转化生长因子-β1诱导体外失神经骨骼肌肌源性干细胞分化的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对体外失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)分化方向的作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞,利用TGF-β1诱导分化.将细胞随机分为两组:A,对照组;B,10 ng/ml TGF-β1处理组.在相差显微镜下观察细胞生长情况,用免疫细胞化学法、RT-PCR和Western blot检测两组细胞中Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅲ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)和干细胞抗原-1(Sca-1)的表达水平变化.结果 在体外,对照组失神经骨骼肌MDSCs表达和合成COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA和vimentin的水平极低,而表达和合成Sca-1的水平很高.10 ng/ml TGF-β1处理后,失神经骨骼肌MDSCs能高表达COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA和vimentin,而低表达Sca-1.在TGF-β1的作用下,失神经骨骼肌MDSCs中COL-Ⅰ的表达水平在第2天时达最高值(12.5591±0.3389),约为对照组的3倍;COL-Ⅲ在5d时达最高值(0.8956±0.0438),约为对照组的23倍;α-SMA在第5天时达最高值(1.1090±0.0018),约为对照组的18倍;vimentin在5d时达最高值(0.1794±0.0019),约为对照组的8.5倍;Sca-1在第2天时开始降低,第5天时降低最显著(0.0636±0.0015).结论 TGF-β1能诱导体外失神经骨骼肌MDSCs向肌成纤维母细胞(myofibroblasts)分化,促进细胞合成和分泌细胞外基质.     

丹参抑制骨骼肌肌源性干细胞合成胶原蛋白的机制研究

目的 研究丹参抑制体外骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)合成胶原纤维的机制.方法 采用差速贴壁法分离大鼠骨骼肌MDSCs,利用TGF-β1诱导MDSCs表达胶原纤维,观察丹参对细胞的作用.将体外培养的细胞分为四组,A组:对照组；B组:150 mg/L丹参组；C组:10 μg/L TGF-β1组；D组:10μg/LTGF-β1+ 150 mg/L丹参组.利用免疫细胞化学方法,RT-PCR及Western Blot检测MDSCs中Smad3和COLⅠ表达.结果 在体外,TGF-β1能加强Smad3表达,诱导MDSCs表达胶原蛋白,丹参能拮抗TGF-β1的作用,降低细胞Smad3和COL Ⅰ的表达和合成水平.结论 丹参可以抑制MDSCs表达和合成细胞外基质,其机制是通过干预TGF-β1-Smad3信号通路,抑制MDSCs分化,从而降低细胞合成和分泌胶原纤维.     

转化生长因子-β1促进失神经骨骼肌肌源性干细胞表达胶原纤维的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对体外失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)表达和合成细胞外基质的影响.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,培养基中加入TGF-β1.将体外培养的细胞分为2组:A组,对照组;B组,10μg/L TGF-β1.在相差显微镜下观察细胞生长情况,利用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测MDSCs中COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表达和合成.结果 在体外,失神经骨骼肌MDSCs低表达和合成COL-Ⅰ和COL-Ⅲ.TGF-β1作用24h后,失神经骨骼肌MDSCs中COL-Ⅰ和COL-ⅢmRNA的表达开始增高,48h时COL-ⅠmRNA表达达峰值,之后一直持续高表达,COL-ⅢmRNA表达缓慢增高,在5d时达最高峰;3d时COL-Ⅰ的合成升高最显著,5d时COL-Ⅲ的合成增加最明显.结论 TGF-β1能加强失神经骨骼肌MDSCs合成和分泌细胞外基质,促进失神经骨骼肌纤维化.     

高糖通过转化生长因子β信号诱导肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化

目的 探讨高糖(HG)能否通过转化生长因子β(TGF-β)途径诱导大鼠肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化(EndMT).方法 体外培养大鼠肾小球内皮细胞(GEnC),分为正常对照组(NG,5.5 mmol/L)、高糖组(HG,15、30 mmol/L)、TGF-β抑制剂组(HG+LY36,30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L LY364947)以及高渗对照组(M,5.5 mmol/L葡萄糖+25.5 mmol/L甘露醇)和溶剂对照组(D,5.5 mmol/L葡萄糖+1 ml/LDMSO).采用Western印迹法检测各组细胞内皮细胞标志物claudin5和肌成纤维细胞标志物α-SMA表达变化;实时定量PCR法检测细胞TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达改变;免疫荧光法观察细胞形态学变化以及血管内皮细胞标志物VE-cadherin和肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达.结果 与NG组比较,HG组claudin5蛋白的表达量随葡萄糖浓度增加而降低(P＜0.05),α-SMA蛋白表达量随葡萄糖浓度增加而升高(P＜0.05),TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达均升高(P＜0.05).与HG组比较,TGF-β抑制剂组claudin5蛋白表达量升高(P＜0.05),α-SMA蛋白表达降低(P＜0.05).高渗对照组和溶剂对照组改变差异无统计学意义.激光共聚焦免疫荧光结果显示,高糖处理可引起细胞形态由卵圆形向梭形改变,VE-cadherin表达减少,α-SMA表达增加;TGF-β抑制剂组细胞形态无明显改变.与HG组比较,TGF-β抑制剂组VE-cadherin表达增加,α-SMA表达降低(P＜0.05).结论 高糖诱导大鼠肾小球内皮细胞TGF-β表达增加及内皮细胞-肌成纤维细胞转分化.抑制TGF-β可抑制高糖引起的转分化,提示TGF-β参与了高糖引起的肾小球内皮细胞转分化过程.     

丹参抑制骨骼肌肌源性干细胞成纤维样分化作用的研究

目的 研究丹参对体外培养的骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)纤维样分化的作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠MDSCs,利用TGF-β1诱导MDSC向成纤维样细胞分化,观察丹参对细胞成纤维样分化的影响.将体外培养的细胞分为3组:A组,对照组;B组,10 ng/ml TGF-β1组;C组,10 ng/ml TGF-β1+150 mg/L丹参组.在放大400倍相差显微镜下观察细胞生长情况,利用免疫细胞化学方法、RT-PCR、Western Blot检测MDSCs表达CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ的情况.结果 在体外,TGF-β1能加强MDSCs表达结缔组织生长因子(CTGF)和胶原蛋白,丹参拮抗TGF-β1的作用,降低细胞CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ mRNA的表达水平,降低CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ蛋白的水平.结论 丹参可以抑制TGF-β1诱导MDSCs成纤维样分化作用.其机制可能是抑制CTGF表达,从而降低细胞合成和分泌胶原纤维,抑制细胞成纤维样分化.

Abstract：

Objective To investigate the effect of Salvia miltiorrhiza on fibroblastic differentiation of skeletal muscle-derived stem cells (MDSCs) in vitro. Methods MDSCs in rats were isolated by the method of adhering to culture plastic at different time points. Fibroblastic differentiation of MDSCs was induced by TGF-β1 administration and the effects of Salvia miltiorrhiza on fibroblastic differentiation were observed. The cells cultivated in vitro were divided into three groups according the supplement of TGF-β1 and Salvia miltiorrhiza in culture media: group A (control group) had no TGF-β1 and Salvia miltiorrhiza;group B had 10 ng/ml TGF-β1;group C had 10 ng/ml TGF-β1 and 150 mg/L Salvia miltiorrhiza. Cell growth was observed using phase contrast microscope. The expressions of CTGF,COLⅠand COL Ⅲ in each group were detected by immunocytochemistry,RT-PCR and Western Blot. Results In vitro,TGF-β1 promoted the expression of CTGF and collagens of MDSCs. However,the effect of TGF-β1 could be inhibited by Salvia miltiorrhiza,resulting in decreased mRNA and protein expression of CTGF,COLⅠand COL Ⅲ. Conclusion Salvia miltiorrhiza could inhibit fibroblastic differentiation of MDSCs induced by TGF-β1. The mechanism might be that inhibition of CTGF expression reduces the synthesis and secretion of collagen fibers and in turn inhibits the fibroblastic differentiation.     

二十碳五烯酸对白蛋白诱导肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)对人白蛋白诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)发生转分化的干预作用.方法 体外培养人HK-2细胞,随机分为6组:A组,空白对照组(未加任何刺激物);B组,单纯EPA组(加入30 μmol/L EPA);C组,血白蛋白(albumin,Alb)诱导组(加入5 mg/ml Alb);D组,低剂量EPA干预组(5mg/ml Alb+ 10 μmol/L EPA);E组,中剂量EPA干预组(5mg/ml Alb+ 30 μmol/L EPA);F组,高剂量EPA干预组(5 mg/ml Alb+ 50μmol/L EPA).细胞免疫荧光检测E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle ac-tin,α-SMA)的表达;ELISA法检测纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的水平;采用RT-PCR检测转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的mRNA表达.结果 与A组比较,B组TGF-β1mRNA、α-SMA、FN、E-cadherin表达均无统计学差异(P＞0.05);C组TGF-β1 mRNA、α-SMA、FN较其他各组表达明显增高(P＜0.05),而E-cadherin表达明显下降(P＜0.05).与C组比较,D组、E组、F组TGF-β1 mRNA、α-SMA、FN表达逐渐下降,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);E-cadherin的表达逐渐增高,各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).提示EPA可显著抑制Alb刺激人肾小管上皮细胞表达E-cadherin、α-SMA,同时下调上清液中FN水平,且其抑制作用的强弱与EPA浓度密切相关.EPA还明显下调了Alb刺激后TGF-β1的表达.结论 一定浓度的人白蛋白可以诱导体外培养的HK-2细胞发生转分化;EPA可一定程度上抑制白蛋白诱导HK-2发生转分化过程,且呈剂量依赖性.     

CTGF shRNA表达质粒的构建及对大鼠肌源性干细胞CTGF表达的影响

目的 观察针对结缔组织生长因子(CTGF)所构建的短发卡RNA(shRNA)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)表达CTGF的影响.方法 针对CTGF mRNA上的序列,体外合成表达shRNA的DNA质粒载体pGenesil-3-shRNA并行测序鉴定;从新生SD大鼠骨骼肌中分离培养MDSCs并鉴定.实验分成对照组(MDSCs+TGF-β1培养),实验组(MDSCs+ TGF-β1+pGenesil-3-shRNA培养).观察shRNA质粒转染结果.利用Real-Time PCR及Western Blot检测CTGF mRNA和CTGF蛋白表达.结果 正确构建了靶向CTG,F基因的质粒载体pCenesil-3-shCTGF;大鼠MDSCs 48 h、72h和96h时实验组的CTGF mRNA及蛋白质水平均低于对照组(P＜0.05).结论 针对CTGF构建的pGenesil-3-shCTGF能够转染MDSCs,并在48h、72h和96h时能明显降低TGF-β1刺激MDSCs所产生CTGF的表达.     

红细胞生成素抑制C3a介导的肾小管上皮细胞间充质转分化

目的 观察红细胞生成素(EPO)对补体成分C3片段C3a介导的肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)的影响.方法 将人近端肾小管上皮细胞(HK-2)分为6组:对照组、EPO组、TGF-β组、TGF-β+EPO组、C3a组、EPO+C3a组,分别用RT-PCR、Western印迹和细胞免疫荧光方法检测HK-2细胞α-SMA、E-cadherin、C3的mRNA和蛋白表达.结果 与对照组和EPO组比较,C3a或TGF-β干预HK2细胞后,αt-SMA mRNA和蛋白表达增强(均P＜0.05),E-cadherin mRNA和蛋白表达减少(均P＜ 0.05),补体C3 mRNA和蛋白表达增强(均P＜ 0.05);而同时给予EPO干预后,C3a或TGF-β的上述作用可被明显减弱(均P＜0.05).结论 EPO可抑制C3a介导的肾小管上皮细胞EMT.     

Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制

目的 了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制.方法 采用酶消化法分离培养人正常皮肤真皮Fb.(1)实验1.按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10 ng/mL重组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150 ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fb β连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平.(2)实验2.按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验1;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10 μmol/L SB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+ SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况.各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验.结果 (1)实验1.①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823).②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=16.713,P=0.001).与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82±0.17,t值分别为3.028、3.727,P＜0.05或P＜0.01).TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01).③α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为6.759、2.535,P＜0.05或P＜0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P＜0.01).④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组、TGF-β1+ Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.53±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001).与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P＜0.05或P ＜0.01);TGF-β1 +Wnt3a组低于TGF-β1组(t =4.123,P＜0.01).(2)实验2.①α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=34.101,P=0.001).SB415286组明显低于对照组(t =2.511,P＜0.05),TGF-β1+SB415286组明显低于TGF-β1组(t=3.587,P＜0.01).②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F =11.381,P=0.003).SB415286组显著低于对照组(t=2.364,P＜0.05),TGF-β1+ SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P＜0.05).③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组Fb α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t =11.198,P＜0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+ SB415286组表达较TGF-β1组显著减少(t=5.902,P＜0.01).结论 Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fb细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用.     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

LINC00667调控NF-κB信号通路对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:探讨LINC00667对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞间充质转化(EMT)及核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:将人肾小管上皮细胞HK-2分为正常对照(NC)组、高糖(HG)组、HG+si-con组、HG+si-LINC00667组、HG+si-LINC00667+PBS组、HG+si-LINC00667+TNF-α组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LINC00667的表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测白细胞介素1β(IL-1β)和转化生长因子(TGF-β_1)含量;蛋白质印记(Western blot)检测钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及NF-κB信号通路相关蛋白的表达。结果:与NC组比较,HG组HK-2细胞LINC00667、Vimentin和α-SMA表达升高,E-cadherin表达降低,细胞培养液上清中IL-1β和TGF-β_1含量升高,NF-κB信号通路激活(P0.05)。与HG+si-con组比较,HG+si-LINC00667组HK-2细胞Vimentin和α-SMA表达降低,E-cadherin表达升高,细胞培养液上清中IL-1β和TGF-β_1含量降低,NF-κB信号通路受到抑制(P0.05)。与HG+si-LINC00667+PBS组比较,HG+si-LINC00667+TNF-α组HK-2细胞NF-κB信号通路激活,Vimentin和α-SMA表达升高,E-cadherin表达降低,细胞培养液上清中IL-1β和TGF-β_1含量升高(P0.05)。结论:沉默LINC00667可抑制高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT,抑制炎症反应,其机制与抑制NF-κB信号通路有关。     

肿瘤相关成纤维细胞培养液上清促进肿瘤细胞增殖和血管生成的研究

目的 探讨在体外实验条件下,肿瘤相关成纤维细胞如何通过旁分泌机制促进肿瘤细胞的增殖和血管生成.方法 分别提取原代卵巢癌相关成纤维细胞(TAFs)与正常卵巢相关成纤维细胞(N Fs)的培养液上清(CM);实验组为2ml TAFs-CM处理卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105/孔),对照组为2 ml NFs-CM处理卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105/孔),空白组为正常培养的卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105个/孔),干预组为在实验组中加入20 μmol转化生长因子-β(TGF-β)特异性小分子抑制剂SB-431542(10 μmol/ml);应用流式细胞仪分析各组细胞生长周期;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达,Western blot法检测各组细胞TGF-β1、α-SMA、VEGF蛋白的表达.结果 实验组卵巢癌细胞增殖较对照组显著增加(细胞S期比例:实验组22.10±1.84比对照组12.77±1.43,P＜0.05);而加入SB431542干预后则可明显抑制促增殖作用(细胞S期比例:干预组12.33±1.12比实验组22.10±1.84,P＜0.05);RT-PCR提示实验组PCNA、α-SMA、VEGF mRNA较其他组表达显著上调(P＜0.05),Western blot结果提示实验组TGF-β1、α-SMA、VEGF蛋白表达亦显著上调(P＜0.05),在加入SB-431542后以上基因及蛋白的表达均受到抑制(P＜0.05).结论 卵巢癌相关成纤维细胞可以通过旁分泌机制促进卵巢癌细胞的增殖,并上调血管生成相关基因及蛋白的表达,而通过抑制TGF-β信号通路作用后则可以有效抑制这类作用.     

LeftyA真核表达载体的构建及其对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化(EMT)的影响.方法 基因克隆技术构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,将其瞬时转染HK-2细胞,TGF-β1(10μg/L)刺激后,观察细胞形态变化,检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因及蛋白的表达.结果 TGF-β1刺激后HK-2细胞内E-cadherin mRNA和蛋白时间依赖性表达下调,α-SMA mRNA和蛋白时间依赖性表达上调,同时E-cadherin表达变化早于α-SMA;LeftyA蛋白可以显著抑制E-cadherin蛋白的下调表达(P＜0.05),其表达比同时间点单纯刺激组高17.6%;同时可逆转α-SMA蛋白的上调表达(P＜0.05),其蛋白表达比单纯刺激组低14.0%.结论 LeftyA蛋白可以抑制TGF-β1所致的EMT.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression vector for LeftyA and study the effects of LeftyA on epithelial to mesenchymal transition of human proximal tubular epithelial cells induced by transforming growth factor-β1 ( TGF-β1 ). Methods The pcDNA3. 1-LeftyA was constructed by recombinant DNA technique. After transfection with pcDNA3. 1-LeftyA HK-2 cells were stimulated by TGF-β1( 10 μg/L). The morphological changes, and the expression of E-cadherin, α-SMA and LeftyA mRNA and protein were observed and detected, respectively. Results TGF-β1 could markedly decrease the expression of E-cadherin mRNA and protein in HK-2 cells induced, and dramatically increase the expression of α-SMA mRNA and protein in a time-dependent manner. Forced expression of exogenous LeftyA led to a blockage of TGF-β1 -induced E-cadherin ( 17.6% ) suppression and α-SMA induction ( 14. 0% ). Conclusion Disruption of cell adherence is the beginning stage of EMT, and overexpression of LeftyA can suppress EMT induced by TGF-β1, which suggests a alprostadil role for LeftyA in TGF-β1-induced tubular EMT and renal fibrosis.     

血管内皮生长因子抑制肾小管上皮间充质转化及其与结缔组织生长因子和PI3K-Akt信号通路的关系

目的　探讨血管内皮生长因子（VEGF）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮间充质转化（EMT）的作用,及其与结缔组织生长因子（CTGF）、PI3K-Akt信号通路的关系。 方法 （1）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1（5 μg/L,下同）组、VEGF组（100 μg/L,下同）、TGF-β1＋VEGF组。HK2细胞体外培养48 h,用免疫组化双染方法检测肾小管上皮细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E钙黏蛋白的表达。（2）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1组、VEGF组、TGF-β1＋VEGF组、PI3K-Akt信号通路阻断剂LY294002组（25 μmol/L,下同）、TGF-β1＋LY294002组、VEGF＋LY294002组、TGF-β1＋VEGF＋LY294002组。HK2细胞体外培养48 h,用Western印迹和RT-PCR方法检测α-SMA和CTGF的表达;用ELISA方法检测培养上清中纤连蛋白（FN）和I型胶原（ColⅠ）的表达。 结果 免疫组化结果显示,TGF-β1组α-SMA表达比正常对照组增强,而E钙黏蛋白表达减弱; TGF-β1＋VEGF组α-SMA表达比TGF-β1组显著减弱,而E钙黏蛋白表达增强。 TGF-β1组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比正常对照组显著增强（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF组α-SMA、CTGF蛋白和mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1组显著减弱（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF＋LY294002组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1＋VEGF组显著增强（均P < 0.05）。 结论　VEGF能抑制TGF-β1诱导的体外培养的HK2细胞发生EMT,其机制可能与VEGF下调HK2细胞CTGF表达及减少细胞外FN、ColⅠ合成有关。VEGF的这种作用可能部分通过PI3K-Akt信号转导通路实现,其确切机制有待进一步研究。     

丹酚酸B对输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:探讨丹酚酸B对输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞转分化影响及作用机制.方法:雄性SD大鼠,建立单侧输尿管梗阻模型(UUO).设假手术组、模型组、治疗组(丹酚酸B 30 mg·kg-1·d-1)术后第9天处死各组大鼠.采用光镜观察肾间质纤维化、炎细胞浸润,免疫组化观察肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Vimentin蛋白表达的变化.结果:(1)治疗组大鼠肾间质纤维化程度较模型组明显减轻;(2)UUO模型第9天时大鼠肾组织TGF-β、α-SMA和Vimentin表达明显增强,炎细胞浸润明显增加.采用丹酚酸B治疗后,肾组织TGF-β1、α-SMA和Vimentin表达的异常增强能得到有效抑制,炎细胞浸润明显减少.结论:丹酚酸B具有减轻肾组织纤维化的作用,而这一作用与其能有效抑制炎细胞浸润和TGF-β1过度表达,进一步阻押肾小管上皮细胞转分化(EMT)有关.     

虫草多糖对转化生长因子β1诱导人近端肾小管上皮细胞间充质转分化的影响

目的 探讨虫草多糖（Cp）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人近端肾小管上皮细胞间充质转分化的影响。 方法 用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度的Cp(0、0.01、0.1、1、5、10 g/L)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2) 增殖的作用。用不同浓度的 TGF-β1（0、0.1、0.5、1、5、10 μg/L）作用HK-2细胞48 h及5 μg/L的TGF-β1作用不同时间（0、12、24、48和72 ｈ），以实时定量PCR和Western印迹方法检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、钙黏蛋白（E-cadherin）、纤连蛋白（FN）的表达。用递增浓度的Cp(1、5、10 g/L)预处理HK-2细胞24 h后，观察其对TGF-β1效应的干预作用。 结果 Cp以剂量依赖方式促进HK-2细胞增殖（P < 0.05）。TGF-β1无论在转录水平还是蛋白水平皆能诱导HK-2细胞 α-SMA、FN表达上调，而下调E-cadherin表达。分别用1、5、10 g/L Cp预干预24 h后，同单独5 μg/L TGF-β1刺激组相比，上述因子表达被不同程度逆转。在转录水平，α-SMA mRNA表达被抑制率分别为37.98%、68.08%、84.36%；FN mRNA表达被抑制率分别为46.97%、63.82%、81.85%；E-cadherin mRNA表达分别增加0.67倍、2.69倍、5.43倍（均P < 0.05）。在蛋白水平，α-SMA蛋白表达被抑制率分别为33.40%、47.75%、68.50%；FN蛋白表达抑制率分别为16.26%、65.92%、80.30%；E-cadherin蛋白表达分别增加1.33倍、3.19倍、4.29倍（均P < 0.05）。Cp能明显拮抗 TGF-β1 诱导的HK-2细胞的表型改变。 结论 Cp能有效阻止TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞发生转分化。     

RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的　探讨RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转分化中的作用。 方法　体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,静止24 h后,采用随机数字表法随机分为以下4组：正常对照组、TGF-β1（10 μg/L）刺激组、TGF-β1（10 μg/L）＋Y-27632（Rock特异性抑制剂,10 μmol/L）组（Y-27632预处理2 h）、Y-27632（10 μmol/L）组。用TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC不同时间,观察α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,E钙黏素（E-cadherin）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达。RT-PCR法检测E-cadherin、α-SMA 和ColⅠmRNA表达。Western印迹法检测RhoA（包括总RhoA及活化的RhoA）、E-cadherin、α-SMA、ColⅠ和波形蛋白（vimentin）表达。活化的RhoA由膜蛋白提取试剂盒提取。 结果 （1）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能诱导RhoA活化,于10 min开始出现活性升高,为对照组的（2.57±0.52）倍（P < 0.05）;1 h达高峰,为对照组的（4.35±0.41）倍（P < 0.05）。（2）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能导致E-cadherin mRNA和蛋白表达下调,α-SMA、ColⅠmRNA和蛋白表达上调,呈时间依赖性。（3）Rock特异性抑制剂Y-27632能显著下调α-SMA、ColⅠmRNA的表达,较TGF-β1刺激组各降低了53.8%和55.7%（均P < 0.05）,并且能下调α-SMA、ColⅠ和vimentin蛋白的表达,较TGF-β1刺激组分别降低了42.6%、60.1%和58.1%（均P < 0.05）,但不能上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。 结论　TGF-β1可通过RhoA-Rock信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。     

Par-3蛋白在转化生长因子?茁1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF)β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1 (10 μg/L)刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72 h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P > 0.05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。     

血管紧张素1-7对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的影响

目的 研究血管紧张素1-7(Ang1-7)对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的影响及其可能机制.方法 32只雄性Wistar大鼠被随机分为4组:健康对照组(NC组)、模型组(DM组)、替米沙坦组(TM组)、治疗组(T组).建模成功后第9周末检测各组大鼠24 h尿蛋白量、尿NAG/Cr、血糖、血胰岛素、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、BUN、Scr、血K+及血Na+ ;PAS染色观察肾脏病理改变 ;实时定量PCR法检测各组大鼠肾脏组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA水平 ;Western印迹法检测PPARγ、α-SMA、TGF-β1蛋白表达.结果 (1)第9周末,DM组大鼠血压、尿蛋白量、肾质量/体质量较NC组显著升高(P＜0.05),TM组及T组较DM组显著降低(P＜0.05),且T组变化更明显.(2)DM组第9周末肾间质损伤指数显著高于NC组(P＜0.05),TM组及T组则低于DM组(P＜0.05).(3)实时定量PCR结果显示,DM组TGF-β1、α-SMAmRNA水平显著升高(P＜0.05),PPARγ mRNA水平显著下降(P＜0.05),TM组及T组较DM组TGF-β1、α-SMA mRNA水平均显著下降(P＜0.05),PPARγ mRNA水平显著上升(P＜0.05),且T组变化更明显.(4)Western印迹结果显示,DM组TGF-β1、α-SMA蛋白水平显著升高(P＜0.05),PPARγ蛋白水平显著下降(P＜0.05),TM组及T组较DM组TGF-β1、α-SMA蛋白水平均显著下降(P＜0.05),PPARγ蛋白水平显著上升(P＜0.05),且T组变化更明显.结论 Ang1-7在体内可通过上调PPARγ表达,抑制α-SMA表达,对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化可能具有抑制作用.