠ;SalⅠ三组酶切,筛选出克隆的1A12V_H基因方向与多角体启动子基因方向一致的重组杆状病毒转基因质粒pAc1A12V_H。CsCL—EB梯度平衡离心法纯化pAc1A12V_H,转化AcNPV基因组DNA,然后转染的sf9细胞,空斑筛选和纯化1A12V_H—AcNPV重组杆状病毒,并用PCR法作进一步鉴定。     

汉坦病毒S0.7基因新型重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建含汉坦病毒核蛋白(NP)氨基端编码基因S0.7,CAG启动子及WPRE转录后调节元件的新型重组腺病毒。方法:依据GenBank序列,分别合成CAG序列及WPRE序列,插入S0.7-pShuttle中,构建含S0.7基因,CAG启动子及WPRE转录后调节元件的转移载体pShuttle-S0.7-CAG-WPRE。采用PI-SceI和I-CeuI限制性内切酶将该片段克隆入腺病毒DNA,得到重组腺病毒DNAAdeno-S0.7-CAG-WPRE,使用PacI线性化后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒。感染HEK293细胞后用免疫荧光法检测表达产物。结果:转移载体pShuttle-S0.7-CAG-WPRE通过测序证明构建正确,纯化重组腺病毒滴度达1013pfu/L。免疫荧光结果表明,重组腺病毒感染的HEK293细胞被抗汉坦病毒NP的特异性mAb1A8所识别。结论:成功地构建了含汉坦病毒S0.7基因,CAG启动子及WPRE转录后调节元件的新型重组腺病毒,本实验为进一步研制汉坦病毒基因疫苗奠定了良好的基础。     

人脂联素基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统探讨人脂联素(ADPN)基因在Sf9昆虫细胞中的高效表达。方法利用PCR方法扩增人脂联素基因,与pFastBac1质粒连接,转化入含有穿梭载体bacmid的大肠杆菌DH10Bac中,筛选发生转座作用的重组穿梭载体Bacmid-ADPN并转染Sf 9昆虫细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf 9细胞形态变化明显,能够表达出与脂联素多克隆抗体相结合的蛋白,蛋白分子质量约为30 ku。结论人脂联素基因在真核细胞中成功得到表达,为进一步研究其生物学活性和作用机制奠定基础。     

新疆出血热病毒S基因在真核系统的克隆和表达

目的　在真核系统表达XHFVS基因片段 ,制备安全、特异、便于操作的S蛋白。方法设计引物 ,扩增得到S基因编码片段 ,用杆状病毒表达载体pFastBacHTb克隆S基因 ,并在昆虫细胞中表达S基因。结果　地高辛探针杂交和PCR扩增结果表明成功地构建了含XHFVS基因片段的pBac Sxhf质粒。SDS PAGE分析表达产物在相对分子质量 (Mr)为 6 6× 10 3 下方出现 1条明显的蛋白条带 ,Westernblot发现该蛋白带可以与抗XHF病毒核蛋白单克隆抗体发生反应。结论　构建的含XHFVS基因的重组杆状病毒可以在昆虫细胞表达S蛋白 ,该蛋白可与特异性抗体相结合     

绿色荧光标记重组人偏肺病毒空斑形成滴度测定方法的建立

目的 建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒(GFP-rhMPV)空斑形成滴度测定方法.方法 基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入细胞293T后获得感染性重组hMPV.GFP-rhMPV在Vero-E6细胞中连续传代提升病毒滴度并保存.将等倍稀释的重组病毒液接种常规制备的Vero-E6细胞单层,用含或不含胰酶的低熔点琼脂精凝胶覆盖细胞,孵育一定时间后,采用荧光显微镜下计数荧光空斑数和抗原抗体蓝斑形成法计算病毒滴度.结果 感染后3 d,荧光显微镜下GFP-rhMPV可在低熔点琼脂糖凝胶覆盖层下形成分界较为清晰的绿色荧光集落,接种后3 d荧光空斑相对独立,便于计数.蓝斑形成法在感染后第5天蓝斑较大,易观察.此前拯救获得的GFP-rhMPV在宿主细胞Vero-E6中的复制滴度可达1×106 PFU以上.结论 成功建立了GFP-rhMPV的空斑形成实验滴度定量检测方法,为hMPV的致病机制、防治手段研究奠定了基础.     

重组杆状病毒表达HEV ORF2抗原片段

目的：用重组杆状病毒表达戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV)ORF2基因片段,并对其免疫学特性进行研究。方法：与中间转染载体pVL1393相连构建重组质粒,在Lipofectin介导下将其与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM)共转染Sf9昆虫细胞得到重组病毒,用免疫荧光,Western blot等方法对表达产物进行免疫学特性初步研究,并进行动物免疫试验。结果：含ORF2结构基因片段的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中获得了高效表达,经免疫荧光,Western blot,动物免疫试验证实该重组蛋白为HEV特异性蛋白,可刺激机体产生相应抗体。结论：重组杆状病毒能有效表达HEV抗原基因,所表达的ORF2重组蛋白具有HEV抗体识别的抗原表位,具有较好的抗原性和免疫原性。     

Expression of VP2 Gene Protein of Infectious Bursal Disease Virus Detected in Korea

The VP2 gene DNA (1.4kb in approximate) of a very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) Chinju strain detected in Chinju, Korea was cloned into the bacmid, a baculovirus shuttle vector, through transposition of the gene from initially cloned pFastBacHTa plasmid, a baculovirus expression vector, and was subsequently expressed in Spodoptera frugiperda (Sf) cells. Biological properties of the expressed VP2 subunit protein were characterized to aid in the development of genetically engineered diagnostic reagents and vaccines against the vvIVDV. When the VP2 DNA-recombinant bacmid was transfected and propagated in the Sf cells, the cells showed no occlusion formation, which is a positive evidence for the insertion of the VP2 DNA into the polyhedrin gene of the bacmid, whereas the occlusions were observed in the cells infected by the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, a wild baculovirus. The expression of VP2 DNA was identified by strong positive reaction in fluorescent antibody test using chicken anti-IBDV serum. The VP2 protein was determined as a polypeptide band with M _r of 48kDa by the sodium dodecyl-polyacrylamide gel electrophoresis for the lysate of the Sf cells infected with the recombinant bacmid. The VP2 protein was successfully purified from the cell lysate by Ni-NTA affinity chromatography. The expressed VP2 subunit protein reacted specifically with chicken anti-IBDV serum in Western blotting.     

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠GITRL蛋白并鉴定

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体(G ITRL)蛋白。方法:用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切GITRL-PMD18T载体,回收目的基因G ITRL,并定向克隆入穿梭质粒pFastBacHTA中。以pFastBacHTA-G ITRL转化感受态DH10Bac细菌,在DH10Bac细菌内重组pFastBacHTA与杆粒发生转座。筛选阳性克隆,提取重组杆粒,转染Tn昆虫细胞株,获取完整的重组杆状病毒。反复感染Tn细胞,扩增病毒同时表达目的蛋白,用Western blot法进行蛋白鉴定。结果:经核苷酸序列测定及PCR鉴定,成功地获得含GITRL基因的重组杆粒。在杆粒转染的Tn细胞中表现有细胞病变,推断转染成功并获得重组杆状病毒。Western blot法鉴定显示,在Mr20000处有特异性的蛋白条带。结论:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功地表达了小鼠GITRL蛋白,为进一步研究其生物学活性及功能奠定了实验基础。     

SETD4蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒系统的表达

目的　通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4（SET domain-containing 4）蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。 方法　提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至pFastBac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆粒;通过脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒感染细胞并获得重组蛋白;利用Ni2+亲和柱来纯化蛋白,并通过Western Blot及考马斯亮蓝染色鉴定SETD4蛋白。 结果　经双酶切鉴定及测序证实SETD4基因插入了供体质粒;经PCR鉴定证实SETD4基因插入了穿梭载体;经考马斯亮蓝染色证实纯化得到重组蛋白,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50 kD处可检测到目的条带。 结论　成功利用昆虫杆状病毒表达系统够表达了SETD4,并纯化了SETD4。     

呼吸道合胞病毒融合蛋白F在重组杆状病毒表达系统中的表达及抗原性研究

目的 利用杆状病毒表达系统对RSV A型Long株F基因进行表达研究,为RSV重组亚单位疫苗的研制奠定基础.方法 用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增F基因,将其克隆到pFastBacHT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PER鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验.免疫Balb/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT试验检测T淋巴细胞增殖.结果 目的 蛋白F在昆虫细胞中有特异性表达,能被F蛋白单克隆抗体所识别,该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体.结论成功克隆RSV F基因,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础.     

山羊IL-18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒中的表达及其活性分析

目的:在昆虫细胞/杆状病毒中表达山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白,并对其生物学活性进行分析。方法:将编码山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白的基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual上,构建重组质粒pFastBac Dual-gIL18,将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18,在Cellfectin作用下,将Bacmid-gIL18转染昆虫细胞sf9,收获感染后不同时间段的细胞,进行SDS-PAGE、Western blot检测和生物学活性分析。结果:重组蛋白获得正确表达具有良好的免疫原性;生物学活性分析表明,重组蛋白能够促进淋巴细胞增殖、诱导淋巴细胞分泌IFN-γ。结论:用昆虫细胞/杆状病毒系统成功表达了gIL-18成熟蛋白,且具有良好的免疫原性和生物学活性,从而为进一步研究gIL-18作为免疫调节剂和免疫佐剂在生产上的应用奠定了基础。     

人脂联素球状结构域基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统表达人脂联素球状结构域（gAd）基因。方法以人基因组为模板,PCR法扩增人gad基因,将gAd基因与供体质粒pFastBacHTB连接,转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac。筛选转座成功的重组穿梭载体Bacmid—gAd,通过脂质体介导,转染昆虫细胞Sf9,经SDS-PAGE、免疫印迹法检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,SDS-PAGE电泳结果显示,BacmidgAd组和对照组相比．在相对分子质量15000～25000之间多出一清晰的蛋白条带．免疫印迹法证实该条带能与相应的抗His标签抗体结合。结论人gAd基因成功在真核细胞中表达,为后续的实验研究奠定了基础。     

High Expression of Insulin-like Growth Factor H (IGF-Ⅱ) Using Bac-to-Bac Expression System

Objective In order to obtain mature insulin-like growth factor- Ⅱ ( IGF- Ⅱ ), we used Bac-to-Bac baculovirus expression system. Methods Firstly the IGF- Ⅱ cDNA was cloned into a donor plasmid pFastBac1 and the recombinant pFastBac1 was then introduced into competent cells DH 10Bac. Recombinant bacmids were constructed by transposing a mini-Tn7 element from a donor plasmid pFastBac1 to the mini-attTn7 attachment site on the bacmid where the Tn7 transposition functions were provided in trans by a helper plasmid, and then used to transfect Sf9 insect cells to get recombinant baculovirus. The recombinant baculovirus was used to infect insect cells. Results Agarose gel analysis showed that recombinant donor plasmid pFastBac1 was constructed successfully; Agarose gel analysis of PCR products confirmed recombinant bacmid ; SDS-PAGE and Western Blotting showed that a 7KD protein band appeared. Conclusion The mature IGF- Ⅱ with immunogenecity has been expressed and produced by using Bac-to-Bac expression system.     

Molecular cloning of the guinea pig cytomegalovirus (GPCMV) genome as an infectious bacterial artificial chromosome (BAC) in Escherichia coli

Since cytomegalovirus (CMV) infection is highly species-specific, it is necessary to study animal cytomegaloviruses to assess viral factors which contribute to pathogenesis. The generation of recombinant viruses carrying reporter genes would provide useful tools for studying the genetics of CMV pathogenicity in vivo. We evaluated whether the guinea pig cytomegalovirus (GPCMV) was amenable to such manipulation. Metabolic selection using the guanosylphosphoribosityl transferase (gpt) gene facilitated recovery of a recombinant virus, vAM403, containing a gpt/green fluorescent protein (eGFP) cassette introduced into the HindIII "N" region of the viral genome. This virus had replication kinetics identical to wild-type virus. We next attempted to clone the GPCMV genome as a bacterial artificial chromosome (BAC). A BAC plasmid containing a gpt/eGFP cassette and the chloramphenicol resistance marker was introduced into HindIII "N" to generate another GPCMV recombinant, vAMBGPCMV. Circular viral DNA isolated from vAMBGPCMV-infected cells was used to transform Escherichia coli. Restriction profiles revealed that the GPCMV genome had been cloned as a BAC plasmid, and transfection of BAC plasmid DNA confirmed that the BAC clone was infectious. A novel strategy based on a unique PmeI site was devised to quickly modify the BAC GPCMV plasmid. Recombinants retained the capability to replicate and express reporter genes in guinea pigs, suggesting that these viruses will be useful for in vivo pathogenesis studies.     

利用穿梭质粒快速构建含乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg …

目的 应用新型杆状病毒表达系统快速构建含有ＨＢｓＡｇ基因的重组杆状病毒，高效表达ＨＢｓＡｇ，为ＨＢＶ诊断试剂、疫苗及治疗研究提供依据。方法 构建含有ＨＢｓＡｇ基因的供体质粒ｐＦＢ－ＢＳ，转化Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达试剂盒中的ＤＨ１０Ｂａｃ致敏菌，利用其含有的细菌Ｔｎ７转座繁忙将ＨＢｓＡｇ基因重组至穿梭质粒Ｂａｃｍｉｄ上，快速筛选出含有ＨＢｓＡｇ基因的重组杆状病毒。结果 此重组病毒能在昆虫细     

人Cosmc 胞外段蛋白在昆虫细胞Sf-9 中的表达与纯化研究

目的:利用昆虫细胞Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统表达人Cosmc 胞外段蛋白,为体外研究Cosmc 蛋白的结构和功能奠定基础,同时也为O-连接糖基化及相关疾病的研究提供思路。方法:采用Bac-to-Bac 系统,构建重组转移质粒pFastBac1-Cosmc extracellular domain(pFastBac1-Cosmc ED),转化到含穿梭载体Bacmid 的感受态细胞DH10Bac 中,通过蓝白斑筛选和PCR 鉴定,获得重组转座子rBacmid-Cosmc ED。在脂质体介导下,重组病毒感染Sf-9 无血清细胞,在Sf-9 中表达Cosmc 胞外段蛋白,由于Cosmc N 端加有昆虫细胞信号肽HBM(Honey Bee Melittin)且不含有跨膜段,所以Cosmc 胞外段蛋白表达后分泌到培养基上清中,通过SDS-PAGE 和Western blot 对表达产物进行检测,并通过Ni-NTA 亲和层析柱对其进行纯化分析。结果:SDS-PAGE 和Western blot 分析显示得到一条分子量约为33 kD 的特异性条带,与目的蛋白大小相符,质谱结果进一步证明所得蛋白为Cosmc 胞外段蛋白。结论:Sf-9 细胞中可成功表达Cosmc 胞外段蛋白,为进一步研究Cosmc 的结构和功能奠定基础。