铜绿假单胞菌感染大鼠皮肤创面愈合过程中TGF-β1及胶原蛋白含量的变化

目的 探讨大鼠慢性皮肤溃疡创面感染铜绿假单胞菌后,TGF-β1和胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白表达的变化.方法 24只8周龄雌性Wister大鼠随机分为单纯创面组(A组)和创面+铜绿假单胞菌接种组(B组).分别在术后第1、3、7、10天观察创面上皮化率、收缩率及中性粒细胞情况;并采用ELISA方法测定创面第1、3、7、10天TGF-β1和胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白的表达情况.结果 A组上皮化率在第7天高于B组,收缩率低于B组.随着时间的延长,A组中性粒细胞在第3天增加到最多,随后逐渐减少,而B组中性粒细胞第1天达到最多.2组TGF-β1表达在术后呈上升趋势,B组TGF-β1在第3天降低,随着时间延长回升,第7天2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白表达随着时间的延长呈下降趋势,B组胶原Ⅲ蛋白表达在第7、10天差异有统计学意义(P＜0.05).A组第1、3天胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白表达高于B组,在第7、10天则低于B组,且胶原Ⅲ蛋白在第3天显示A组高于B组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 皮肤溃疡创面感染铜绿假单胞菌后延迟了TGF-β1和胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白的表达,可能影响创面的正常愈合.

Abstract：

Objective To explore the different expression of TGF-β1 and collagen during the healing process of wound infected by pseudomonas aeruginosa(PAO1).Methods 24 female Wister rats were randomly divided into pure wound group(group A)and wound+PAO1 group(group B).The reepithelial rate,shrinkage rate and neutrophils number on the wounds were observed on the 1st,3rd,7th and 10th day after operation.The expression of TGF-β1 and collage Ⅰ,Ⅲ was also detected.Results On the 7th day,the re-epithelial rate in group A was higher than that in group B,while the shrinkage rate in group A was lower than that in group B.The neutrophils number increased to peak on the 1 st day in group B,but on the 3rd day in group A.The TGF-β1 expression increased after operation in both groups,but it decreased in group B on the 3rd day and re-increased after that.The TGF-β1 expression was significantly different between the two groups on the 7th day(P＜0.05).The expression of collagen Ⅰ and Ⅲ decreased during healing.The expression of collagen Ⅲ in group A was higher on the 3rd day and was lower on the 7th and 10th day than that in group B,showing a significant difference(P＜0.05).Conclusions PAO1 infection could delay the expression of TGF-β1 and collagen Ⅰ,Ⅲon wound,which may interfere the healing process of wound.     

hBMSCs诱导分化类髓核细胞

目的 探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β,和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞.方法 取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40 mL分离培养hBMSCs.取第4代hBMSCs行三维微球培养.根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10 ng/mL TGF-β3组(A组)、200 ng/mL BMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组).于培养后21 d,行组织学及免疫组织化学观察:于培养后4、21 d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达.结果 培养后21 d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性.B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21 d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4 d时明显增加(P＜0.05).B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P＜0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ犁胶原较4d时无明显变化(P＞0.05).其中仅A组X型胶原表达呈阳性.结论 TGF-β,和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞.     

体外诱导人羊膜间充质干细胞向韧带细胞分化的实验研究

目的探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs的特性及经诱导后在体外能否向韧带细胞分化。方法取产妇胎盘通过酶消化法获得h AMSCs,流式细胞术鉴定h AMSCs表型特征。取第3代h AMSCs分别加入含不同诱导液的L-DMEM/F12培养基:A组TGF-β1+b FGF,B组透明质酸(hyaluronic acid,HA),C组TGF-β1+b FGF+HA,D组为空白对照组。倒置相差显微镜观察诱导后21 d各组细胞形态学变化;磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法检测各组细胞生长活性;诱导后7、14、21 d分别采用免疫组织化学染色及实时荧光定量PCR检测韧带特异性蛋白和基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、肌腱蛋白C(tenascin C,TNC)表达。结果流式细胞术鉴定结果表明h AMSCs表达MSCs表型。倒置相差显微镜观察示诱导21 d A、B、C组细胞均呈长梭形纤维细胞样生长,C组细胞形态更单一、有明显方向性且较A组排列更紧凑。SRB比色法检测示各组细胞于培养6 d左右达增殖高峰,6 d时A、B、C组细胞活性均显著高于D组。免疫组织化学结果示:诱导培养7 d,各组均未检测到TNC表达;7、14、21 d A、B、C组Ⅰ型胶原表达均显著高于D组,14、21 d A、B、C组Ⅲ型胶原表达显著高于D组,差异均有统计学意义(P0.001)。B组Ⅰ型胶原表达以及A、C组Ⅲ型胶原、TNC表达随时间增加均呈逐渐增高趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.001)。实时荧光定量PCR结果示:诱导培养21 d,C组Ⅰ型胶原、TNC m RNA相对表达量显著高于A、B组,B组Ⅲ型胶原m RNA相对表达量显著高于A、C组,差异均有统计学意义(P0.05)。A、C组Ⅰ型胶原、TNC以及C组Ⅲ型胶原m RNA相对表达量随时间增加呈逐渐上调趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.001)。结论 h AMSCs具有MSCs的特性,有良好增殖能力,经体外诱导后韧带特异性基因表达上调,韧带特异性蛋白合成增加,可作为韧带组织工程种子细胞来源之一。     

透明质酸对创面胶原代谢的影响

目的:通过观察外源性透明质酸(HA)对兔耳创面胶原代谢的影响,探讨外源性透明质酸在伤口愈合中的作用.方法:18只日本大耳白兔,建立兔耳创伤愈合模型后,随机分成2％HA治疗组(A组),1％HA治疗组(B组)和生理盐水对照组(C组).观察创面愈合及瘢痕形成情况,术后第3、7、10、14、18天取标本匀浆后测定羟脯氨酸(HPr)含量,将数据进行统计学处理.结果:A、B两组羟脯氨酸含量明显低于C组(P＜0.01),A、B两组间也有统计学差异(P＜0.05).A、B两组创面愈合相对C组延迟,形成瘢痕小于C组.结论:外源性HA能够抑制成纤维细胞合成胶原,延迟创面愈合,减少瘢痕形成,其作用有剂量依赖性.     

细粒棘球绦虫原头节促进BMSCs纤维化的实验研究

目的探讨细粒棘球绦虫原头节对BMSCs向成纤维细胞分化的影响。方法取4周龄C57BL/6小鼠股骨骨髓,利用贴壁培养法分离培养BMSCs;从感染细粒棘球蚴的羊肝中提取细粒棘球绦虫原头节。实验分为2组,实验组取第3代BMSCs和细粒棘球绦虫原头节共培养,对照组为单纯第3代BMSCs。共培养前后倒置显微镜观察BMSCs形态;培养1、3、5、7 d,采用实时荧光定量PCR检测两组BMSCs中TGF-β_1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因表达,Western blot检测两组BMSCs中TGF-β_1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Smad7和磷酸化Smad2/3蛋白表达,ELISA检测两组上清中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量。结果细粒棘球绦虫原头节与BMSCs共培养7 d后观察到BMSCs形态发生改变,变成梭形和不规则三角形,更接近单独培养的小鼠成纤维细胞。培养1、3、5、7 d,实时荧光定量PCR检测示,实验组TGF-β_1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量均显著高于对照组;Western blot检测示,实验组TGF-β_1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、磷酸化Smad2/3蛋白相对表达量均显著高于对照组,Smad7蛋白相对表达量显著低于对照组;ELISA检测示,实验组上清中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量均显著高于对照组。上述指标两组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论细粒棘球绦虫原头节可能通过TGF-β_1/Smad信号通路,促进BMSCs分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β_1,进而促进BMSCs纤维化。     

改性聚乳酸-Ⅰ型胶原荷载骨髓间充质干细胞对糖尿病大鼠创面愈合的影响

目的 观察改性聚乳酸-Ⅰ型胶原荷载骨髓间充质干细胞(BMSCs)对糖尿病大鼠创面愈合的影响.方法 36只糖尿病大鼠,随机分为3组:A组:改性聚乳酸-Ⅰ型胶原+BMSCs实验组;B组:改性聚乳酸-Ⅰ型胶原支架对照组;C组:空白对照组,观察创面愈合及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)阳性细胞角蛋白的表达.结果 A组第3、5、7、14天的创面愈合率分别为(18.20±2.68)％、(30.60±5.50)％、(57.63±9.13)％、(87.35±5.83)％,明显快于B、C组(P＜0.05),A组新生表皮较厚,新生血管及皮肤附属器多于B、C组,免疫组织化学法检测5 -BrdU阳性细胞角蛋白的表达.结论 改性聚乳酸-Ⅰ型胶原荷载BMSCs能促进糖尿病创面的愈合.     

雷帕霉素对大鼠尿道成纤维细胞增殖和胶原形成的影响

目的研究雷帕霉素(RAPA)对体外培养的大鼠尿道成纤维细胞增殖、Ⅰ、Ⅲ胶原分泌以及TGF-β1表达的影响;方法组织块法原代培养雄性SD大鼠尿道成纤维细胞;MTT法检测不同浓度RAPA溶液在不同时间对鼠尿道成纤维细胞增殖和活力的影响;羟脯氨酸比色法测定RAPA干预后成纤维细胞培养上清液胶原含量的变化;RT-PCR检测雷帕霉素对TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ胶原mRNA表达的影响;结果随浓度增加和时间延长体外培养鼠尿道成纤维细胞的吸光度(A值)逐步降低,实验组与对照组间存在显著性差异(P0.05);羟脯氨酸比色法、RT-PCR测定不同浓度(0、10、20、40、80、160ng/mL)RAPA干预前后的成纤维细胞培养上清液胶原含量表达逐渐减少,TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ胶原基因表达降低,各组间均存在显著性差异(P0.05);结论雷帕霉素可抑制大鼠尿道成纤维细胞的增殖、减少胶原生成以及降低细胞内TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ胶原的基因表达,在预防、治疗尿道狭窄中的作用值得进一步研究。     

TGF-β_1诱导的黄韧带细胞增生效应及其对结缔组织生长因子的表达影响

目的探讨TGF-β_1诱导的黄韧带细胞增生效应及其对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响。方法取腰椎椎间盘突出髓核摘除术中的黄韧带组织,采用胶原酶预消化组织块培养法分离培养黄韧带细胞。采用形态学观察、免疫荧光染色观察、MTT法检测细胞增殖情况进行细胞鉴定。取第3代黄韧带细胞分为5组,A、B、C、D组分别于细胞中加入3 ng/mL TGF-β_1、50 ng/mL CTGF、3 ng/mL TGF-β_1+CTGF中和抗体(1∶500)封闭、50 ng/mL CTGF+CTGF中和抗体(1∶500)封闭,E组加入无血清DMEM作为对照。采用MTT法检测TGF-β_1和CTGF对黄韧带细胞增殖的影响,Western blot检测CTGF蛋白表达,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF基因表达。结果培养的黄韧带细胞形态呈多样性,均表现出典型的黄韧带成纤维细胞表型;所有细胞均表达Ⅰ型胶原蛋白及波形蛋白,部分细胞表达Ⅲ型胶原蛋白;MTT鉴定示随培养时间延长,各代细胞吸光度(A)值均逐渐增加,同代细胞各时间点间A值比较差异均有统计学意义(P0.05),相同时间点各代细胞间A值比较差异均无统计学意义(P0.05)。培养24 h MTT法检测示A、B组细胞A值显著高于E组(P0.05);而加入CTGF中和抗体后,C、D组A值降低,但仍高于E组(P0.05);A、C组间及B、D组间比较差异亦有统计学意义(P0.05)。Western blot检测示A、B组CTGF蛋白相对表达量明显高于E组(P0.05);而加入CTGF中和抗体后,C、D组CTGF蛋白相对表达量显著降低,但仍高于E组(P0.05);A、C组间及B、D组间比较差异亦有统计学意义(P0.05)。qRT-PCR检测示,与E组比较,A组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量均显著增高(P0.05);加入CTGF中和抗体后,C组各基因表达受到抑制,mRNA相对表达量显著低于A组,但仍显著高于E组(P0.05)。B组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量显著高于E组(P0.05),但CTGF mRNA相对表达量与E组比较差异无统计学意义(P0.05);加入CTGF中和抗体后,D组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量受到抑制,低于B组,但仍显著高于E组(P0.05),CTGF mRNA相对表达量与B、E组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 TGF-β_1可促进黄韧带细胞的CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因及蛋白表达水平增加,TGF-β_1通过CTGF协同促进黄韧带细胞增生。     

IGFBPrP1对小鼠肝组织胶原含量的影响及其机制的研究

目的 明确外源性胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)对肝组织胶原含量的影响及可能的机制.方法 24只雄性C57BL/6野生型小鼠随机分为3组:正常对照组、rmIGFBPrP1 2周组和rmIGFBPrP1 4周组,每组8只.取肝组织行HE、苦味酸-天狼猩红、免疫组织化学染色及Western blot检测.结果 HE和苦味酸-天狼猩红染色显示外源性rmIGFBPrP1可使肝组织发生病理改变,并导致肝组织中胶原含量显著增多(P＜0.05).Western blot检测显示rmIGFB-PrP1 2周组及4周组肝组织中IGFBPrP1、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)的表达明显增强,且4周组表达量较2周组高(P＜0.01).免疫组织化学染色显示Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ)在rmIG-FBPrP1 2周组及4周组表达量明显增高,且4周组高于2周组(P＜0.01).Western blot及免疫组织化学染色共同显示转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad2/3在rmIGFBPrP1 2周组及4周组表达显著增强,且4周组强于2周组(P＜0.01).结论 外源性IGFBPrP1可通过TGF-β1/Smad3信号通路导致肝组织中胶原含量明显增加、ECM过度沉积.

Abstract：

Objective To investigate the effect and mechanism of exogenous IGFBPrP1 on collagen content in liver tissue. Methods Twenty-four male C57BL/6 wild-type mice were randomly divided into three groups: Control group (n=8), rmIGFBPrP1 2 weeks group (n=8) and rmIGFBPrP1 4weeks group (n=8). Both hematoxylin-eosin (HE) staining and picric acid-Sirius red staining were performed. The protein expression of IGFBPrP1, Collagen Ⅰ , Collagen Ⅲ, FN, TGF-β1, Smad3 andp-Smad2/3 was evaluated by immunohistochemistry or Western blot. Results Exogenous IGFBPrP1 can cause pathological changes in liver tissue. Collagen content was significantly increased by hematoxylin-eosin (HE) staining and picric acid-Sirius red staining (P＜0.05). The protein expression of IGFBPrP1, FN and Collagen Ⅰ was gradually increased after rmIGFBPrP1 injection for 2 weeks and 4 weeks by Western blot (P＜0.01). The protein expression of Collagen Ⅲ was obviously increased in the rmIGFBPrP1 2 weeks group and rmIGFBPrP1 4 weeks group by immunohistochemistry, and the level in the 4 weeks group was higher than that in the 2 weeks group (P＜0. 01). The protein expression of TGF-β1, Smad3 and p-Smad2/3 in liver tissue was significantly increased after rmIGFBPrP1 injection in a time-dependent manner by both immunohistochemistry and Western blot (P＜0. 01).Conclusion Exogenous IGFBPrP1 can cause a marked increase in collagen content and the excessive deposition of ECM through the TGF-β1/Smad3 pathway in liver tissue.     

血小板源伤口愈合因子促糖尿病大鼠伤口组织胶原合成机制的研究

目的 探讨外源性血小板源伤口愈合因子（PDWHF）促糖尿病大鼠伤口合成胶原与内源性转化生长因子-β（TGF-β1）基因表达的关系。方法 33只雄性SD大鼠,分为正常组（A组n＝9）、糖尿组（n＝24）。四氧嘧啶诱导糖尿病组大鼠血糖值大于1．8g/L1、2天后,在每组大鼠背部造成两块直径为1．8 cm的全层皮肤伤口。术后当天及以后连续6天,每天一次,糖尿病组大鼠一侧伤口局部应用PDWHF（100μg/伤口）作为治疗组（B组）,另一侧伤口作为对照组（C组）。斑点杂交法测定伤后不同天数伤口组织中TGF－β1、Ⅰ型（α1）前胶原mRNA水平量。结果 伤后5、7天,B组伤口组织TGF－β1mRNA水平量是C组的4倍和5．6倍,经统计学处理有非常显著性差异（P＜0．01）,但低于A组（P＜0．05）;伤后10天,三组间TGF-β1mRNA水平量无明显差异。伤后5、7天及10天,B组I型（α1）前胶原mRNA水平量明显高于C组,分别为2．1、1．8和2．3倍有非常显著性差异（P＜0．01）;但伤后5、7天仍明显低于A组（P＜0．05）,伤后10天,两组间差异消失。结论 PDWHF促进糖尿病大鼠伤口内源性TGF－β1基因表达是其增强I型（α1）前胶原合成的重要原因。     

p38丝裂原活化蛋白激酶通路介导TGF-β_1/结缔组织生长因子调控人腰椎黄韧带增生肥厚的机制研究

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路在TGF-β1/结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)调控人腰椎黄韧带增生肥厚中的作用机制。方法取腰椎间盘突出髓核摘除术中获得的黄韧带组织,采用胶原酶预消化组织块培养法分离培养黄韧带细胞。分别用细胞外调节蛋白激酶通路阻断剂PD98059、c-Jun氨基末端激酶通路阻断剂SP600125、p38通路阻断剂SB203580处理黄韧带细胞,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量。然后取黄韧带细胞分为A、B、C、D组,分别以小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、p38 siRNA、siRNA+3 ng/mL TGF-β1、p38 siRNA+3 ng/mL TGF-β1转染细胞,转染24 h后行免疫荧光染色观察p38和磷酸化p38(phosphorylation p38,p-p38)表达,qRT-PCR检测各组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量,Western blot检测各组CTGF蛋白表达。结果 p38通路阻断剂SB203580可明显降低黄韧带细胞CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量(P0.05)。转染24 h后,免疫荧光染色显示A、C、D组细胞呈阳性反应,有p38、p-p38表达,且C、D组强于A组;B组细胞呈阴性反应,无p38、p-p38表达。与A组相比,B组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量以及CTGF蛋白相对表达量显著减少,C、D组显著增加,C组较D组进一步增加,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 p38 MAPK通路介导TGF-β_1/CTGF表达,在人腰椎黄韧带细胞增生肥厚过程中具有重要作用。     

丹参抑制转化生长因子-β1诱导的肌源性干细胞向肌成纤维母细胞分化

目的 观察丹参对失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向肌成纤维母细胞分化的抑制作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,加入转化生长因子-β1(TGF-β1)和丹参进行干预,将细胞分为3组:A:对照组;B:10 μg/L TGF-β1组;C:10 μg/L TGF-β1+ 150 mg/L丹参组.荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞在干预后5个时间点α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin) mRNA和蛋白表达.结果 与A组比较,B组和C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA在干预后第2、3、5、7天均明显升高(P＜0.05),其蛋白表达在干预后第3、4、6、8天亦显著升高(P＜0.05);与B组比较,C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA和蛋白在对应时间点均明显降低(P＜0.05).结论 丹参能抑制TGF-β1诱导的失神经骨骼肌MDSCs向肌成纤维母细胞的分化.     

血竭局部外用对兔耳缺血创面愈合的影响

目的:血竭为传统医学中生肌方剂的主要成分,曾长期应用于临床治疗多种难愈性创面,具有确切的疗效。本课题应用兔耳缺血创面模型,观测血竭对创面愈合的作用。方法:血竭用基质稀释为A1(0.3mg/ml),A2(3mg/ml),A3(30mg/ml),A4(100mg/ml)4种浓度,并以基质A5作对照,作用于兔耳缺血创面,于创面形成后第3、6、9、12天进行大体观察及显微测量,通过苏木精-伊红染色观测创面愈合组织病理变化,天狼猩红染色观察创面愈合过程中Ⅰ、Ⅲ型胶原比例。结果:血竭组A2(13.1±1.7)d、A3(12.3±0.9)d创面愈合速度快于对照组A5(15.7±0.9)d,两者差异具有显著性意义(P0.01);术后3d到术后12d创面愈合过程中,A2,A3组创面愈合面积与对照组差异具有统计学意义(P0.01);A3组新生肉芽组织体积与对照组相比差异有显著意义(P0.01);创面愈合第6天A3组天狼猩红染色Ⅰ、Ⅲ型胶原比值2.23/1大于对照组1.44/1(P0.01),而第15天Ⅰ、Ⅲ型胶原比例与对照组相比无明显差异(P0.05)。结论:血竭能够提高兔耳缺血创面愈合速度,改善创面愈合质量,具有显著促进缺血创面愈合的作用。     

机械张力对兔耳增生性瘢痕的形成及转化生长因子β1/Smad信号通路的影响

目的探讨机械张力对兔耳增生性瘢痕的形成及转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad信号通路的影响。方法采用实验研究方法。取6只3～5个月龄雌雄不拘新西兰大白兔, 于每侧兔耳腹面制作5个全层皮肤缺损创面。观察术后0(即刻)、7、14、21、28 d所有兔耳创面外观。术后28 d, 计算瘢痕形成率。将每只兔左耳的3个成熟瘢痕纳入张力组并采用螺旋扩弓器持续扩弓, 将每只兔右耳的3个成熟瘢痕纳入假张力组并仅缝合螺旋扩弓器不扩弓, 每组共18个瘢痕。经机械张力处理(以下简称处理)40 d, 观察2组兔耳瘢痕组织颜色、质地。处理40 d, 观察并计算瘢痕增生指数(SEI), 分别行苏木精-伊红染色观察组织形态、Masson染色观察胶原形态, 采用实时荧光定量反转录PCR法检测瘢痕组织中TGF-β1、Smad3、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达, 采用蛋白质印迹法检测瘢痕组织中TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA的蛋白表达和Smad3磷酸化水平。以上实验各组样本数均为3。对数据行独立样本t检验。结果术后0 d, 所有兔耳均形成5个新鲜创面;术后7 d, 可见创...     

人Ⅰ型前胶原基因反义寡核苷酸抑制增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成

目的 探讨阳离子脂质体介导Ⅰ型前胶原基因(Col Ⅰ A1)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyneucleotide,ASODN)转染对人增生性瘢痕成纤维细胞Col Ⅰ A1表达的影响.方法 取患者自愿捐赠瘢痕组织,采用组织块法培养人增生性瘢痕成纤维细胞并传代.于6孔板内按32.25×104个/孔的密度接种第4代细胞,根据转染液不同分为4组:A组为脂质体加Col Ⅰ A1 ASODN,B组为Col Ⅰ A1 ASODN,C组为脂质体,D组为空白对照.转染后8 h,1、2、3、4 d分别提取细胞总RNA,行RT-PCR后测定Col Ⅰ A1 mRNA表达量;胃酶消化法提取ECM中Col Ⅰ A1蛋白,ELISA测定其浓度.结果 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳榆测显示条带清晰,无杂带、明显的引物二聚体及拖尾现象.Col Ⅰ A1 mRNA相对表达量:转染后8 h,A组小于B、C、D组,B、C组小于D组,比较差异均有统计学意义(P＜0.05);B、C组间比较筹异无统计学意义(P＞0.05);转染后1 d,A、B组小于C、D组(P＜0.05),A、B组间和C、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05):转染后2 d,各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05);转染后3、4 d,A组小于B、C、D组,B组小于C、D组(P＜0.05),C、D组间差异无统计学意义(P＞0.05).Col Ⅰ蛋白浓度:转染后8 h,A组小于B、C、D组,B、C组小于D组,比较差异均有统计学意义(P＜0.05),B、C组间差异无统计学意义(P＞0.05);转染后1 d,各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05);转染后2、3、4 d,A、B组小于C、D组,C组小于D组(P＜0.05),A,B组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Col Ⅰ A1 ASODN抑制Col Ⅰ A1 mRNA和蛋白表达;阳离子脂质体作为载体有增强效果,促进ASODN进入细胞并在核内分布.     

VEGF165基因对大鼠软组织缺损修复及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

目的 将pcDNA3.1-VEGF165质粒用于软组织缺损局部,观察其对软组织修复的作用和Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响.方法 SD大鼠32只于两侧臀部制备直径12 mm圆形全层皮肤、肌肉的复合软组织缺损;随机分为实验组,对侧为对照组.于实验组注射0.2 ml(含200 ng)质粒液,对照组以同量生理盐水代替.分别于术后3、5、7、14、30 d照相计算创面收缩率、取材.以RT-PCR法检测局部Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达;制备常规切片观察局部组织血管形成(MVD)及修复情况.结果 所有动物术后无死亡、感染.实验组及对照组创面愈合时间分别为14.2 d及17.4 d,于1、2周时新生血管密度分别为63.38±9.20、52.72±7.06(P＜0.05)及76.64±12.27、66.84±9.82(P＜0.05),差别有统计学意义.RT-PCR示Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA于术后3 d即开始有表达,2周达到高峰后减弱,实验组表达量较大.结论 pcDNA3.1-VEGF165质粒用于创面后,具有上调Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达,促进软组织缺损区血管生成、加速创面愈合作用.     

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中TGF-β_1及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达的改变及意义

目的检测增生性瘢痕(H)和瘢痕疙瘩(K)组织中 TGF-β_1及Ⅰ、Ⅲ型前胶原 mRNA的表达,了解其相互关系及意义。方法斑点杂交分析检测 H 和 K 组织中Ⅰ、Ⅲ前胶原及 TGF-β_1mRNA 稳态水平的改变;原位杂交检测 TGF-β_1 mRNA 在组织中的空间分布。结果①K 和 H 组织中 TGF-β_1 mRNA 稳态水平明显高于 N 组和 S 组;②K 选择性Ⅰ型前胶原 mRNA 表达增强,而 H 组织中Ⅰ、Ⅲ前胶原 mRNA 表达均增强。结论 TGF-β_1在 H 和 K 的发病机理中起了重要作用,K 和H 发生发展中具有不同的分子机理。     

肾衰泄浊汤对肾间质纤维化小鼠HGF调节的作用

目的:观察中药复方肾衰泄浊汤对肾间质纤维化小鼠肾组织肝细胞生长因子(HGF)蛋白表达的调节及其抗肾间质纤维化的机制。方法:将60只小鼠随机分为:假手术组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组、苯那普利组,采用单侧输尿管梗阻(UUO)动物模型,术后7d观察梗阻肾组织病理改变,用免疫组化检测肾组织HGF、TGF-β1、MMP-9蛋白,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN的表达。结果:中药高剂量组和苯那普利组较模型组小鼠肾组织HGF、MMP-9蛋白表达均增强,TGF-β1蛋白表达减弱,而Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、FN生成减少,两组无统计学差异,而HGF表达与TGF-β1表达呈明显负相关性。结论:肾衰泄浊汤可能是通过诱导HGF表达,抑制TGF-β1表达,促使肾组织分泌更多MMP-9,抑制Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN等ECM的过度沉积,加强肾保护作用,对抗肾间质纤维化。     

TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型，Ⅲ型胶原合成和表达的影响

目的：探讨转化生长因子-β1（tansforming gowth factor—beta 1,TGF—β1）对长波紫外线（ultraviolet A,UVA）照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和表达的影响。方法：通过MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性,选择UVA照射剂量为15J／cm^2,联免疫法（ELISA）测定不同剂量即TGF—β1小剂量组（UVA＋TGF—β1 0．1ng／ml）、中剂量组（UVA＋TGF—β1 1ng／ml）、大剂量组（UVA＋TGF—β1 10ng／ml）处理后成纤维细胞清夜中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,半定量RT—PCR检测成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果：UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞,导致成纤维细胞增殖活性下降,给予不同剂量TGF-β1干预后,成纤维细胞增殖活性与UVA照射组比较,明显提高;成纤维细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量增加,成纤维细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增强。结论：TGF-β1可提高UVA照射体外培养成纤维细胞增殖活性;增加UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,增强成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达,对皮肤成纤维细胞起保护作用。     

反义TGF-β1对周围神经生长影响的实验研究

目的 观察反义TGF-β1对大鼠坐骨神经损伤后神经纤维再生及神经功能恢复的影响. 方法 将50只成年SD大鼠随机分成3组:NS组(神经吻合术后局部注射生理盐水,20只)、反义TGF-β1组(神经吻合术后局部注射反义TGF-β1,20只)和正常对照组(不做任何处理,10只).术后6周、12周分别用免疫组化检测胶原Ⅰ、Ⅲ的表达量;显微镜下对新生神经纤维数量进行计数;应用足印分析和电生理检查技术,从功能角度判定反义TGF-β1的生物效应.结果 在6周、12周两个时相点,免疫组化结果证实,反义TGF-β1组胶原Ⅰ、Ⅲ表达低于NS组(分别为P＜0.05,P＜0.05);神经纤维计数证实,新生神经纤维数目明显优于NS组(P＜0.05);在坐骨神经功能指数测定、神经传导速度等神经功能恢复指标上,TGF-β1组优于对照组(P＜ 0.05). 结论 反义TGF-β1通过抑制胶原Ⅰ、Ⅲ的过量表达,预防神经损伤后创伤性神经瘤的形成,有利于损伤神经纤维轴索再生,使大鼠的神经功能得到了明显改善.