Model establishment of transgenic mouse mammary epithelial cells for research of gene expression

目的 建立转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,为研究乳腺内环境因素调控外源基因的表达和制备高效表达外源基因的乳腺生物反应器提供研究平台.方法 通过机械破碎和胶原酶消化的方法获取人转铁蛋白(hTF)转基因小鼠的乳腺上皮细胞,并进行体外原代培养.经胰蛋白酶纯化后,绘制乳腺上皮细胞生长曲线;免疫组织化学方法检测角蛋白18的表达;透射电子显微镜(透射电镜)观察乳腺上皮细胞超微结构;流式细胞仪检测细胞周期分布;显微镜下分析乳腺上皮细胞核型.将牛催乳素真核表达载体(pCMV-bPRL)转染至转基因乳腺上皮细胞中,检测外源bPRL的表达.结果 乳腺上皮细胞生长曲线呈“S”形;免疫荧光组织化学分析结果显示hTF转基因小鼠乳腺上皮细胞角蛋白18呈阳性表达;透射电镜观察发现乳腺上皮细胞胞核较大、偏位,有双核或多核,胞质丰富,空泡、粗面内质网、高尔基体丰富;流式细胞仪检测结果显示:乳腺上皮细胞增殖活跃,G2/M期+S期细胞占15％;细胞核型分析结果显示处于分裂期的细胞具有正常的二倍体,染色体完整.pCMV-bPRL转染乳腺上皮细胞24 h后,上清液中检测到bPRL的表达.结论 体外培养的转基因乳腺上皮细胞具有类似体内细胞的生物学特征,并可表达真核表达载体,为研究环境因素对乳腺功能的影响及制备乳腺生物反应器提供了一种细胞模型.     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

从兔乳汁分离原代乳腺上皮细胞用于乳腺特异性启动子活性检测

目的在含牛α-S1-酪蛋白调控序列的乳腺特异性定位表达载体pCA1基础上，构建乳腺细胞绿色荧光蛋白表达载体pCA1-GFPuv，转染分离培养的兔原代乳腺上皮细胞并检测启动子活性与组织特异性．方法用PCR法获取绿色荧光蛋白基因（即GFPuv基因），将其重组到乳腺特异性定位表达载体pCA1中，构建乳腺细胞特异绿色荧光蛋白表达载体pCA1-GFPuv，直接从兔乳汁中分离兔原代乳腺上皮细胞进行培养，通过脂质体法用pCA1-GFPuv转染乳腺上皮细胞，最后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况以检测乳腺特异性启动子活性与组织特异性．[第一段]     

乳腺定位表达载体在小鼠乳腺中的活性检测

目的 检测乳腺定位表达载体在动物乳腺中的表达活力。方法与结果 将乳腺定位表达载体乳清酸蛋白－人组织型纤溶酶原激活剂（ＷＡＰ－ｔＰＡ）通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中,待小鼠产子、泌乳后,检测出小鼠乳汁中ｔＰＡ的表达量为８０ｍｇ／ｍｌ。结论 此方法可作为从动物整体水平上检测乳腺定位表达载体表达效力的一种简便而有效的方法。     

哺乳动物乳腺上皮细胞的研究和应用

转基因动物-乳腺生物反应器的研制是近十多年发展起来的一项生物制药方法,具有巨大的应用前景.外源目的基因载体的构建是制备转基因动物-乳腺生物反应器成功的关键技术环节,因此建立简单、快捷检测外源基因载体构建的合理性和表达情况的方法至关重要.由于乳腺上皮细胞能较真实反映哺乳动物乳腺生长发育及泌乳的各项生理功能,开展体外培养哺乳动物乳腺上皮细胞,可作为转基因动物制备过程中载体有效性检验的一种体外模型途径.本文将对哺乳动物乳腺组织的结构和乳腺上皮细胞体外培养的增殖能力、诱导、维持分化的特点,以及乳腺上皮细胞的培养和它在生物、医学领域中的应用研究进行简要概述.     

嗜上皮细胞特异性启动子ED-L2转基因小鼠的建立

目的 :利用ED L2启动子构建载体 ,建立鼻咽癌转基因动物模型 .方法 :将ED L2 pEGFP质粒用XhoI酶切线性化 ,胶回收线性化片段 ,稀释浓度 4mg·L-1 ,采用显微注射法 ,将外源基因注射入小鼠受精卵细胞内 .结果 :产 1 2只小鼠 ,PCR检测基因整合 ,其中阳性 9只 ,阳性率 75 % ,SouthernBlot检测阳性 2只 ,阳性率 1 6 .6 7% .结论 :嗜上皮细胞特异性启动子ED L2可有效地将外源基因整合入小鼠基因组内     

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。     

Cramp转基因小鼠的构建及鉴定

目的建立系统性表达Cramp转基因模型小鼠,为研究Cramp在衰老中的作用提供模型动物。方法把Cramp cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立Cramp转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,用RT-PCR和Western blotting方法筛选高表达品系。结果成功构建Cramp cDNA转基因载体,建立了Cramp转基因小鼠,通过RT-PCR和Western blotting方法筛选出3个高表达品系。结论建立了系统表达Cramp转基因小鼠,转入的Cramp基因在骨髓、脾脏、肝脏等组织高表达,为研究Cramp基因在衰老中的作用及机制提供了动物模型。     

小鼠LIF基因分泌型真核表达载体的构建及其应用研究

目的构建小鼠白血病抑制因子的真核表达载体,有助于开展高其他实验动物的胚胎干细胞的定向分化研究。方法运用RT-PCR技术,克隆含信号肽和不含信号肽的小鼠分泌型白血病抑制因子,通过pMD18-Tsimple载体和pBS-T载体过渡,酶切进行初步鉴定。结果分别经过酶切鉴定,成功构建了小鼠LIF基因真核表达载体pSecTag-LIF(sp )和pSecTag-LIF(sp-)。结论构建小鼠白血病抑制因子的真核表达载体有效可行,不仅为进一步研究LIF细胞因子所诱导的维持胚胎干细胞未分化状态的分子机制奠定了基础,而且为各种转基因实验动物的研究提供了一种新的方法。     

Tet-on调控的基因表达载体的构建与体外表达研究

目的 依据Tet-on系统的原理,构建2个真核表达载体pTRE-Cre-EGFP（P1）和Pcmv-rtTA-EGFP-Cre-Phcmv（P2）并转染293T细胞,通过观察报告基因EGFP表达的绿色荧光,检验载体中基因元件能否正常发挥作用.方法 从pCre-IRES-EGFP载体上切下Cre-EGFP,与pTRE载体连接成P1载体,切下P1的部分片段Phcmv-Cre-EGFP 与pTet-On载体的部分片段Pcmv-rtTA连接成 P2载体,利用脂质体将pTet-on和P1共转染、将P2单转染入293T细胞,加入或者不加强力霉素（Doxcycline,Dox）诱导,观察绿色荧光.结果 成功构建载体P1及P2;P1和pTet-on质粒的共转染及P2的单转染在Dox诱导下均有绿色荧光的表达,无Dox诱导时绿色荧光表达水平极低.结论 构建的载体P1及P2中的基因元件在体外均能正常发挥作用,为进一步制备诱导性表达Cre的转基因小鼠奠定了基础.     

转基因小鼠胃癌模型的研究进展

在研究建立胃癌小鼠模型的初期,研究者利用幽门螺杆菌（Hp）感染、化学致癌等方式诱导近郊品系小鼠胃发生癌变.然而,该系小鼠胃癌模型产生的肿瘤多为鳞状细胞胃癌,不同于人常见的胃腺癌.近年来,基因工程技术的快速发展促进了转基因小鼠胃癌模型的出现.转基因小鼠胃癌模型是直接将调控胃癌发生的相关基因转染到小鼠胚胎中而形成肿瘤的一种新技术,其形成肿瘤的形态特征与人肿瘤的自然发生极为相似,且发生于特定组织,特异性较高.因此,转基因动物在胃癌形成、发展机制,尤其是信号通路研究中具有独特的优势,对研究基因突变而引起的遗传疾病发病机制十分有效,是一种极为理想的胃癌模型.     

线粒体靶向过表达ECSIT转基因小鼠的构建与鉴定

目的：构建线粒体靶向过表达ECSIT转基因小鼠,并对其进行鉴定和心功能分析,建立ECSIT基因相关功能研究模型动物。方法：构建过表达打靶载体pCAG?OTCL?ECSIT?3Xflag?BPA,采用电转导方法将线性化打靶载体转入胚胎干细胞（ES细胞）;将含有过表达载体的ES细胞进行囊胚腔注射,并将嵌合囊胚移植至代孕小鼠体内,繁殖嵌合体小鼠。嵌合体小鼠和 C57BL/6J 鼠交配繁殖出杂合子,PCR 筛选阳性过表达小鼠。采用小动物超声分析线粒体靶向过表达ECSIT小鼠的心功能。结果：成功构建了线粒体靶向过表达ECSIT载体pCAG?OTCL?ECSIT?3Xflag?BPA,经PCR鉴定为阳性;完成线粒体靶向过表达ECSIT基因打靶及囊胚注射,经PCR鉴定为阳性;分别提取转基因小鼠心肌组织线粒体和胞浆蛋白,检测发现线粒体特异性过表达ECSIT。8周龄转基因小鼠心功能与同龄野生型小鼠无明显差异。结论：成功构建出线粒体靶向过表达ECSIT小鼠;线粒体过表达ECSIT对8周龄小鼠心功能无明显影响。     

Dicer 1转基因小鼠模型的建立

目的 建立Dicer1转基因小鼠模型.方法 构建pcDNA3.I-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导人BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内.出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基冈表达.结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern榆测6只均为阳性.对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达.对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常.结论 成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础.     

抗菌肽转基因小鼠模型的建立

目的:制备抗菌肽转基因小鼠模型.方法:显微注射pcDNA3.1-PCMG到FVB小鼠受精卵雄原核中,注射存活胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠.结果:在生出的119只小鼠中经PCR和Southern blot检测到7只阳性.结论:通过显微注射法使外源基因pcDNA3.1-PCMG在FVB小鼠基因组中得到整合,为抗菌肽抗菌谱的研究,抗病毒、抗肿瘤机制的研究提供有价值的抗病动物模型.     

MMTV-Wnt-1转基因小鼠作为高发乳腺癌动物模型的观察

目的　观察MMTV Wnt 1转基因小鼠的乳腺癌发病情况及病理学变化规律。方法　观察MMTV Wnt 1转基因小鼠肿瘤发生情况 ,并采用原位移植将瘤组织置于裸鼠皮下 ,通过组织病理学切片来观察MMTV Wnt 1阳性转基因小鼠和移植鼠的病理学变化。结果　MMTV Wnt 1转基因小鼠最早从 7周龄开始出现乳腺瘤 ,发瘤鼠剖检可见脾、肝有不同程度的肿大 ,其他器官无明显病变 ;病理组织学检查发现发瘤鼠各脏器有不同程度的病变 ,但未出现肿瘤转移。将瘤组织移植裸鼠后 ,肿瘤可在裸鼠皮下生长 ,移植肿瘤病理学形态与原发瘤一致 ,未出现转移。结论　实验结果验证MMTV Wnt 1转基因小鼠可稳定自发乳腺肿瘤 ,可作为研究乳腺癌的良好的动物模型     

STK15转基因小鼠模型的建立

STK15基因是丝/苏氨酸激酶家族成员之一，其扩增和高表达能引起中心体复制扩增，染色体不稳定性增加，最终导致细胞的恶性转化，从而诱发恶性肿瘤。而且，STK15基因在多种恶性肿瘤组织中都具有高表达。目前，研究者们都是通过取人体不同部位的肿瘤组织来研究STK15基因与恶性肿瘤发生发展的关系，本次实验首次以建立STK15转基因小鼠模型，来进一步研究STK15基因与恶性肿瘤的关系，为今后的基因诊治提供理论基础。实验方法是首先提取人胚肺细胞总RNA作为模版，根据GenBank中STK15基因序列设计一对引物，用RT-PCR技术扩增出1200bp的STK15基因片段，克隆到pTZ57R/T载体，通过测序证实序列的正确性。用BamH1和XbaI双酶切载体pcDNA3.1和pTZ57R/T载体-STK15，然后回收、连接pcDNA3.1-STK15、转化、鉴定，从而成功构建了pcDNA3.1-STK15表达载体。然后对小鼠进行超排获得其原核期胚胎，应用显微注射法进行转基因操作，结果是注射成功率77%（701/907），移植鼠共30只，新生小鼠为106只，PCR检测转基因阳性为3只，经过Southern杂交检测有1只转基因阳性鼠，从而建立了转STK15的转基因小鼠模型。通过建立STK15肿瘤动物模型，找出与人类肿瘤相近的病理生理变化以及控制这些变化的遗传基础，为今后所有的恶性肿瘤的基因诊治提供坚实、有力的理论依据。     

Afp-cre-lacZ转基因小鼠的构建

目的 研究甲胎蛋白(Afp)阳性细胞的增殖分化在组织生长修复,肿瘤发生过程中的作用,建立Afp-CreERT转基因小鼠细胞示踪系统.方法 采用DNA雄原核显微注射方法获得Afp-CreERT转基因小鼠,筛选出合适的品系后,使之与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交,获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠.结果 显微注射后,共出生小鼠56只,经PCR鉴定Cre阳性小鼠共4只,阳性小鼠传代后各为一系.筛选内源性Afp表达与Cre表达相对符合的品系作为Afp-CreERT转基因小鼠品系建系.Afp-CreERT转基因小鼠与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交,经PCR鉴定后获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠.经实时PCR,X-gal染色,免疫荧光染色鉴定后得到Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统,同时证实该系统能够正确示踪Afp表达阳性的细胞,同时也能够应用于肝损伤小鼠模型中.结论 成功构建了Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统,为研究这类细胞的谱系发生提供了工具.     

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠，为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠。以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础，更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV-C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40polyA的转基因载体pTRE-HCV-C．以显微注射的方法将l_153kb的转基因片段注人BALB／C母鼠的受精卵．出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性．再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和胛A基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠。特定时问与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础．也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

胰腺癌转基因小鼠模型研究进展

胰腺癌是人类恶性肿瘤中最为致命的一种,癌基因KRAS的突变,抑癌基因(如CDKN2A、SMAD4)的失活或缺失以及大量信号途径的变化是胰腺癌的重要特征。因此,为弄清胰腺癌的这些生物学行为以及制订合理的治疗方案,建立模拟胰腺癌发生、发展过程的实验动物模型显得尤为重要。目前,基于KRAS突变的转基因小鼠模型较好地模拟了胰腺癌的癌前病变过程,结合其他抑癌基因的缺失或突变,进一步展示了胰腺癌的进展过程,如侵袭和转移等。该文就胰腺癌转基因小鼠模型予以综述。