高糖作用的肾小球系膜细胞SnoN/Ski蛋白表达及泛素化降解

目的: 观察高糖作用的大鼠肾小球系膜细胞内核转录共抑制因子SnoN/Ski及泛素连接酶Arkadia的表达变化,初步探讨SnoN/Ski泛素化降解在糖尿病肾病中的作用。方法: 将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分别设正常对照组 、高糖甲组(培养基含20 mmol/L葡萄糖)、高糖乙组(培养基含30 mmol/L葡萄糖)、高糖+MG132组(30 mmol/L葡萄糖培养基中预先加入0.5 μmol/L特异性泛素蛋白酶体抑制剂MG132)和甘露醇组。用蛋白免疫印迹技术和免疫荧光染色-激光共聚焦显微镜检测各组细胞SnoN/Ski及Arkadia蛋白的表达。结果: (1)正常系膜细胞中SnoN/Ski蛋白大量表达,Arkadia蛋白表达较弱。(2)高糖作用后SnoN/Ski蛋白表达减弱,Arkadia蛋白表达增强(P<0.05)。(3)与高糖组比较,高糖加入MG132后SnoN/Ski蛋白表达增加,Arkadia蛋白表达减弱(P<0.01)。(4)甘露醇组与正常组比较SnoN/Ski及Arkadia蛋白表达均无明显差异(P>0.05)。结论: (1)高糖可通过泛素蛋白酶体途径降解SnoN/Ski蛋白致其低表达。(2)E3连接酶Arkadia参与了高糖诱导的SnoN/Ski的泛素化降解 。     

钠、钾干预对成人血清和尿中肾胺酶表达的影响

目的:动物实验表明高盐摄入可降低循环及肾脏中肾胺酶的表达水平。本研究拟探讨钠、钾摄入对成人血清和尿中肾胺酶表达的影响。方法:42名(28~65岁)来自中国北方农村的受试者参与了这项研究。所有受试者依次接受低盐饮食7 d(氯化钠3 g/d),高盐饮食7 d(氯化钠18 g/d),高盐补钾饮食7 d(氯化钠18 g+氯化钾4.5 g/d)。血清及尿中肾胺酶水平用ELISA试剂盒进行检测。结果:低盐饮食期,血清中肾胺酶水平较基线期显著升高。低盐转向高盐饮食期时,血清肾胺酶水平随之下降,但同时给予补钾后,可阻止高盐所致的肾胺酶水平下降。尿中肾胺酶水平在高盐饮食期显著高于低盐期。高盐补钾期,尿中肾胺酶水平与单纯高盐期相比无显著差异,但显著高于低盐饮食期。24 h尿钠排泄与血清中肾胺酶水平呈负相关,与尿中肾胺酶水平呈正相关。结论:饮食中钠、钾含量的变化可显著影响中国人血清及尿中肾胺酶的表达水平。     

泛素特异性肽酶22调控乙型肝炎病毒X蛋白水平及功能

目的探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22, USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx与USP22的相互作用。瞬时转染USP22真核表达质粒或干扰USP22表达的siRNA, Western blot检测肝细胞中HBx蛋白表达水平的变化。以环己酰亚胺(cycloheximide, CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132(carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal, MG132)分别处理转染后的细胞, 检测HBx蛋白的降解速率。进一步通过细胞内泛素化试验检测USP22对HBx泛素化的影响, 明确USP22影响HBx蛋白稳定性的具体机制。最后, 以双荧光素酶报告试验和平板克隆试验检测USP22对HBx生物学功能的影响。结果 USP22与HBx存在相互作用。USP22显著增加HBx蛋白稳定性, 并通过去除HBx的泛素化抑制HBx通过蛋白酶体降解, 进而增强...     

泛素蛋白酶体途径对高糖刺激的肾系膜细胞Smad7表达的影响

目的:观察不同浓度高糖刺激后大鼠肾系膜细胞胞内Smad泛素化调节因子－Smurf2和Smad7 的表达,并以蛋白酶体特异性抑制剂MG132作为阻断剂,探讨泛素化降解在Smad信号中的作用。方法：将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分别设正常对照组（葡萄糖浓度5.6 mmol/L）、20 mmol/L高糖组、30 mmol/L高糖组、30 mmol/L高糖加蛋白酶体抑制剂MG132组等。用细胞免疫荧光染色法及激光共聚焦显微镜检测各组细胞泛素连接酶Smurf2及Smad7的表达。结果：(1)正常组细胞Smurf2蛋白表达较弱（25.93±3.35）,Smad7蛋白表达较强（64.09±7.43）。(2)高糖组Smurf2表达较正常组增强(P<0.05),呈浓度依赖性,荧光灰度值分别为20 mmol/L高糖组（56.99±7.00）、30 mmol/L高糖组（96.36±9.19）;Smad7表达减弱(P<0.05),呈浓度依赖性,分别为20 mmol/L高糖组（45.33±6.67）、30 mmol/L高糖组（30.20±4.41）。（3）30 mmol/L高糖组加入MG132后,Smurf2表达减弱、Smad7表达增强。结论：（1）高糖可诱导肾系膜细胞Smurf2表达增强,Smad7表达减弱。(2)MG132可阻止高糖所导致的上述变化。提示泛素－蛋白酶体途径参与了糖尿病肾病Smad通路的信号调节。     

高氧导致20S蛋白酶体活性降低诱导早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡

目的建立早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)原代培养高氧细胞损伤模型,研究高氧对泛素化蛋白的降解及AECⅡ凋亡的影响。方法早产大鼠原代AECⅡ体外培养,利用950 m L/L O2建立高氧细胞损伤模型并随机分为空气组和高氧组。空气或高氧暴露24、48、72 h后,采用异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR检测泛素mRNA表达,Western blot法检测细胞内总泛素化蛋白及凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达,利用特异性荧光底物检测20S蛋白酶体活性。结果与同时间点空气组相比,各时间点高氧组AECⅡ凋亡增加,AECⅡ中20S蛋白酶体活性降低,泛素mRNA和总泛素化蛋白表达增加,同时Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达明显上调。结论高氧暴露引起AECⅡ中20S蛋白酶体活性降低,泛素化蛋白降解减少,通过上调Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达诱导AECⅡ凋亡。     

泛素-蛋白酶体途径降解胰腺癌细胞系中凝溶胶蛋白

目的 探讨胰腺癌中泛素-蛋白酶体途径对凝溶胶蛋白(gelsolin)的降解作用.方法 用特异性蛋白酶体抑制剂lactacystin处理胰腺癌细胞系BxPC-3和PANC-1,经Westem blot检测凝溶胶蛋白的表达,免疫沉淀细胞内凝溶胶蛋白,分析沉淀蛋白的泛素化.结果 BxPC-3细胞系经lactacystin作用12 h后,细胞内凝溶胶蛋白含量较对照组和处理前明显升高(P＜0.05),而且细胞内的凝溶胶蛋白表现出与泛素分子的相互作用.结论 泛素-蛋白酶体途径对凝溶胶蛋白的降解作用,可能是胰腺癌中凝溶胶蛋白表达降低的原因之一.     

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中Mdig表达及调控

目的探讨矿物粉尘诱导基因(mineral dust induced gene,Mdig)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺组织中的表达及其调控机制。方法 12只Wistar雄性大鼠随机分为2组,正常对照组和COPD模型组,利用单纯吸入香烟烟雾的方法,每日2h,连续烟熏16周制造COPD模型大鼠;HE染色观察大鼠肺组织形态学改变;利用Western blot和Real time PCR技术检测COPD模型大鼠肺组织Mdig蛋白和基因的表达情况;利用免疫沉淀技术分析COPD模型大鼠肺组织Mdig蛋白是否存在泛素化修饰及泛素化修饰水平。结果单纯吸入香烟烟雾法连续烟熏16周后,大鼠肺组织出现典型的COPD病理改变;与对照组相比COPD模型大鼠肺组织中Mdig蛋白及基因表达水平均显著升高。免疫沉淀结果显示Mdig蛋白存在泛素化修饰作用,且COPD模型大鼠肺组织中Mdig蛋白泛素化修饰水平高于对照组,通过基因转录调控和翻译后泛素化修饰作用调控COPD病理状态下Mdig表达,导致Mdig蛋白表达增多。结论 Mdig可能是COPD引起肺癌发生的重要机制之一。     

MG132对高糖条件下肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达及纤维化效应的影响

目的:观察蛋白酶体抑制剂MG132对高糖培养条件下肾小管上皮细胞核转录共抑制因子Sno N蛋白表达的影响,探讨MG132减轻高糖状态下肾小管纤维化病变的作用及可能机制。方法:将体外培养的NRK-52E细胞分为正常组(NG)、高糖组(HG)和不同浓度MG132预处理后高糖培养组(HG+MG132),采用免疫荧光双染的方法观察E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肾小管上皮细胞中的表达和分布,用Western blotting方法检测Sno N、Samd泛素化调节因子2(Smurf2)、Arkadia、E-cadherin、α-SMA和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)等目标蛋白的相对表达量。结果:与NG组相比,HG组肾小管上皮细胞E-cadherin和Sno N表达减少(P0.05),而α-SMA、Col-Ⅰ、Smurf2和Arkadia表达增多(P0.05);与HG组相比,不同浓度MG132预处理肾小管上皮细胞后高糖培养,可见肾小管上皮细胞中Sno N和E-cadherin蛋白表达显著上调(P0.05),而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达显著下调(P0.05),并且这种效应呈量效依赖性,但MG132预处理对Smurf2和Arkadia的表达无影响。结论:MG132可对抗高糖介导的肾小管上皮细胞的纤维化效应,其机制可能是通过减少Sno N蛋白的泛素化降解作用实现的。     

HSPC238 对HMOX1、RPS27a、MT2A、UBB 调节的初步研究

目的:探讨HSPC238过表达或低表达对目标蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)的调节作用及其调节途径。方法:分别构建HSPC238的干扰载体及高表达载体,脂质体法转染HEPG2细胞株,RT-PCR、Western blot检测HSPC238及目标蛋白的mRNA、蛋白的表达量;进一步用目标蛋白的高表达质粒分别转染低表达及高表达HSPC238的HEPG2细胞株,实验组另以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,镍柱纯化目标蛋白,以HSPC238做免疫印迹,检测目标蛋白累积情况。结果:外源性干扰HSPC238后HMOX1、MT2A、RPS27a表达下调较明显,外源性过表达HSPC238后MT2A、UBB、RPS27a表达水平明显上调;目标蛋白的高表达质粒分别转染低表达及高表达HSPC238的HEPG2细胞株,实验组以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,与对照组比较,泛素化的目标蛋白条带明显增加。结论:过表达HSPC238可上调MT2A、UBB、RPS27a的表达,干扰HSPC238可下调HMOX1、MT2A、RPS27a的表达;HSPC238可能通过泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)对目标蛋白发挥调节作用。     

MG132对肿瘤恶病质小鼠骨骼肌消耗及TRAF6表达的影响

 目的 探讨蛋白酶体抑制剂MGl32对肿瘤恶病质骨骼肌消耗和TRAF6及其所调节的自噬溶酶体途径和泛素蛋白酶体途径相关因子Beclin-1、MuRF1和MAFbx基因表达的影响。方法 小鼠结肠腺癌C26细胞接种BALB/c小鼠诱导肿瘤恶病质模型。分为对照组（HC）、恶病质组（CC）和MG132治疗组（MG）。监测体质量和自发性活动,于接种后第12天,每天腹腔注射给予MG组小鼠0.1mg/kg的MG132,HC和CC组小鼠给予等量生理盐水,第19天处死小鼠。称量肿瘤、左侧腓肠肌重量,检测腓肠肌横切面积,RT-PCR和Western blot 检测TRAF6、Beclin1、MuRF1和MAFbx的mRNA和蛋白水平。结果 CC组小鼠去瘤体质量、自发性活动、腓肠肌重量和横切面积均显著低于HC组(P<0.05),MG组小鼠这次指标均显著回升(P<0.05),但仍低于HC组(P<0.05)。CC组小鼠腓肠肌组织TRAF6、Beclin1、MAFbx和MuRF1的mRNA和蛋白水平均显著高于HC组(P<0.05),MG组小鼠这次指标均显著低于CC组(P<0.05)。结论 MG132改善肿瘤恶病质骨骼肌消耗可能与抑制腓肠肌TRAF6的表达,阻断自噬溶酶体途径和泛素蛋白酶体途径有关。