CRISPR/Cas9在免疫细胞基因编辑中的应用

CRISPR/Cas系统是最近几年才被发现的,它是基于RNA来控制细菌与古细菌中病毒与质粒的入侵.在有CRISPR/Cas免疫系统的原核生物基因中发现了短的重复序列和来自于CRISPR基因座的小RNA,它能引导Cas9蛋白去识别与降解入侵的核苷酸序列.目前,CRISPR/Cas9系统已迅速革新基因工程这片领域,让研究者可以相对轻松地改变多种生物的基因组,而且在免疫系统中能通过编辑免疫细胞达到缓解疾病的程度.     

CRISPR/Cas9在人类疾病治疗中的研究进展

成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9,Cas9）是利用向导RNA（guide RNA,gRNA）引导Cas9蛋白对靶...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HuT-78细胞PD-1分子对其增殖能力的影响

利用CRISPR/Cas9技术成功敲除人T细胞系HuT-78细胞中编码PD-1分子的基因PDCD1,并比较敲除了PDCD1基因的及对照组的HuT-78细胞增殖能力的差异。实验结果显示敲除PDCD1基因的HuT-78细胞的增殖能力不受PD-L1的影响,为将此技术应用于肿瘤免疫治疗提供了实验依据。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在蚊媒研究中的应用

蚊虫不仅吸血骚扰,而且传播多种疾病,迄今依然是世界性的严重的公共卫生问题。近年来,新型虫媒病不断出现,传统的虫媒病死灰复燃,给蚊媒控制带来了新的挑战。随着基因编辑技术的出现与发展,特别是成簇的规律间隔短回文重复序列系统(Clustered regularly interspaced palindromic repeats-CRISPR associated sequences 9, CRISPR/Cas9)的出现,为开展蚊虫生理、生化、发育、宿主与病原体关系等诸多方面分子生物基础研究提供了靶标特异性的修饰工具,给蚊媒控制技术的发展带来了新的契机。本文主要针对CRISPR/Cas9技术在蚊媒研究领域的应用现状及进展进行综述,并探讨CRISPR/Cas9技术在蚊媒传染病防治的实际应用中所面临的问题,为蚊媒防治措施的应用及改进提供理论参考。     

CRISP R/Cas9介导下敲除KNDC1的人脐静脉内皮细胞具有抗衰老能力

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的KNDC1并观察其抗衰老能力。方法通过在线软件设计靶向于KNDC1外显子1、2、3的5个sgRNAs,并将其构建到CRISPR/Cas9载体中;经测序确认序列正确后,将重组质粒转染HeLa细胞和HUVECs,48 h后用real-time PCR和Western blot分别检测KNDC1 mRNA和蛋白表达水平;用SA-β-gal染色检测细胞衰老情况;用2, 7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧水平。结果测序结果显示,设计的5个sgRNAs全部插入到了CRISPR/Cas9载体中,序列正确,构建成功。将5个重组质粒转染到HeLa细胞后发现第4和5号载体敲除效率较高,接下来将4和5号重组质粒转染到HUVECs中,发现与转染对照质粒相比,转染了4和5号重组质粒的HUVECs KNDC1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P0.05),衰老HUVECs数量和细胞内活性氧水平明显减少。结论利用CRISPR/Cas9技术能有效敲除HUVECs的KNDC1,敲除KNDC1的HUVECs具有抗衰老能力。     

CRISPR/Cas9技术研究进展

CRISPR/Cas9系统可以很容易的改写多种生物体的基因组,这一技术很快席卷了整个基因组工程领域.在此基础上的实验方法在各个领域都具有相当大的潜力.因而了解以CRISPR/Cas9为基础的基因功能研究,探讨这一技术开发新一代疾病模型的各种途径,疾病治疗以及基因调控等方面的研究进展很有必要.     

基于CRISPR/Cas9系统高效编辑小鼠miR let-7a

目的 构建靶向小鼠miR let-7a的高效CRISPR/Cas9系统。方法 根据小鼠miR let-7a的两个编码位点let-7a-1和let-7a-2的编码序列各设计了两对dual-sgRNAs导向序列,通过sgRNA表达载体的构建、小鼠N2a细胞的共转染、药物筛选、阳性细胞PCR产物测序以及TA克隆测序分析等实验步骤完成了4对dual-sgRNAs导向序列的打靶效力分析。结果 所构建的4对打靶载体在细胞中发挥了作用,打靶位点均出现了碱基插入或缺失,药物筛选阳性细胞打靶位点RCR产物Sanger法测序峰图在4个靶点位置均有套峰出现。TA克隆测序结果表明本研究设计的4对dual-sgRNAs导向序列的打靶效率分别为42.10%、62.50%、52.63%和47.37%。结论 本研究所设计的4对dual-sgRNAs导向序列均可以有效介导Cas9蛋白切割小鼠miR let-7a,形成突变效应。为后续miR let-7a作用靶点的深入挖掘,阐明其发挥抑癌功能的作用机制提供了依据。     

基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析。方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1。应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株。采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P 0. 01)。基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9。CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P 0. 05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P 0. 05); Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P 0. 05)。结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株。NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关; SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在心血管领域中的研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术以其独特的优势已经在生物医学领域中被广泛应用。利用该技术在人类心血管疾病的相关研究如:心肌细胞水平、先天性心脏病动物模型建立、冠心病高危因素、心律失常、心力衰竭和心肌病等方面已经取得了很大进步,但目前的基因编辑技术在实际运用中仍然面临着许多问题。     

利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾(human embryonic kidney cell,HEK-293)细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建4T1细胞CXCR4基因敲除稳定细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株。 方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心（NCBI）上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒。 收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞。 提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况。 结果 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达。 结论 通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株。     

基于CRISPR/Cas9系统的HEK293T细胞DMD基因第51号外显子的靶向敲除

目的应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除。方法设计靶向人DMD基因exon51 5'端及3'端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使用Surveyor法检测切割活性;使用目标外显子两端切割活性最高的sgRNA构建PX459-2sgRNA质粒,转染至HEK293T细胞后用PCR及T载体测序检测靶向外显子切除情况。结果50%的HEK293T细胞中DMD基因exon51被定向切除,编辑效率较高。结论建立使用CRISPR/Cas9单质粒敲除人DMD基因exon51的平台,为DMD及其他遗传病的基因治疗研究奠定实验基础。     

利用CRISPR/Cas9技术制备成对框基因2敲除小鼠

目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/重组CRISPR相关核酸酶9（Cas9）技术双切口法制备成对框基因2（Pax2）敲除小鼠,为探讨Pax2基因在多个系统发育的作用提供动物模型。方法 根据Pax2基因序列设计sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射到C57BL/6J 小鼠的受精卵中,F0代小鼠出生后取其基因DNA测序鉴定基因型。共获得8只F0 代小鼠,使敲除成功的F0代小鼠与野生C57BL/6J 小鼠交配,获得F1代小鼠,后均采用基因成功敲除的小鼠与C57BL/6J 小鼠进行交配,可获得稳定的Pax2基因敲除小鼠。结果 成功获得可稳定繁殖的Pax2杂合子基因敲除小鼠,其Pax2基因缺失1628 bp;组织HE染色显示,敲除小鼠的肾小球数量明显减少;Western blotting结果显示,敲除小鼠的肾皮质Pax2蛋白表达较野生型小鼠减少。结论 利用CRISPR/Cas9技术可成功构建Pax2杂合子基因敲除小鼠,为进一步研究Pax2基因的作用奠定基础。     

CRISPR / Cas9 基因编辑技术在肿瘤免疫治疗中的应用

近年来肿瘤免疫治疗因其显著疗效和创新性备受关注,是肿瘤治疗中最具有前景的研究方向之一。CRISPR基因编辑系统的发展以及其在多领域的延伸应用让研究者看到了它的巨大潜力,在肿瘤免疫治疗研究中也显示出广泛的应用前景。在过继性细胞治疗中,CRISPR/ Cas9 可对TCR-T 和CAR-T 细胞的内源性TCR 以及HLA-Ⅰ分子的基因进行敲除得到通用型效应细胞;在基于免疫检查点阻断的治疗中,其为免疫检查点的抑制和阻断提供了一种新的方法;同时在抗体靶向疗法中,CRISPR/ Cas9 技术在候选靶点筛选及简化抗体制备流程中有着重要应用。CRISPR 从各方面极大地推动了肿瘤免疫治疗的研究,本文将对CRISPR/ Cas9 基因编辑系统在肿瘤免疫治疗方面的应用进行介绍。     

应用CRISPR/Cas9系统构建敲除APE1基因的AC16心肌细胞株

目的应用CRISPR/Cas9系统构建敲除APE1基因的AC16心肌细胞株,为研究APE1在心肌细胞的功能提供研究基础。方法根据RISPR/Cas9靶向原理设计人APE1基因的导向RNA(sgRNA),构建sgRNA-LentiCRISPRV2重组质粒并转入293T细胞制备sgRNA-Cas9慢病毒;该病毒浸染AC16心肌细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆。免疫印迹法测定单克隆细胞中APE1蛋白表达。结果免疫印迹法检测的结果显示,筛选出的单克隆细胞的APE1蛋白表达完全缺失;PCR产物测序结果表明,靶向敲除APE1的心肌细胞,不存在sgRNA介导CRISPR-Cas9随机的核苷酸插入。结论应用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除APE1基因的AC16心肌细胞株。     

利用CRISPR/Cas9技术构建22q-Enh3增强子元件敲除型A549稳定细胞系

目的 增强子元件敲除细胞系是探索增强子功能的理想细胞模型,为了探索位于22q12.2肺癌易感染色质区的增强子元件22q-Enh3的生物学功能,建立敲除22q-Enh3增强子元件的纯合细胞系.方法 利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated 9)基因敲除技术在非小细胞肺癌A549细胞系中敲除22q-Enh3增强子,并运用流式细胞术、细胞培养以及PCR技术筛选和鉴定敲除型克隆.结果 我们最终获得了3个敲除增强子元件22q-Enh3的纯合子细胞克隆.结论 本研究为进一步研究22q-Enh3增强子元件的生物学功能提供了细胞模型,并为应用CRISPR/Cas9基因敲除技术建立其他增强子元件敲除型纯合子细胞模型积累了宝贵经验.     

CRISPR/Cas9技术联合脂质体转染子宫内膜癌细胞单质粒基因敲除方法首次编辑免疫相关基因HLA-DRA

背景：HLA-DR基因异常表达与多种肿瘤的进展及预后相关,采用CRISPR/Cas9技术编辑子宫内膜癌HLA-DRA基因的研究目前国内外尚未见报道。目的：利用CRISPR/Cas9技术对HEC-1-A细胞的HLA-DRA基因靶向敲除,检测其敲除效率,并初步探索HLA-DRA基因的功能。方法：根据HLA-DRA基因序列,针对HLA-DRA外显子设计单链向导RNA（sg RNA）,分别将sg RNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性克隆至YKO载体中,通过脂质体将sg RNA表达质粒转染到HEC-1-A细胞中。根据荧光表达,观察评估sg RNA敲除效果后,使用表达sg RNA的质粒进行转染,用最佳浓度的嘌呤霉素筛选,获得稳定的绿色荧光蛋白阳性表达细胞后,进行PCR、基因测序、转录组测序。结果与结论：经转染和嘌呤霉素筛选后,获得稳定表达绿色荧光蛋白的HEC-1-A细胞,对其进行Sanger测序分析,结果显示HEC-1-A细胞中HLA-DRA第一号外显子基因被定向敲除,对转录组测序结果进行差异基因筛选,根据筛选所得686个差异表达基因进行GO富集分析和KEGG富集分析,构...     

CRISPR/Cas9技术在宫颈癌治疗中的应用进展

宫颈癌是世界上女性癌症排名第4位的恶性肿瘤, 严重威胁女性的健康。宫颈癌患者的主要治疗方案为手术或同步放化疗, 随着医学研究的发展, 研究者们致力于探究更为有效、特异的治疗方案, 以期增加宫颈癌的治疗策略和提高治疗效果。簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术是Cas9蛋白利用向导RNA(gRNA)的引导进而靶向目标基因, 实现对目标基因精准编辑的方法。目前, CRISPR/Cas9技术已成为一种很有前途的强大基因编辑工具, 是一种新的有效的靶向治疗方法, 且被应用于多种肿瘤的治疗中。主要从作用靶点、联合治疗策略以及相关耐药基因筛选等方面对CRISPR/Cas9技术在宫颈癌治疗中的研究进展进行综述, 以期为宫颈癌的治疗提供新的策略。     

CRISPR/Cas9载体优化及CHD1L条件性敲除肝癌细胞系的构建

目的利用优化的pLV-Tet3G-CRISPR/Cas9载体系统构建条件性敲除CHD1L的QGY-7703肝癌细胞系,验证敲除效果及其对细胞生物学的影响,为研究CHD1L促肿瘤细胞恶性表型机制提供重要的细胞模型。方法用点突变方法优化pLV-Tet3G-Cas9载体以降低其脱靶效应,进而将Cas9改造成eSpCas9;其次,通过筛选获得稳定表达eSpCas9的QGY-7703细胞株;将mCherry基因插入载体pLVXhU6-SgRNA中,获得携带mCherry荧光基因的pLVX-mCherry-hU6-SgRNA载体;设计和筛选特异性靶向CHD1L的SgRNA序列,用重叠PCR方法获得hU6-CHD1L-SgRNA片段,筛选具有CHD1L切割活性的靶点,随后,将其克隆到pLVX-mCherry-hU6-SgRNA载体中;用293FT细胞进行病毒包装,获得慢病毒颗粒;转染7703eSpCas9细胞株,利用Western blot验证Dox诱导下的CHD1L敲除效果,划痕和Transwell实验检测Dox诱导的CHD1L敲除对肝癌细胞生物学功能的影响。结果 pLV-Tet3G-Cas9载体Cas9成功优化为eSpCas9序列;成功构建pLVX-mCherry-hU6-CHD1L-SgRNA载体;通过转染及筛选,获得Dox诱导的CHD1L敲除QGY-7703肝癌细胞系;细胞实验显示Dox可诱导eSpCas9表达,靶向性切割CHD1L,抑制QGY-7703细胞的迁移侵袭。结论成功构建Dox诱导的CHD1L敲除肝癌细胞株,此载体系统可为靶向肿瘤特异性基因研究提供细胞模型。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑靶向下调FGFR2缓解Apert综合征小鼠颅缝早闭

Apert综合征 (Apert Syndrome, AS) 是一类常染色体显性遗传疾病,主要表现为颅缝早闭、中面部发育不良、 并指 (趾)、智力发育障碍等,多由FGFR2分子功能增强型点突变引起。目前,此疾病主要靠手术矫形来恢复功能,其中大脑等病变部位手术难度大,难以实施,且通常需要多次手术。CRISPR/Cas9基因编辑技术在人类遗传病治疗中具有巨大潜力。本研究筛选到靶向FGFR2基因的gRNA,与Cas9经慢病毒包装后作用于Apert小鼠 (FGFR2^+/P253R) 的原代颅骨细胞、体外培养的颅骨以及活体小鼠颅骨中,可敲低FGFR2的表达,改善Apert原代颅骨细胞的分化程度。CRISPR/Cas9处理体外培养的颅骨及注射至 Apert 小鼠头颅,颅骨冠状缝早闭状态有效缓解,异常降低的颅骨骨量、骨密度等也显著改善,表明 CRISPR/Cas9基因编辑可缓解 Apert小鼠头颅异常。本研究为 Apert综合征的基因治疗提供了实验依据,有望为其它骨骼遗传病治疗提供新的策略与借鉴。