Ku80分子表达对肝癌细胞DNA双链损伤水平的影响

目的 观察Ku80分子表达对肝癌细胞DNA双链损伤水平的影响.方法 Western blot检测40例肝癌和癌周组织中γ-H2AX和Ku80表达水平;将Ku80基因转染到SMMC7721细胞;免疫荧光和Western blot检测y-H2AX焦点分布和蛋白表达.结果 γ-H2AX在肝癌组织中的表达与癌周比较明显增高(31/40,77.5％),而Ku80表达明显减低(30/40,75％),γ-H2AX表达上调与Ku80表达下调相关(P＜0.05);筛选获得稳定高表达Ku80的克隆细胞;免疫荧光结果显示,Ku80 高表达克隆γ-H2AX焦点数目与对照组比较明显减低(P＜0.01);Western blot显示,Ku80高表达克隆γ-H2AX表达与对照组比较明显减低.结论 Ku80表达下调与肝癌细胞的DNA双链损伤相关,Ku80分子表达可减低肝癌细胞DNA双链损伤水平.     

柠檬酸钠对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的 探讨柠檬酸盐对胃癌细胞的影响及其机制.方法 将胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901各分成对照组、5mmol/L组、10 mmol/L组,分别用0、5、10 mmol/L柠檬酸钠处理.24、48h后,荧光显微镜下观察细胞增殖变化、进行活细胞计数、计算细胞增殖抑制率；应用4’,6-二.脒基-2-苯基吲哚(DAPI)细胞核染色和流式细胞仪检测细胞凋亡；24h后蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白表达.结果 5、10 mmol/L组活细胞计数均低于对照组,细胞增殖抑制率均高于对照组(P＜0.05)；DAPI染色显示凋亡细胞核变化特点.流式细胞仪凋亡检测显示,BGC-823/SGC-7901对照组、5、10 mmol/L组,24h后凋亡率分别为(10.68±1.20)％/(11.86±0.20)％,(46.36±0.60)％/(50.72±1.90)％,(58.41±3.50)％/(59.92±2.60)％；48 h后分别为(8.20±1.60)％/(4.99±0.90)％,(76.34±2.70)％/(82.92±2.80)％,(87.18±3.10)％/(95.65±1.30)％.5、10 mmol/L组与对照组比较细胞凋亡率增高(P＜0.05),并有浓度和时间依赖性.Western blot法显示两株细胞中多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、活化Caspase-9(cleaved Caspase-9)、活化Caspase-3(cleaved Caspase-3)表达增高,髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)表达降低,在SGC-7901中突变型p53( Mtp53)表达降低.结论 柠檬酸钠能有效抑制胃癌细胞增殖,并经线粒体通路诱导凋亡,其作用随浓度和作用时间增加而增强.其机制可能与Mcl-1表达降低有关.     

吗啡对胃癌细胞Survivin和Caspase-9表达的影响

目的 观察吗啡对人胃癌MGC-803细胞Survivin和Caspase-9基因表达的影响.方法 胃癌MGC-803细胞分为两组:对照组和吗啡组.对照组不加任何药物,吗啡组将吗啡加入细胞培养液中使吗啡终质量浓度为0.1 μmol/L.孵育24h后应用流式细胞仪检测细胞凋亡,并应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测胃癌MGC-803细胞中Survivin和Caspase-9基因mRNA和蛋白的表达.结果 吗啡组胃癌细胞凋亡率为(17.20±2.95)％,明显高于对照组的凋亡率(11.40±2.86)％(P＜0.05);RT-PCR和Western blot结果显示,吗啡组胃癌细胞中Survivin mRNA和蛋白表达降低,而Caspase-9 mRNA和蛋白表达增高(P＜0.05).结论 0.1μmol/L吗啡通过抑制Survivin的表达、增强Caspase-9的活性而促进胃癌细胞的凋亡.     

WWOX表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨含有WW结构域的氧化还原酶基因(WWOX)表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 用脂质体转染法将WWOX重组真核表达质粒转染QBC939细胞;采用荧光定量逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法鉴定WWOX在QBC939细胞中的表达;流式细胞仪(FCM)法检测转染前后各细胞凋亡率的变化;JC-l染色法检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;荧光定量RT-PCR和Western blot法检测胆管癌细胞bcl-2表达的变化;将未转染和转染空质粒的细胞作为对照组接种到裸鼠皮下以检测荷瘤,TUNEL方法原位检测移植瘤的凋亡.结果 建立了稳定表达WWOX基因的QBC939/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.FCM显示QBC939/WWOX组的细胞凋亡率明显增高[(1.24±0.35)％比(1.73±0.48)％比(21.40±2.35)％,P＜O.01],JC-l显示转染组的线粒体膜电位下降[(4.27±0.64)％比(4.96±0.52)％比(28.60±3.94)％,P＜O.01],bcl-2 mRNA及蛋白的表达均显著降低(P＜0.05).转染组的皮下肿瘤较对照组生长速度明显减慢(P＜0.05),TUNEL实验证实转染组的皮下肿瘤凋亡指数为(13.6±1.5)％,较对照组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.O1).结论 WWOX基因能促进胆管癌细胞的凋亡,其机制可能与下调bcl-2的表达,激活线粒体凋亡通路有关.     

N端α位乙酰基转移酶10在甲状腺癌中的表达及其对TPC-1甲状腺癌细胞中可溶性Fas受体表达的影响

目的探讨N端α位乙酰基转移酶10(Naa10)在甲状腺癌中的表达及对TPC-1甲状腺癌细胞中可溶性Fas受体(sFas)表达的影响。方法蛋白质印迹法(Western blot)及实时荧光定量-聚合酶链反应(Real-time PCR)检测甲状腺癌及癌旁组织中Naa10蛋白及mRNA表达, 将TPC-1细胞随机分为siRNA Naa10(siRNA组)和siRNA NC组(对照组), 培养48 h, Western blot及Real-time PCR检测Naa10蛋白及mRNA表达, MTT法检测细胞活力, 细胞克隆形成实验检测细胞克隆能力, Hoechst染色检测细胞凋亡, 酶联免疫吸附法(ELISA)及Real-time PCR法检测sFas、sFas配体(sFasL)蛋白及mRNA表达, Western blot法检测剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved Caspase)-3、cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-9蛋白表达, 组间比较采用t检验。结果癌症组Naa10蛋白及mRNA表达量高于癌旁组(0.78±0.07比0.32±0.0...     

PTEN-PI3K/AKT信号传导途径对胃癌细胞株MKN28凋亡的影响

目的 探讨PTEN-PI3 K/AKT信号传导途径对胃癌细胞株MKN28凋亡的调控作用及其机制.方法 构建PTEN真核表达载体,转染至胃癌细胞株MKN28中(转染组);同样方法转染空载体和等量的PBS分别作为阴性对照组和空白对照组,检测对胃癌细胞株MKN28凋亡的影响及对PI3K、AKT、Caspase-3、Caspase-9的影响.MTT检测细胞生长曲线,TUNEL染色法检测细胞凋亡,Western blot检测蛋白的表达.PI3K抑制剂LY294002处理未转染PTEN的胃癌细胞株MKN28(处理组);对照组加入等量的PBS,抑制PI3K活性后检测细胞凋亡蛋白及凋亡相关蛋白的表达.组间比较采用t检验,时间依赖性检验采用相关分析方法.结果 成功构建PTEN真核表达质粒并转染至胃癌细胞株MKN28中,获得稳定过表达PTEN的细胞模型.MTT检测发现转染组胃癌细胞株MKN28生长明显受到抑制,且呈时间依赖性(r =0.938,P＜0.05).转染组平均凋亡率达到27.86％ ±4.78％,明显高于阴性对照组的0.01％±0.01％(t=9.527,P＜0.05).转染PTEN后,转染组PI3K蛋白表达量为0.25±0.03,明显低于空白对照组的0.93 ±0.16及阴性对照组的0.96±0.15(t=7.235,8.883,P＜0.05).转染组活化的AKT (P-AKT)蛋白表达量为0.21±0.03,明显低于空白对照组的0.93 ±0.13及阴性对照组的0.91±0.12(t =9.347,9.802,P＜0.05).而转染组凋亡相关蛋白Caspase-3及Caspase-9表达量分别为0.86±0.11和0.87±0.12,明显高于阴性对照组的0.16±0.03和0.18 ±0.04及空白对照组的0.15±0.02和0.16 ±0.03(t=10.634,10.999,9.448,9.942,P＜0.05).抑制PI3K活性后,处理组细胞凋亡率为28.60％ ±4.50％,明显高于对照组的0.12％±0.06％(t=10.961,P＜0.05).Western blot检测发现处理组PI3K和P-AKT的蛋白表达量分别为0.18 ±0.02和0.11 ±0.01,明显低于对照组的0.93 ±0.14和0.90 ±0.12(t =9.186,11.363,P＜0.05);同时处理组PTEN的蛋白相对表达量为1.15 ±0.15,明显高于对照组的0.21±0.08(t =9.577,P＜0.05).处理组的凋亡相关蛋白Caspase-3及Caspase-9相对表达量分别为0.86 ±0.12和0.88 ±0.11,明显高于对照组的0.25±0.02和0.21±0.03(t =8.685,10.178,P＜0.05).结论 高表达PTEN可以抑制PI3K/AKT途径,促进胃癌细胞凋亡;抑制PI3K途径可以促进PTEN的表达,两者之间相互作用,共同调控着胃癌细胞的凋亡.     

短发卡状RNA抑制AKT2对肝癌细胞增殖及侵袭的影响

目的 探讨短发卡状RNA(siRNA)抑制AKT2对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移的影响.方法 设计并合成特异性靶向AKT2的siRNA片段并构建SMMC7721AKT2 siRNA表达质粒,将其转染SMMC7721细胞,通过G418筛选出稳定株.MTT法检测肝癌SMMC7721细胞的生存率变化;流式细胞术检测细胞周期;Western- blot检测P27、CyclinD1;Transwell实验和划痕实验分析细胞侵袭、转移能力的改变.结果 MTT检测显示AKT2干扰可抑制SMMC7721细胞的生长,与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞术显示AKT2干扰组细胞周期阻滞于G1期,G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降.Western- blot检测显示CyclinD1表达下降,P27的表达上升.Transwell试验和划痕试验显示AKT2干扰组的侵袭和转移能力受到抑制.结论 AKT2基因沉默可明显抑制肝癌SMMC7721细胞的生长并阻滞细胞周期.AKT2基因沉默可抑制肝癌SMMC7721细胞的侵袭和转移能力.     

miR-520激活内质网应激导致滋养细胞凋亡的相关研究

目的探讨miR-520通过激活内质网应激导致滋养细胞凋亡,从而参与复发性流产(RSA)的作用机制。方法利用miR-520慢病毒(实验组)和空载慢病毒(对照组)分别感染人滋养细胞系HTR8细胞,并用嘌呤霉素筛选出稳转株。以未感染细胞为空白对照,利用流式细胞术及荧光显微镜观察确定病毒转染效率、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞miR-520的表达水平;通过CCK-8法测定细胞增殖能力、流式细胞术分析细胞凋亡率、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞损伤程度、Mito-Tracker Red CMXRos试剂盒检测线粒体膜电位变化;通过Western blot检测凋亡通路中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9以及cleaved Caspase-12水平的变化,同时检测内质网应激相关蛋白CHOP、葡萄糖调节蛋白GRP78的水平变化。结果与对照组比较,miR-520在人滋养细胞系HTR8细胞中过表达后,HTR8细胞增殖能力显著下降(P0.05),LDH活性升高(P0.05),HTR8细胞线粒体膜电位降低(P0.05),细胞凋亡数显著增加(P0.05);凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9以及cleaved Caspase-12水平均有不同程度的增高(P0.05),同时内质网应激相关蛋白CHOP、GRP78表达水平上调(P0.05)。结论 miR-520可能通过激活内质网应激诱导HTR8细胞发生凋亡,从而参与RSA的发生。     

鞘氨醇激酶1表达下调对肿瘤Hela细胞增殖和细胞凋亡的影响及其机制

目的 观察鞘氨醇激酶1(SphK1)表达下调对肿瘤Hela细胞增殖和细胞凋亡的影响,并探讨其分子机制.方法 将SphKl siRNA和对照siRNA转染肿瘤Hela细胞,转染后将细胞分为3组:未转染组、siRNA对照组和SphK1 siRNA组.应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot技术检测转染SphK1 siRNA后SphK1 mRNA和蛋白的表达.采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和流式细胞术分别检测3组细胞增殖和细胞凋亡的变化.进一步利用Westem blot技术检测与细胞增殖和细胞凋亡密切相关蛋白的表达.结果 SphK1 siRNA组中SphK1 mRNA和蛋白的相对表达水平(分别为0.153±0.037和0.123±0.037),显著低于未转染组(分别为1.000±0.000和0.688±0.049)和siRNA对照组(分别为0.932±0.039和0.673±0.057)(P＜0.05).细胞增殖结果表明,与未转染组和siRNA对照组比较,SphK1 siRNA组中Hela细胞的增殖明显受到抑制(P＜0.05).流式细胞结果表明,SphK1 siRNA组中Hela细胞早期凋亡细胞数比率为(23.85±0.72)％,显著高于未转染组(11.67±1.02)％和siRNA对照组(11.85±0.71)％,差异有统计学意义(F=211.451,P＜0.05).Western blot检测结果表明,SphK1 siRNA组中p21、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3( Caspase-3)和Caspase-9蛋白的相对表达水平(分别为0.381±0.025、0.406±0.041和0.374±0.035),显著高于未转染组(分别为0.127±0.039、0.064±0.023和0.115±0.039)和siRNA对照组(分别为0.125±0.034、0.060±0.018和0.126±0.038)(P＜0.05).结论 SphK1可能与宫颈癌的发生发展密切相关,其表达下调介导的增殖抑制和细胞凋亡可能与p21、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的上调密切相关.     

微小RNA-181b及其靶基因肝癌缺失基因-1在肝癌发生中的作用

目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-181b对肝癌缺失基因-1(DLC-1)的调控及其在肝癌发病中的作用.方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Western blot检测4份正常肝脏组织,17份癌旁组织、肝癌组织及肝癌SMMC7721细胞、胚肝LO2细胞中miR-181b和DLC-1的mRNA和蛋白质表达水平.应用miR-181b抑制剂下调肝癌细胞SMMC7721中miR-181b表达后,实时定量聚合酶链反应和Westem blot检测SMMC7721细胞中DLC-1表达水平的变化.结果 miR-181b在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.162 ±0.004、0.175±0.021和0.656±0.034,肝癌组织高于正常肝组织(P＜0.05).miR-181b在SMMC7721细胞中的表达较LO2细胞上调(0.723±0.042和0.262±0.037,P＜0.01).DLC-1 mRNA在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.392±0.094、0.187 ±0.043和0.081 ±0.012,肝癌组织低于正常肝组织(P＜0.05);DLC-1蛋白在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.423±0.026、0.214±0.029和0.112±0.021,差异有统计学意义(P＜0.01).miR-181b抑制剂转染SMMC7721细胞后,DLC-1蛋白在空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为0.132±0.027、0.379±0.019和0.125±0.015,转染组较其他两组明显升高(P＜0.05).结论 miR-181b在肝癌组织中表达上调,其抑制DLC-1的表达可能是肝癌发生的重要机制.     

Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡及细胞结构的变化

目的采用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中Survivin基因的表达，研究其诱导细胞凋亡过程中对细胞超微结构与细胞骨架的作用及其机理。方法采用脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞，Western—blot及原位杂交方法检测Survivin蛋白及mRNA表达，流式细胞仪检测细胞凋亡比率，透射电子显微镜观察细胞超微结构变化，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝系统变化，激酶活性检测方法测定细胞内Caspase-3活性变化。结果脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后Survivin蛋白及mRNA表达分别由69．59及75．60降低至10．71及22．90，Caspase-3活性由0．0153升高至0．0992，同时细胞结构呈典型凋亡改变，细胞内微丝形态结构破坏，细胞凋亡比率由0．7％增加至31．4％。结论脂质体介导转染Survivin反义寡核苷酸可以有效降低细胞内Survivin基因的表达，并激活Caspase-3。活化的Caspase-3可以切割破坏细胞内骨架微丝系统的结构，进而诱导细胞凋亡。     

Aurora激酶抑制剂对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察Aurora激酶抑制剂VX-680对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株增殖和凋亡的影响.方法 不同浓度的VX-680处理MDA-MB-231细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化,用噻唑监(MTT)比色法和克隆形成实验检测乳腺癌细胞增殖,碘化丙锭(PI)单染法检测细胞周期,免疫荧光观察核和纺锤体形态变化,免疫印迹法检测AuroraA/B蛋白、组蛋白和凋亡相关蛋白表达,Yo-Pro-1荧光染色观察细胞凋亡形态学变化.结果 VX-680显著抑制MDA-MB-231增殖,24、48 h半数抑制浓度( IC50)分别为(2.362±0.599)、(0.102±0.556) μmol/L;经药物作用24h后,贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落;克隆形成率南( 93.00 ±0.03)％降至(0.01±0.01)％,G0/G1期细胞由(51.27±0.75)％降至(5.87±0.49)％,G2/M期细胞由(17.67±1.25)％升高至(91.93±1.96)％,荧光染料法显示凋亡细胞数由(4.33±0.03)％增高至(44.00±0.04)％,实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);细胞核与纺锤体结构紊乱;免疫印迹检测提示磷酸化AuroraA/B、磷酸化Histone H3表达水平降低,Caspase-3和PARP被剪切.结论 VX-680抑制乳腺癌细胞MDA-MB231增殖、诱导凋亡呈剂量依赖性.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ对人肝癌细胞生长和凋亡的影响及其机制

目的 检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在人肝癌、癌旁和正常肝组织的表达,探讨激活或抑制PPARγ在肝癌细胞株生长和凋亡中的作用及其机制.方法 应用免疫组织化学方法检测20例肝癌、癌旁和正常肝组织中PPARγ的表达,Western blot检测2种肝癌和1种正常肝细胞株中PPARγ表达;PPARγ激动剂15dPGJ2和拮抗剂T0070907分别干预培养的2种肝癌细胞株,噻唑蓝(MTT)检测细胞生存率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期及凋亡,试剂盒检测Caspase-3活性变化.结果 肝癌组织中PPARγ表达高于癌旁和正常肝组织(P＜0.05),PPARγ主要在肝癌细胞质中表达;肝癌细胞株PPARγ表达比正常肝细胞株高(P＜0.05);15dPG-J2抑制肝细胞增殖而T0070907则促进肝癌细胞增殖(P＜0.05).15dPG-J2可使肝癌HepG2和SMMC7721细胞G0/G1期细胞比例由(42.5±0.9)%和(49.0±3.8)%增高至(61.0±2.0)%和(67.5±2.2)%,(P＜0.05),S期由(30.5±0.3)%和(43.0±2.5)%降低至(6.6±1.1)%和(25.1±2.0)%(P＜0.05).而且,15dPG-J2可明显促进两种肝癌细胞凋亡,凋亡率分别增加约24.4%和22.4%,并可增强细胞Caspase-3活性(P＜0.05);Caspase抑制剂Z-VAD-FMK则可逆转15dPG-J2对肝癌细胞的促凋亡作用.结论 PPARγ在肝癌细胞中表达升高,其表达主要位于细胞质中,为无活性状态.PPARγ激动剂可活化PPARγ和Caspase通路,抑制肝癌细胞生长,促进细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) in human liver cancer tissue and cells, and to explore the effects and mechanisms of PPARγ on growth and apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells. Methods The expression of PPARγ in 20 cases of liver cancer, tumor adjacent tissue, normal liver, one liver cell line and two liver cancer cell lines were detected by immunohistochemistry or Western blotting. Two incubated malignant cell lines were exposed to PPARγ agonist 15dPGJ2 or antagonist T0070907, cell viability was determined by methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay and cell cycle distribution and apoptosis were examined by flow cytometry (FCM). Consequently, the activity of caspase-3 following treatments of 15dPGJ2 or T0070907 was observed by the commercial Caspase-3 Activity Kit. Results The expression of PPARγin liver cancer was higher than that in adjacent and normal liver tissue ( P ＜ 0. 05) and PPART was predominantly expressed in the cytoplasm. Further,the expression of PPARγwas higher in hepatoma cell line than that in normal liver cell line (P＜ 0.05 ). PPARγ agonist 15dPG-J2 inhibited the proliferation while the antagonist T0070907 induced the growth of hepatoma cells (P ＜ 0. 05). G0/G1 phase of HepG2 and SMMC772 cells was blocked by 15dPG-J2, and the ratio were raised from (42.5 ±0.9)% and (49.0 ±3.8)% to (61.0 ±2. 0)% and (67.5 ±2. 2)% ,respectively. Meantime,S phase ratio were decreased from (30. 5 ± 0. 3 ) % and (43.0 ± 2. 5 ) % to ( 6. 6 ± 1. 1 ) % and ( 25. 1 ± 2. 0 ) %. Further, 15 dPG-J2 facilitated significant apoptosis in those cell lines and the increased apoptosis ratio were 24. 4% and 22. 4% respectively.Accordingly,the activity of Caspase-3 induced by 15dPGJ2 were 21-and 23-fold higher than those in control groups (P ＜ 0. 05 ). The Caspase inhibitor Z-VAD-fmk expectedly reversed the apoptosis induced by 15dPGJ2 in HepG2 and SMMC772 cells. Conclusion The expression of PPARγ increases in human hepatoma predominantly in cytoplasm with its inactivated form. 15dPG-J2 ,an agonist of PPART inhibits growth and induces apoptotic in hepatoma cells through activation of PPARγ pathway and the consequent Caspase3 signal.     

受体作用蛋白在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导凋亡耐受中的作用

目的 观察受体作用蛋白(RIP)基因的表达变化在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡耐受中的作用.方法 以肝癌细胞HepG2、Hep3B为研究对象,制备RIP siRNA的细胞模型,应用流式细胞仪分析两种细胞模型对TRAIL作用后细胞周期的变化,Western blot检测其在RIP基因沉默前后凋亡信号传导蛋白Caspase-8、Caspase-3、DFF-45的表达变化.结果 转染RIP siRNA后,细胞恢复了对TRAIL诱导凋亡的敏感性,当TRAIL浓度为100 μg/L时,HepG2及Hep3B转染组的细胞生存率为(60.02±5.23)％和(50.78±3.76)％,显著低于对照组的(96.44±5.43)％和(101.85±6.41)％(P＜0.01);细胞生存周期SubG1期为(76.89±6.68)％和(72.45±7.31)％,显著高于对照组的(0.78±0.07)％和(3.62±0.38)％(P＜0.01).转染组TRAIL单独作用,可以引起HepG2 siRNA及Hep3B siRNA凋亡传导通路上传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解.结论 肝癌细胞对TRAI诱导凋亡的耐受可能与其传导通路上RIP蛋白的表达相关,抑制其表达可以导致凋亡传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解,促使凋亡的发生,恢复肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性.     

携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24对肝癌细胞凋亡的影响

目的 观察携带人mda-7/IL-24的溶瘤腺病毒SG600-IL24对各种不同转移潜能肝癌细胞HepG2、SMMC7721、MHCC97L和正常肝细胞LO2的作用.方法将携带人mda-7/IL-24的溶瘤腺病毒SG600-IL24分别感染人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、MHCC97L和正常肝细胞LO2,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blot检测mda-7/IL-24基因和蛋白的表达,MTT观察肝癌细胞的生长抑制,Hoechst33258和流式细胞仪(FCM)检测细胞的凋亡,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期.结果 RT-PCR和Western blot显示mda-7/IL-24在肝癌细胞和正常肝细胞中高表达,ELISA提示细胞培养上清液中mda-7/IL-24蛋白也明显增加.MTT和流式细胞仪提示mda-7/IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长(生长抑制率分别为75%±2.5%,86%±3.5%,72%±1.8%,HepG2∶F=5.86,SMMC7721∶F=7.98,MHCC97L∶F=5.13,均P<0.01),促进肝癌细胞的凋亡(凋亡抑制率分别为56.5%±4.0%,34.4%±2.0%,43.3%±2.5%,HepG2∶F=203.4,SMMC7721∶F=130.5,MHCC97L∶F=160.6,均P<0.01),阻滞肝癌细胞在G2/M期(G2/M期阻滞分别为35.4%±4.2%,40.5%±5.0%,42.0%±5.0%,HepG2∶F=112.5,SMMC7721∶F=133.2,MHCC97L∶F=145.5,均P<0.01),而对正常肝细胞没有明显的促进凋亡和增殖阻滞作用.结论 溶瘤腺病毒SG600-IL24能特异性杀伤不同转移潜能人肝癌细胞和诱导凋亡,促进肝癌细胞增殖阻滞,而对正常肝细胞无明显促进凋亡和增殖阻滞作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of oncolytic adenovirus vector SG600-IL24expressing human melanoma differentiation associated gene-7 (mda-7/IL-24) on hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potential of HepG2, SMMC7721, MHCC97L and normal liver cell line LO2. Methods The oncolytic adenovirus SG600-IL24 which carrying mda-7/IL-24 gene was transfected into hepatocellular carcinoma cell lines and normal liver cell line. The mRNA and protein expression of mda7/IL-24 in HepG2, SMMC7721, MHCC97L and LO2 cell lines was confirmed by RT-PCR,ELISA assay and Western blot respectively. MTT assay and flow cytometry were used to study tumor cell proliferation and cell cycle in vitro. Hoechst33258 and flow cytometry were studied to indicate the apoptosis effects. Results It was confirmed by RT-PCR, ELISA assay and Western-blot that the exogenous mda-7/IL-24 gene was highly expressed in HepG2, SMMC7721, MHCC97L and LO2 cell lines. MTT and apoptosis detection indicated that MDA-7/IL-24 can induce the growth suppression (the inhibition rate was 75% ±2. 5% ,86% ±3. 5% ,and promotes apoptosis ( the apoptosis rate was 56. 5% ± 4. 0% , 34. 4% ± 2. 0% , 43. 3% ± 2. 5%cell lines at G2/M phase ( the blocking rate was 35. 4% ± 4. 2% , 40. 5% ± 5. 0% , 42. 0% ± 5. 0%metastatic potential hepatocellular carcinoma cell lines but not in normal liver cell line.Conclusions Oncolytic adenovirus vector SG600-IL24 can selectively induce growth suppression, promote apoptosis in hepatocellular carcinoma lines in vitro but not in normal liver cell LO2.     

抑制自噬对5-氟尿嘧啶治疗肝癌疗效的影响及机制研究

目的研究自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导肝癌细胞系SMMC7721凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法利用单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色技术,在荧光显微镜下对细胞自噬进行定性观察;以CCK8法检测3-MA抑制细胞自噬前后经5-FU诱导SMMC7721细胞的存活,凋亡以AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法检测;以Western blot法分别检测自噬特异性蛋白LC3及凋亡蛋白caspase-3活化片段和PARP裂解片段的表达。结果 5-FU处理肝癌SMMC7721细胞48 h后,可诱导其发生自噬,细胞存活率为（60.73±2.65）%,凋亡率为（40.42±2.34）%;联合应用3-MA处理48 h后,可使肝癌SMMC7721细胞存活率明显降低（P〈0.01）,为（42.31±1.32）%,而细胞凋亡率显著增加（P〈0.01）,为（60.92±2.99）%,同时引起自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ及凋亡蛋白caspase-3活化片段和PARP裂解片段表达增加,其灰度值比较差异均有统计学意义（均P〈0.01）。结论自噬在5-FU诱导肝癌细胞系SMMC7721凋亡过程中起保护性作用,抑制自噬可提高肝癌SMMC7721细胞对5-FU的敏感性,其可能主要通过激活caspase-3及剪切PARP来实现的。因此,自噬特异性抑制剂3-MA可能为提高肝癌对5-FU的敏感性提供新思路。     

TSA对人肝癌细胞株E-cadherin启动子区甲基化及表达的影响

目的 探讨去乙酰化转移酶抑制剂TSA对人肝癌SMMC-7721细胞株E-cadherin基因(E-cad)启动子区甲基化及其表达的影响.方法 TSA(300 nm/L)处理人肝癌SMMC-7721细胞,MTT法、TUNEL染色法分别检测细胞生长抑制及凋亡情况,甲基化特异性的PCR(methylation-specificPCR,MSP)检测处理前后E-cad启动子区CpG岛甲基化状态;Western blot检测处理前后E-cad及DNMT3b表达水平的变化.结果 TSA能抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长并诱导其发生凋亡,与对照组相比,实验组细胞生长抑制率为21.85%,对照组细胞凋亡率为(4.69±0.56)%,实验组凋亡率为(14.94±0.91)%,与对照组相比,凋亡细胞明显增多(P=0.000).用药前E-cad启动子区CpG岛为甲基化状态,E-cad蛋白表达阴性.TSA处理后E-cad启动子区CpG岛发牛脱甲基化,E-cad蛋白恢复表达.TSA亦导致DNMT3b的表达水平降低. 结论去乙酰化转移酶抑制剂TSA能抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长,并可诱导其发生凋亡,逆转E-cad基因启动子区的甲基化状态,并恢复该基因表达.TSA有可能通过DNMT3b发挥脱甲基化作用.     

miR-1246在肝癌组织中的表达及其对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察微小RNA-1246（miR-1246）在肝癌组织中的表达及其对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨其在肝癌发生发展中的作用和意义。方法应用实时定量PCR（qRT-PCR）方法检测miR-1246在肝癌以及癌旁组织的表达;对人肝癌细胞株（BEL7402、SMMC7721）转染miR-1246 抑制剂后,采用MTT法观察肝癌细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 miR-1246 在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织[（65.39±8.77）vs（10.23±2.58）,P=0.002]。MTT和凋亡实验结果显示,与阴性对照组相比,转染miR-1246抑制剂后,BEL7402细胞增殖能力下降,凋亡增加（P均＜0.05）;SMMC7721细胞也出现增殖能力下降,凋亡增加（P均＜0.05）。结论 miR-1246 在肝癌组织中高表达,并且与肝癌细胞的增殖及凋亡有关,其表达的上调可能与肝癌的发生发展有关。