成年山羊皮肤干细胞体外克隆与诱导分化

目的 探索山羊皮肤干细胞的分离方法与培养体系，为进一步研究皮肤干细胞增殖分化的分子机制订下基础。方法 从成年关中奶山羊耳尖获取皮肤，用组织块培养法分离皮肤干细胞，碱性磷酸酶(ALP)染色及体外分化实验鉴定，用条件培养基与细胞因子相结合行皮肤干细胞的体外诱导分化。结果 山羊耳尖皮肤分离得到类干细胞集落并传5代，细胞集落具有典型鸟巢状结构，ALP染色阳性，体外分化能形成类胚体。在细胞因子(IGF—1)及条件培养基的诱导下，所分离获取的皮肤干细胞能分化形成类毛囊，类星形胶质细胞及类成骨细胞。结论 用组织块培养法可以获得多能性皮肤干细胞；在体外培养条件下不仅能进行定向分化，还能进行横向分化。     

荷载角质细胞生长因子纳米微囊组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损

目的 研究荷载角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)纳米微囊的新型组织工程皮肤对裸鼠皮肤缺损的修复效果及特点.方法 采用超声乳化一溶剂挥发法及低温干燥法,制备KGF纳米微囊,并构建KGF-脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM);分离培养和鉴定人表皮干细胞群和成纤维细胞;接种表皮干细胞群于KGF-ADM之上,观察其生长情况;将荷载KGF纳米微囊的组织工程皮肤移植于裸鼠皮肤缺损处,以无KGF纳米微囊的组织工程皮肤为空白组,以其自体皮肤移植作对照组.于术后2,6周时分别观察修复区组织学愈合及皮片挛缩情况,并应用抗人角蛋白10及β1-整合素免疫荧光检测修复区表皮和真皮层细胞来源、分化及生长情况.结果 表皮干细胞群在KGF-ADM表面生长良好,粘贴紧密,可见到多角形的终末表皮细胞及小圆形的表皮干细胞,活性良好,有连接成片的趋势,部分形成克隆团块.以荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损,2、6周时修复效果均优于空白组及对照组,移植的组织工程皮肤边缘可与邻近皮肤完全融合,但存在一定的挛缩.镜下可见修复区组织工程皮肤表皮细胞分层良好,与ADM紧密结合,能产生正常角质层.6周时实验组修复区组织工程皮肤切片免疫荧光检测,基底层仍存有少量β1-整合素阳性的表皮干细胞或短暂扩充细胞.结论 所构建的荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损的效果,优于无KGF纳米微囊的普通组织工程皮肤及裸鼠自体全厚皮片移植修复效果.     

组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的 探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性. 方法 将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养.将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5 mL与纤维蛋白支架(0.5 mL)混合凝固构建组织工程皮肤.取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3 g,平均20.0 g,制备背部全层皮肤缺损模型.随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤.术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察. 结果 细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6 d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞.构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞.移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻.术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为(0.460 ±0.049)、(0.480 ±0.055)、(0.540 ±0.043)、(0.510 ±0.032)及(0.60 ±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P＜0.05).术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见. 结论 用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

毛囊干细胞及其增殖分化研究进展

毛囊能够提高皮肤创伤愈合速度及质量,减少瘢痕形成[1-4].毛囊干细胞(HSC)是构建组织工程皮肤的理想种子细胞,参与组织损伤的修复并具有分化为包括表皮、皮脂腺和汗腺在内的全部皮肤上皮细胞的潜能,同时具有定向形成软骨和神经的能力[1,3,5].HSC的增殖与分化受Wnt、Notch、原癌基因c-myc等信号分子调控,其中Wnt/β连环蛋白(β-catenin)对其分化产生关键作用,成为近来国内外的研究热点.     

皮肤干细胞的研究现状与应用前景

近年来随着干细胞研究的不断深入 ,除胚胎干细胞外[1,2 ] ,研究者们已能在体外分离培养多种组织干细胞 ,包括由皮肤表皮基底层中分离出的表皮干细胞 (epidermalstemcells)和位于表皮之下毛囊隆突处的毛囊干细胞 (follilarstemcells) [3 ,4 ] 。最近 ,加拿大学者又从大鼠真皮中提取出干细胞 ,并利用这些干细胞成功培养出神经细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞[5] 。这些新的研究成果 ,进一步加深了人们对皮肤干细胞、皮肤损伤修复机制以及皮肤癌的认识。一、皮肤干细胞的生物学特性1.概念、数量、位置 :干细胞是一群具有无限自我更新能力 ,并产生至…     

胎儿表皮干细胞人端粒酶催化亚单位的表达

端粒酶不仅在肿瘤组织中高表达,在多种干细胞中亦有表达,该酶活性与干细胞维持自我更新的潜能密切相关.表皮干细胞(ESC)具有自我复制能力和多向分化潜能.是皮肤组织工程理想的种子细胞~([1-3]).目前有关端粒酶在人ESC中的表达特性尚不十分清楚.     

自体组织工程化皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的为制成含表皮细胞与成纤维细胞的双层皮肤替代物,直接用于修复全层皮肤缺损.方法选用长枫杂交仔猪10只,酶消化法获取皮肤表皮细胞与成纤维细胞,将原代培养处于对数生长期的表皮细胞、成纤维细胞分别与30%氧化异丙烯F-127 混匀成细胞悬液后,种植聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)形成细胞-生物材料复合物,用于修复自体动物背部直径4 cm全层皮肤缺损,以单纯生物材料(PGA+氧化异丙烯)充填的创面作为对照组.修复术后1,2,4,8周取材,通过组织学和基底膜特殊染色等方法对新生组织进行评价.结果第1周新生组织即出现表皮与真皮2层结构,特殊染色观察到连续的基底膜.第2周表皮与真皮均较前增厚.修复后第8周组织工程化皮肤的形态结构均与正常皮肤相似.对照组则无皮肤形成,仅见大量肉芽组织.结论应用组织工程技术,以PGA+氧化异丙烯为表皮细胞、成纤维细胞载体构建的组织工程化皮肤可修复全层皮肤缺损.     

利用毛囊干细胞和成纤维细胞重建全层皮肤的研究

目的建立利用毛囊干细胞和成纤维细胞进行全层皮肤重建的实验方法.方法取美容手术切取的头皮组织,K19免疫荧光染色定位毛囊干细胞,消化、分离、体外培养,以胶原-成纤维细胞聚合物为基质,采用气-液界面对第2代毛囊干细胞立体培养14 d,建立全层皮肤培养模型,并行组织学及K1免疫荧光染色观察.结果K19免疫荧光染色定位毛囊干细胞存在于毛囊外根鞘处,与成纤维细胞联合体外气-液界面立体培养14 d,获得的皮肤类似物,可见真皮基底膜形成,表皮多层上皮有序、多角形排列,上层细胞出现角化,真皮部成纤维细胞均匀分布于胶原基质中,角质细胞形成分化特异标志物K1染色阳性.结论毛囊外根鞘处的毛囊干细胞具有高增殖能力并向表皮细胞分化,可成功利用毛囊干细胞和成纤维细胞进行皮肤重建,为临床应用奠定基础.     

脂肪干细胞在皮肤抗衰老方面的研究进展

脂肪干细胞具有多向分化能力和丰富的旁分泌功能,且因为其来源广泛、取材方便及组织损伤小等优点已成为细胞治疗和组织工程应用的理想工具。而面部年轻化一直是整形美容领域的热点,其中皮肤抗衰老又是重中之重,脂肪干细胞在皮肤抗衰老方面的作用吸引广大学者研究探讨。本文从离体实验、在体实验及临床应用三个方面综述脂肪干细胞在皮肤抗衰老方面的研究进展,以确定下一步研究的方向,为临床治疗提供更多可靠的依据。     

干细胞用于皮肤组织再生及年轻化的研究进展

干细胞具有自我更新、自我复制的能力,有望运用于医学发展的各个领域,包括皮肤损伤的再生。年轻化作为皮肤组织再生的另一种形式,干细胞同样有可能在该领域发挥重要的作用。本文就干细胞用于皮肤组织再生及年轻化的研究进展进行综述。     

脱细胞真皮基质与组织修复再生研究进展

支架材料复合干细胞的皮肤组织工程产品是严重皮肤损伤较理想的治疗材料。脱细胞后的真皮保留了真皮原有的胶原纤维和基本结构,能够为种子细胞提供适宜的生长增殖环境,是一种较理想的真皮替代物。理想的脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix, ADM)无细胞毒性和免疫原性,并具有良好的生物相容性,能够促进种子细胞增殖分化形成有生物功能的皮肤组织。现就其作用机制、制备与表征以及研究进展等方面作一综述。     

成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达特征的比较研究

目的采用免疫组织化学染色方法研究成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达β1整合素和角蛋白19,14,10(K19,K14,K10)的特征与规律,探讨两种组织表皮干细胞表达特征的差异与烧伤后瘢痕愈合的关系.方法分别取成年人健康皮肤6例和大面积深度烧伤后瘢痕组织6例.采用免疫组织化学Elivision两步法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10.结果瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论瘢痕组织表皮基底层干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的修复能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.     

Lefty蛋白在人胚胎皮肤、成人正常皮肤及增生性瘢痕中的表达

目的 了解Lefty蛋白在人胚胎皮肤、成人正常皮肤及增生性瘢痕(HS)组织中的表达,探讨其在HS形成中的作用及与胚胎无瘢痕愈合的关系. 方法 留取人胚胎皮肤、成人正常皮肤及HS标本,制成冰冻切片,行免疫荧光染色.激光共聚焦显微镜下观察各标本中成纤维细胞形态及Lefty蛋白的表达,用阳性细胞率作为表达量. 结果 人胚胎皮肤成纤维细胞呈梭形,胞核呈椭圆形或梭形,排列规则;成人正常皮肤及HS组织成纤维细胞呈长梭形,胞核呈梭形或星形,前者排列较规则,而后者排列不规则.HS组织中Lefty蛋白阳性细胞率为15.38%,低于成人正常皮肤(67.92%)和人胚胎皮肤(81.67%,P＜0.01);而成人正常皮肤阳性细胞率也低于人胚胎皮肤(P＜0.05). 结论 Lefty蛋白可能对瘢痕的形成有抑制作用,其高表达可能与胚胎无瘢痕愈合相关.     

脂肪干细胞在皮肤组织工程中的研究应用进展

组织工程皮肤作为一种皮肤组织替代物,主要用于覆盖和修复损伤缺损的皮肤组织,以改善其形态和功能。其中,种子细胞、支架材料及细胞因子是皮肤组织工程研究的三要素。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)具有来源丰富、取材方便、低免疫原性、易扩增等优点,是皮肤组织工程较为理想的种子细胞。本文就ADSCs在组织工程皮肤中,包括创面修复、抑制瘢痕增生等的相关应用研究进展及前景进行综述。     

脂肪来源干细胞调控皮肤衰老的研究进展

自20世纪90年代中期以来,脂肪组织已被认为是一个完整的内部器官.脂肪组织中主要存在两大细胞群,成熟脂肪细胞及血管基质部分(stromal vascular fraction,SVF)[1].皮肤衰老是随着年龄增长而发生的皮肤生理性衰老,与真皮成纤维细胞减少、衰老密切相关.大量实验已证实脂肪来源干细胞(adipose-derived stromal/stem cells,ASCs)通过旁分泌和自分泌作用激化甚至直接分化为成纤维细胞,以参与皮肤组织损伤修复和结构重建.我们仅就SVF、ASCs为基础的脂肪基质细胞治疗皮肤衰老的研究进展作一综述.     

不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤的增殖分化能力比较

目的 比较三维条件下不同代次角质形成细胞构建的表皮形态及增殖分化情况.方法 采用不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤,通过苏木精-伊红(HE)和高碘酸-希夫(PAS)染色,观察各组组织工程皮肤的结构形态;并利用角蛋白CK1/CK10、CK5/CK14、细胞增殖核抗原Ki-67免疫组织化学染色,比较各组组织工程皮肤表皮的增殖分化能力.结果 不同代次角质形成细胞构建的组织工程皮肤都有明显的表皮真皮结构.1、2代较其他代次分层情况好,2代表皮层厚度明显高于其他代次(P＜0.05).加Ⅳ型胶原组的表皮真皮间黏附的紧密程度高于未加Ⅳ型胶原组,Ⅳ型胶原对表皮的厚度影响不大(P＞0.05).Ⅳ型胶原组PAS染色阴性,说明单独加Ⅳ型胶原不能形成基底膜结构.2代角质形成细胞Ki-67增殖系数接近正常皮肤,其余各代次角质形成细胞的增殖系数逐渐减少(P＜0.05).CK1/CK10、CK5/CK14在1、2代皮肤中阳性表达明显,其余代次对于两种角蛋白的表达并不明显.结论 3代以前角质形成细胞有更好的增殖分化能力,更适合作为组织工程皮肤的种子细胞.     

增生瘢痕皮肤中转化生长因子基因表达

目的探讨转化生长因子(TGF)-β1和转录因子Smad 2,Smad 3三种基因影响增生性瘢痕形成和胎儿皮肤伤口无瘢痕愈合的调节机制.方法 32份被检测标本中包括增生性瘢痕8份,其对应的正常皮肤组织8份,胎儿和成人皮肤组织各8份.用逆转录-多聚酶链反应方法(RT-PCR)检测这3种基因在不同的组织细胞内的表达变化规律.结果 TGF-β1、Smad 2 和Smad 3三种基因在增生性瘢痕、胎儿和出生后机体皮肤组织细胞内都有表达.在所检测8对增生性瘢痕和其对应正常皮肤细胞中,这3种不同基因在增生性瘢痕细胞中的表达量高于正常皮肤细胞的组数分别为TGF-β1基因有5对,Smad 2基因有8对,而Smad 3基因有5对.在胎儿皮肤细胞内,TGF-β1的mRNA含量明显低于成人皮肤细胞(t=2.204,P<0.05),差异有显著意义;Smad 3基因表达也呈相似的变化规律,mRNA含量显著低于成人皮肤细胞(t=4.269,P<0.01),差异有非常显著意义;而Smad 2基因的mRNA含量却明显高于成人皮肤细胞(t=6.685,P<0.01),差异亦有非常显著意义.结论 TGF-β1和它的下游信号分子Smad 2,Smad 3可能与增生性瘢痕形成密切相关.在增生性瘢痕细胞内,这3种基因高表达可诱导胞外基质大量沉积,加速成纤维细胞增殖,促进组织纤维化.TGF-β1和Smad 3基因在胎儿皮肤组织细胞内低表达可能是皮肤伤口无瘢痕愈合的机制之一.     

基因物质p63、β1整合素对正常人不同部位皮肤表皮干细胞的表达和意义

目的　探讨基因物质 p63、β1整合素对正常人不同部位皮肤表皮干细胞的表达情况及意义。方法　在 5例正常人尸体上各取 2 1个不同部位的全层皮肤组织 ,采用免疫组织化学SP法 ,用基因物质 p63、β1整合素作为第一抗体标记表皮干细胞 ,并通过图像分析 ,研究表皮干细胞在正常人不同部位皮肤中的表达情况。结果　 (1)头皮 p63的PU值 [阳性单位 (% ) ] (4 2 .17± 3 .10 )最大 ,与面皮、腋部、上臂内侧、前臂内侧、腰背部、手背、足背及足底差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;足背p63的PU值(2 1.19± 6.89)最小 ,与身体其他部位差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。头皮CD2 9的PU值 (2 9.13± 4.99)最大 ,与身体其他部位差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ;足底CD2 9的PU值 (11.89±1.5 2 )最小 ,阴囊与面皮、腰背、上臂内外侧、手掌、手背、腹部及足底差异有显著性 (P <0 .0 5 )。(2 )正常人不同部位多毛组与汗毛组 p63、CD2 9的PU值差异有显著性(P <0 .0 0 0 1)。(3 )躯干组与四肢组p63、CD2 9的PU值差异无显著性 (P >0 .0 5 )。(4 )屈侧与伸侧p63、CD2 9的PU值差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　 (1) p63、CD2 9对正常人不同部位皮肤表皮干细胞的表达不同 ,头皮、阴阜、阴囊皮肤组织中的阳性表达较高 ,而其他部位皮肤组织中     

皮肤溃疡中血小板源性生长因子及其受体基因表达的变化

目的:观察血小板源性生长因子(PDGF)两亚基(PDGF-A和PDGF-B)和两种受体(PDGFR-α和PDGFR-β)在正常皮肤和溃疡组织中基因表达和蛋白含量变化的规律,探讨其与溃疡形成的关系.方法:收集8例难愈性皮肤溃疡患者的溃疡组织和正常皮肤组织,提取各组织的总RNA后,分离mRNA,用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α和PDGFR-β基因在不同组织中的表达量.结果:在正常皮肤组织内,PDGFR-α和PDGFR-β的基因表达较强,分别为(12.1±2.6)%和(13.8±4.6)%,而在溃疡组织中这两种受体的基因表达水平显著降低,分别为(5.0±1.2)%和(4.7±1.7)%,差异均有显著性(P均＜0.05).溃疡组织中PDGFR-α和PDGFR-β的基因表达量分别是正常皮肤的41.3%和34.1%;而PDGF-A和PDGF-B基因表达水平在正常皮肤和溃疡组织内差异不显著(P均＞0.05).结论:溃疡创面难愈性修复可能与PDGFR-α和PDGFR-β基因表达水平下降,引起PDGF与受体结合发生障碍相关.     

角质干细胞及其在皮肤组织工程中的应用前景

表皮是一种持续更新的组织,其更新过程始于基底层的角质干细胞的增殖与定向分化,在向上迁移的过程中,经历程序化的终末分化,最后成为死亡的角化扁平细胞从皮肤表面脱落.在正常稳定状态下,干细胞的增殖与表层细胞的丢失保持着精确的平衡[1].角质干细胞有两个重要特征:一是在体内属于静止的或慢细胞周期的细胞;二是具有无限的增殖潜能[2,3].由于这两个特点,角质干细胞近年来受到广泛关注,尤其在基因治疗和组织工程领域.本文就角质干细胞的研究进展及其在组织工程中的应用前景作一综述.