光损伤鼠视网膜片培养上清液诱导MSCs分化为视网膜样细胞的研究

目的：应用大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液,在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成为视网膜样细胞的可能性。

方法：贴壁筛选法分离、培养大鼠MSCs,流式细胞仪对其细胞纯度鉴定。取材大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片,常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织完整性。电镜观察大鼠视网膜片光损伤程度。制备3种诱导分化大鼠MSCs的条件培养液。3种条件培养液均培养诱导至第3代大鼠MSCs 7～8d,用RT-PCR检测视紫红质(Rhodopsin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)等视网膜细胞标志物在诱导后细胞中的表达情况。

结果：HE染色显示大鼠视网膜片取材结构完整,电镜显示大鼠视网膜片光损伤后结构损伤严重。RT-PCR鉴定：条件培养液诱导大鼠MSCs 7～8d,条件培养液Ⅰ组Rhodopsin(0.3915±0.00644)、NSE(0.2019±0.00682)、GFAP(0.1972±0.00211),条件培养液Ⅱ组Rhodopsin(0.0983±0.00319)、NSE(0.1048±0.00323)、GFAP(0.1040±0.00254),条件培养液Ⅲ组Rhodopsin(0.0044±0.00126)、NSE(0.0498±0.00149)、GFAP(0.0467±0.00333),组间差异有统计学意义。

结论：光损伤大鼠视网膜片培养上清液可诱导大鼠MSCs分化为视网膜样细胞,为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。     

乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜神经节样细胞

目的 探讨乳鼠视网膜细胞对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化作用.方法 从出生8 d的大鼠骨髓中分离培养BMSCs,同时培养乳鼠视网膜神经细胞.在Transwell双层培养体系下,利用乳鼠视网膜细胞诱导BMSCs,诱导后细胞经RT-PCR及免疫荧光鉴定.结果 加入乳鼠视网膜细胞共培养第7 d有神经元样细胞形成,经nestin、NF、β-III Tubulin、Thy1.1行免疫组织化学、RT-PCR、免疫荧光鉴定,细胞呈阳性反应.结论 BMSCs在体外培养条件下,经过新生乳鼠视网膜细胞诱导,可以分化为视网膜神经节样细胞.     

光损伤视网膜细胞的机制研究

人类通过阳光和人工光源的照明实现“看得见”的基本功能.外界光穿过眼前部透明屈光介质后进入视网膜,通过视循环完成光电转化,将光信号转化为神经信号传递至大脑视觉中枢.随着平均寿命的延长和人工光源的增加,光辐射对视网膜的损伤受到越来越多的关注,但其机制仍未完全阐明.本文就视网膜光损伤机制的最新研究进展进行综述,讨论了光损伤视...     

光损伤导致视网膜感光细胞凋亡的实验研究

目的探讨视网膜光损伤后感光细胞病理学改变的特征及其发生机制。方法以白色强光持续照射的方法制成大鼠视网膜光损伤模型并采用常规HE染色与TUNEL技术对光损伤后视网膜感光细胞的病理学改变进行动态观察研究。结果白色强光照射后视网膜感光细胞发生进行性的变性,TUNEL标记结果显示光损伤后视网膜外核层出现大量阳性着色细胞。结论持续高强度白光照射可选择性地导致视网膜感光细胞发生进行性的变性而凋亡是感光细胞退行性变性的重要发生机制。     

视网膜光损伤研究的分子生物学进展

光诱导视网膜损伤的概念早在柏拉图时代就已被提出。此后 ,有作者描述了太阳光照后眼部改变的特点。直到 6 0年代中期 ,Noell等才开始实验室研究。近 30年 ,视网膜光损伤的临床和科研研究日益成为眼科医师关注的热点。其意义主要在于 :第一 ,随着眼科光学诊疗器械的日益增多 [1 ] ,过强的光源导致的视网膜损伤不断见诸报道。认识其发病机制和防治方法 ,对于减少医源性光损伤是大有好处的。第二 ,视网膜光损伤是研究视网膜变性类疾病的良好动物模型 [2 ] 。众所周知 ,老年性黄斑变性 (ARMD)是西方社会老年人致盲的重要眼疾 ,而视网膜光损伤…     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞的诱导分化

目的 探讨视网膜条件分化液诱导骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stemcells,BMSCs)向视网膜神经节样细胞定向分化的作用.方法 采用PCR技术、流式细胞术、免疫荧光法观察视网膜条件分化液对BMSCs分化的影响.结果 视网膜条件分化液诱导BMSCs 3 d后,Nestin阳性细胞比率为(30.9±7.7)%.诱导后第7天,免疫荧光结果显示Neurofilament的阳性细胞比率为(23±4)%,β-tubulin Ⅲ的阳性细胞比率为(18±3)%.RT-PCR结果也显示上述神经元或神经节细胞标志物的表达阳性.结论 视网膜条件分化液对BMSCs向视网膜神经节样细胞定向分化具有促进作用.     

实验性大鼠视网膜光损伤与视细胞凋亡的关系

目的 :研究视网膜光损伤与视细胞凋亡的相互关系 ,以探讨视网膜光损伤的发生、发展机制。方法 :所有SD大鼠在循环光环境中适应 7d ,在实验前先行暗适应 36h ,分别于光照 3、6、9、12、15和 18h时灌流固定 ,摘除眼球。光镜标本在常规脱水、透明、石蜡包埋切片后 ,行HE、TUNEL法染色 ,用光镜观察 ;电镜标本在树脂包埋、超薄切片、醋酸 柠收稿日期 :2 0 0 2 -0 7-15 ;修回日期 :2 0 0 2 -10 -2 0基金项目 :辽宁省教育厅资助项目 ( 99172 114 9)。作者简介 :刘学政 ( 1962 -) ,辽宁葫芦岛人 ,医学博士 ,解剖学教授 ,研究生导师。通信作者 :刘学政 (E -mail:xuezheng @hotmail.com)。檬酸铅双重染色后 ,用透射电镜观察 ;应用CIAS 10 0 0图像分析系统定量检测外核层面积和视细胞凋亡指数 ,所得数据做统计学分析。结果 :视网膜出现了光损伤和视细胞凋亡现象 ,随着光照时间的延长 ,视网膜光损伤逐渐加重 ,视细胞凋亡逐渐增多。在外核层 ,透射电镜观察见核染色质浓集 ,而无炎性反应。外核层面积和视细胞凋亡指数做相关性分析 ,显示有显著性意义。结论 :视细胞凋亡是视网膜光损伤的重要机制。光损伤启动了视细胞凋亡的发生 ,外核层细胞核的丢失是视细胞凋亡的结果。视网膜光损伤与视细胞凋亡有着密不可分的联系。     

胚胎干细胞诱导分化视网膜细胞的方法新进展

视网膜变性疾病是引起视力丧失的重要原因,由于这类眼病的病因不明确、发病机制复杂,目前尚无有效的治疗方法.近年来,干细胞研究领域取得了突破性进展,干细胞具有分化为机体所有细胞的潜能,可以利用胚胎干细胞(ESCs)分化出各种视网膜细胞,这为视网膜变性疾病的治疗带来了新的曙光.ESCs治疗视网膜变性疾病至关重要的一步是将ESCs分化为视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮(RPE)样细胞.本文对自发诱导培养法、共培养法、细胞因子诱导法、单层贴壁诱导培养法和3D诱导培养法等ESCs分化为视网膜光感受器细胞和RPE细胞方法的最新进展进行综述.     

视网膜光损伤分子机理的研究进展

视网膜是视觉形成的重要结构 ,同时也是容易受到光损伤的部位。眼球是精细的光能接受器 ,是由不同的屈光介质和光感受器组成的极灵敏的光学系统。由于眼的屈光介质有很强的聚焦作用 ,可将入射光束会聚成很小的光斑 ,从而使视网膜单位面积上接受的光能比入射到角膜的光强约 10 5倍。早在 17世纪瑞士医生 Bonetus就描述了日光引起的视力损害〔1〕。 196 6年 Noell等报道〔2〕,一定量的光 ,即使低于热损伤的阈值 ,也可引起受试小鼠的视网膜损伤。近年来 ,随着眼科光学诊疗器械应用的日益广泛 ,激光在治疗近视眼、角膜及视网膜疾病中的重要应用…     

视网膜光损伤的研究进展

视网膜光损伤及其损伤防御机制和药物性防治的研究一直是数十年来眼科领域一个基础结合临床的重要研究课题。本文回顾了视网膜光损伤的研究历史，从致伤光源的性能，光损伤的影响因素，分子病理机制的研究进展，及其防治措施等方面的研究进展进行综述，指出在视网膜光化学损伤过程中，存在着我种因素的调控与影响，其损伤机制是多层次多方面的，但随着分子生物学在光损伤机制研究中的普遍应用，光损伤确切的分子致病机制可在不久的将     

In vitro induction and differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into neuron-like cells by all-trans retinoic acid

AIM: To determine the optimal concentration for inducing the differentiation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) into neuron-like cells, although it is understood that all-trans retinoic acid (ATRA) regulates cell proliferation in the nervous system by modulating the balance between mitosis and apoptosis. METHODS: The abilities of ATRA to promote apoptosis as well as neural differentiation were assessed in cultured hUC-MSCs by morphological observation, MTT assay, annexin V-FITC/PI flow cytometry and immunocytochemistry. RESULTS: The data showed that low concentrations of ATRA (0.5 μmol, 0.25 μmol) had no effect on the number of cells. However, treatment with 1.0 μmol or 2.0 μmol ATRA induced a 24.16% and 52.67% reduction in cell number, respectively, compared with vehicle-treated cultures. Further, 4.0 μmol ATRA had a potent effect on cell number, with almost no adherent cells recovered after 24h. We further showed that 0.5 μmol ATRA caused these cells to express characteristic markers of neuronal progenitor cells. CONCLUSION: Taken together, we conclude that ATRA has a dose-dependent influence on the neural differentiation and apoptosis of hUC-MSCs. These findings have implications on the use of ATRA-differentiated hUC-MSCs for the study of neural degeneration diseases.     

人骨髓间充质干细胞向光感受器样细胞诱导分化的研究

目的:探索骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)定向分化成光感受器样细胞所需的微环境。方法:采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离纯化人BMSCs,培养第3代的细胞以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)及脑源性神经营养因子(BDNF)3种因子首先进行向神经前体细胞诱导分化,应用免疫细胞化学检测巢蛋白及微管相关蛋白-2,当巢蛋白阳性表达率达到最高时更换诱导因子,加入色素上皮衍生因子(PEDF)及牛磺酸(taurine)继续诱导2~3wk,用免疫细胞化学及RT-PCR法检测视紫红质的表达情况。结果:诱导第3d开始能检测到巢蛋白表达,第12d阳性表达率达到最高,达(90.9±2.6)%。微管相关蛋白-2在诱导后第6d检测到阳性表达。部分细胞形态呈神经元细胞样。第12d诱导因子更换为PEDF及taurine继续诱导2~3wk,检测到有视紫红质表达,第2wk阳性率为(20.7±3.8)%,第3wk阳性率为(89.8±3.7)%。结论:采用分阶段诱导法,应用因子bFGF,EGF,BDNF及PEDF,taurine能在体外诱导BMSCs表达光感受器细胞标志物视紫红质。     

[In Press] Human olfactory mucosa mesenchymal stem cells can differentiate into retinal cells in vitro

AIM: To investigate whether the human olfactory mucosa mesenchymal stem cells (OM-MSCs) can differentiate into retinal cells in vitro. METHODS: Through the olfactory mucosa adherent method, olfactory mucosa was isolated, cultured and identified in vitro among mesenchymal stem cells. The cell surface markers were analyzed by flow cytometry, induced to differentiate into retinal photoreceptor cells in vitro, and the expression of rhodopsin was observed and identified by Immunofluorescence and Western-blot methods. RESULTS: OM-MSCs from human were spindle cell-based, and showing radial colony arrangement. OM-MSCs were negative for CD34, CD45 and CD105, but positive for CD73 and CD90. Following induction, a strong positive reaction was produced by photoreceptor specific marker rhodopsinin the cells. CONSLUSION: This novel finding demonstrates thatOM-MSCs can be cultured and expanded in vitro. They possess biological characteristics of mesenchymal stem cells, and have the ability to be induced into retinal cells.     

Differentiation of human olfactory mucosa mesenchymal stem cells into photoreceptor cells in vitro

AIM: To investigate whether the human olfactory mucosa mesenchymal stem cells (OM-MSCs) can differentiate into photoreceptor cells in vitro. METHODS: Through the olfactory mucosa adherent method, olfactory mucosa was isolated, cultured and identified in vitro among mesenchymal stem cells. The cell surface markers were analyzed by flow cytometry, induced to differentiate into retinal photoreceptor cells in vitro, and the expression of rhodopsin was observed and identified by Immunofluorescence and Western blot methods. RESULTS: OM-MSCs from human were spindle cell-based, and showing radial colony arrangement. OM-MSCs were negative for CD34, CD45 and CD105, but positive for CD73 and CD90. Following induction, a strong positive reaction was produced by photoreceptor specific marker rhodopsin in the cells.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为光感受器样细胞的研究

目的 探讨体外培养的大鼠骨髓问允质干细胞(MSC)诱导为光感受器样细胞的可能性.方法 实验研究.采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSC细胞,经流式细胞仪鉴定后,用含小鼠表皮生长因子(EGF)的培养液诱导MSC细胞8～10 d.用免疫组织化学染色观察诱导后的细胞是否表达视紫红质,并用流式细胞术检测表达视紫红质的细胞比例.结果 传3代的MSC细胞生长曲线呈S型,显示培养细胞具有正常的分裂增殖特性;超过70%的传1代和传2代细胞为CD90单阳性,从传3代绌胞开始CD90单阳性的百分数一直高于93%,即采用贴壁筛选法可获得大量高纯度的大鼠骨髓MSC细胞.经EGF诱导后的细胞有15.32%±0.92%表达视紫红质,而未经诱导的细胞表达视紫红质的比例为1.64%±0.78%.结论 经EGF诱导后,15.32%的大鼠MSC可分化为光感受器样细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞

目的:探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell,MSC) 分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性.方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC,经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化,免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达.结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能,原代培养的骨髓MSC CD29免疫荧光染色阳性,CD34和CD45为阴性,符合骨髓MSC的特征.MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞,少部分细胞形态上相对偏小,免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12.结论:体外培养的MSC在角膜基质细胞的诱导下可横向分化为角膜上皮细胞.     

视黄酸联合视网膜细胞共培养对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨胚胎干细胞(ESC)在视黄酸联合视网膜细胞共培养诱导条件下的分化特征。方法 将ESC自液氮中复苏、培养，传1代后进行拟胚体培养。将部分3．5d拟胚体离心重悬后加入含有视黄酸的24孔板中进行诱导，另一部分加入已经培养有视网膜混合细胞的培养瓶中，培养液中同时也加入视黄酸。视网膜混合细胞中仅加入视黄酸未加拟胚体作为对照。倒置相差显微镜下观察细胞在整个诱导过程中形态学的改变并使用免疫细胞化学检测诱导细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、广谱细胞角蛋白、微管相关蛋白-2、视紫质蛋白表达情况。结果 (1)形态学改变仅由视黄酸诱导，诱导细胞呈多种形态；在共培养条件下，绝大多数拟胚体分化出来的细胞形态非常单一，呈透明圆形。部分原贴壁的视网膜细胞出现了明显的网状结构。(2)免疫细胞化学显示两种诱导条件均可见大部分诱导细胞MAP-2阳性，并可见Nestin阳性细胞。共培养诱导尚可见GFAP阳性、Cytokeratin阳性和Rhodopsin阳性的细胞。结论 视黄酸可以诱导大部分细胞成为神经细胞，在视黄酸和与视网膜细胞共培养诱导条件下，可以获得更为纯化的形态一致的神经样细胞，部分诱导细胞表达视网膜细胞的特性。     

视网膜细胞联合bFGF体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外分化为神经样细胞的有效途径,从而解决体外诱导分化效率低及存活状况不佳等问题.方法 采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离BMSC,免疫组化检测CD31、CD44、CD45、CD105表达并对细胞进行鉴定.按照诱导方式的不同分为3组：视网膜细胞＋碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）组、bFGF组、不加诱导液组,分别诱导大鼠BMSC向神经样细胞分化.于诱导后第3、第7、第14天分别进行细胞形态学观察;并采用免疫细胞化学法检测神经微管蛋白-βⅢ（Tui1）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,分析阳性细胞率：采用MTT法检测诱导后BMSC增殖状况,比较细胞存活率.相同时间组间比较用两独立样本t检验,组内不同时间比较用单因素方差分析.结果 形态学观察：视网膜细胞＋hFGF组诱导BMSC 12 h后出现形态变化,逐步形成典型的神经样细胞：bFGF阳性对照组也可见形成突起结构,但无典型的神经样细胞形态.免疫组化检测：处理组诱导3 d后即可检测到阳性细胞,随着诱导时间的延长.Tui1、NSE和GFAP阳性细胞率增加,与阳性对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;阴性对照组未发现阳性细胞.存活率：各组BMSC存活率随着时间延长逐渐下降,但不同诱导方法对BMSC存活无显著影响.结论 模拟视网膜微环境配合bFCF能够诱导大鼠BMSC分化为神经样细胞并继续存活.     

人骨髓间充质干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的 应用猪板层角膜做载体将人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)跨胚层诱导为上皮样细胞,甚至角膜上皮样细胞,初步探讨hMSC作为构建组织工程角膜种子细胞的可行性.方法 实验研究.用密度梯度离心培养技术结合贴壁培养法分离纯化hMSC并传代,对体外培养的hMSC进行免疫表型鉴定.将传代后的hMSC接种于去上皮的猪角膜基质片前弹力层表面培养诱导分化,免疫荧光检测角膜上皮细胞标志物角蛋白12(CK12)以及角膜缘干细胞标记物ABCG2和CK19的表达.运用体外培养的方法使种植在前弹力层表面的细胞复层化.待细胞融合形成单层后,置入插入式培养皿中进行气液界面培养.培养4周后进行HE染色及免疫组织化学检测,光镜下观察其复层情况.结果 获得的hMSC可以在体外培养扩增,表现出很强的增殖潜能.流式细胞仪示:培养的hMSC CD45阳性率为0.06%,CD34为0.41%,CD44为86.43%,CD29为85.72%,CD105为90.72%.诱导4周后部分细胞表达CK12和CK19,不表达ABCG2.运用气液界面培养法进行体外复层的结果显示可以形成1～2层的上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞.结论 在本实验的诱导条件下,hMSC可以分化为上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞,hMSC有可能作为组织工程技术角膜上皮重建的种子细胞的选择.