伊马替尼减轻DOCA诱导的大鼠心肌纤维化与PDGFs/PDGFRs信号通路有关

 目的：探讨血小板源性生长因子（PDGFs）/PDGF受体（PDGFRs）信号通路拮抗剂伊马替尼（IMA）减轻醋酸去氧皮质酮（DOCA）诱导的盐敏感性高血压大鼠心肌纤维化的作用机制及PDGFs/PDGFRs信号通路在其中的作用。方法：60只雄性SD大鼠行右肾切除术,术后予以1%氯化钠和0.1%氯化钾饮水4周并随机分成3组：对照组、实验组（DOCA组）和治疗组（DOCA+IMA组）。使用尾套法每2周测定1次大鼠动脉收缩压（SBP）,苦味酸-天狼星红染色观察大鼠心肌间质纤维化程度和心肌血管周围胶原面积（PVCA）/血管腔面积（VA）比值,实时荧光定量PCR法检测心肌组织成纤维细胞特异蛋白1（FSP-1）、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、前胶原蛋白Ⅰ（procollagen Ⅰ）、前胶原蛋白Ⅲ（procollagen Ⅲ）、PDGFRα和PDGFRβ的mRNA含量,免疫组化法观察心肌组织波形蛋白（vimentin）、α-SMA、PDGFRα、PDGFRβ及磷酸化的PDGFRβ（p-PDGFRβ）的蛋白表达,免疫荧光法定位PDGFRα和PDGFRβ表达的细胞类型。结果：（1）干预第14天和第28天血压测定结果显示DOCA及DOCA+IMA组大鼠的SBP均明显高于对照组（P<0.01）,而DOCA组与DOCA+IMA组的SBP无显著差异（P>0.05）。干预第28天,DOCA组心肌间质纤维化程度和PVCA/VA比值明显高于对照组（P<0.01）,DOCA+IMA组心肌间质纤维化程度和PVCA/VA比值虽高于对照组（P<0.05）,但较DOCA组显著减小（P<0.01）。（2）干预第14天,DOCA组的PDGFRα和PDGFRβ表达较对照组增加（P<0.01）,DOCA+IMA组的PDGFRα和PDGFRβ 表达较DOCA组减少(P<0.01）。干预第28天,与对照组相比,DOCA组的PDGFRβ、p-PDGFRβ、FSP-1、α-SMA、procollagenⅠ和procollagen Ⅲ 表达明显增加（P<0.01）,而PDGFRα 的表达未见明显增加,组内比较显示PDGFRβ 表达大于PDGFRα,DOCA+IMA组PDGFRβ、p-PDGFRβ、FSP-1、α-SMA、procollagenⅠ和procollagen Ⅲ 表达较DOCA组减少（P<0.01）。（3） 干预第28天,对照组大鼠心脏间质主要是vimentin阳性的成纤维细胞,α-SMA表达很少,DOCA组大鼠α-SMA阳性的梭形细胞（肌成纤维细胞）数量明显增加（P<0.01）,DOCA+IMA组较DOCA组肌成纤维细胞数量均减少（P<0.05）。（4）在成纤维细胞和肌成纤维细胞中检测到的PDGFRα蛋白表达呈阳性,而在血管平滑肌细胞（VSMCs）中未检测到。PDGFRβ蛋白不仅在成纤维细胞和肌成纤维细胞中表达呈阳性,而且在VSMCs中也有表达。结论: 在DOCA诱导的盐敏感性高血压大鼠心肌纤维化中,PDGFRα主要在心肌纤维化早期发挥作用,而PDGFRβ在心肌纤维化的全程均起作用。PDGFRα和PDGFRβ表达定位于心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞,伊马替尼能够减少肌成纤维细胞的数量,表明伊马替尼很可能通过抑制PDGFs/PDGFRs信号通路,减少成纤维细胞的增殖和转化生成肌成纤维细胞,从而减轻心肌纤维化。     

血管过氧化物酶1对心肌梗塞后心肌纤维化机制的研究

目的探究血管过氧化物酶1在心肌梗塞(MI)后心肌纤维化中的作用,以及对心肌纤维化机制的影响。方法建立心肌梗塞SD大鼠模型,于造模后第7d、14 d、28 d采用Masson染色法观察心肌胶原纤维的表达,免疫荧光法观察心肌组织中MPO、VPO1和α-SMA的表达及定位,免疫组织化学法观察心肌组织中3-Cl Tyr和Ki67的表达情况,Western blot检测心肌成纤维细胞中MPO、VPO1、α-SMA和Collagen I的蛋白表达水平,RNAi技术沉默心肌成纤维细胞中VPO1的表达,并通过Western blot、Masson染色和CCK-8细胞增殖检测来探究VPO1对心肌纤维化机制的影响。结果在MI大鼠模型中,心肌间质纤维化程度较重;MPO、VPO1和α-SMA的荧光染色结果均呈阳性;随MI后时间的推移,VPO1、α-SMA和Collagen I的表达均显著升高(P0.01),MPO在MI后第7d表达量很高(P0.01),但在第28 d与sham组差异无统计学意义(P0.05);免疫组化染色后发现,MI组均有大量棕褐色着色细胞,在第7 d、14 d、28天时3-Cl Tyr和Ki67表达量均高于sham组(P0.05或P0.01)。通过对大鼠尾静脉注射siRNA来抑制VPO1的表达后发现心肌纤维化程度显著下降(P0.01),大鼠的存活率相对提高(P0.05)。与此同时,si-VPO1处理后,心肌梗塞的心肌成纤维细胞中α-SMA和Collagen I表达受到显著抑制(P0.01),Ki67阳性细胞增殖数量也显著减少(P0.01)。结论 VPO1是心肌梗死后心肌纤维化的关键调节因子之一,可能通过调节心肌成纤维细胞增殖分化以及胶原蛋白I型合成来介导心肌纤维化的发展,VPO1有望成为缺血性心肌病的治疗靶点。     

circRNA_000203对小鼠心肌成纤维细胞纤维化表型的影响

目的:检测糖尿病小鼠心肌中环形RNAs(circ RNAs)的表达谱,探讨circ RNA_000203对心肌成纤维细胞纤维化表型的影响。方法:采用Masson染色对糖尿病db/db小鼠和db/m对照小鼠心肌组织进行胶原纤维的染色观察;用circ RNAs表达谱芯片检测糖尿病心肌中circ RNAs的表达谱;实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)验证小鼠心肌中circ RNA_000203的表达水平;构建重组circ RNA_000203腺病毒载体,并感染小鼠心肌成纤维细胞;利用RT-q PCR和Western blot检测过表达circ RNA_000203后,小鼠心肌成纤维细胞中纤维化相关基因Col1a2、Col3a1、α-SMA的m RNA和蛋白表达变化。结果:Masson染色结果显示,与对照db/m小鼠相比,糖尿病db/db小鼠心肌组织出现明显纤维化。circ RNAs芯片检测结果表明circ RNAs在糖尿病心肌中异常表达,其中circ RNA_000203表达显著上调。RT-q PCR结果证明重组circ RNA_000203腺病毒载体构建成功,RT-q PCR和Western blot结果均显示过表达circ RNA_000203后,心肌成纤维细胞中Col1a2、Col3a1、α-SMA的表达均显著增强。结论:circ RNA_000203在糖尿病心肌中显著上调,其可特异地促进心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达和成纤维细胞向肌成纤维细胞表型的转化。     

大鼠成纤维细胞生长因子对心肌成纤维细胞增殖和转分化的作用机制

目的 探讨成纤维细胞生长因子（FGF）对心肌成纤维细胞(CFs)在增殖和转分化为肌成纤维细胞（MFs）中的作用。 方法 分离、培养大鼠CFs,利用FGF对其进行诱导培养,CCK-8技术检测细胞活性和增殖状况,免疫荧光和Western blotting技术测定α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达量。 结果 随大鼠CFs培养代数的增加,其α-SMA、ColⅠ的表达和活化为MFs的数量增加。加入FGF诱导培养的大鼠CFs数量没有明显增加;加入FGF1、FGF2诱导的CFs表达α-SMA减少,活化为MFs 数量减少。 结论 FGF家族对大鼠CFs没有促增殖作用,但FGF1和FGF2可以抑制CFs活化,减少其向MFs的分化。     

PLGF参与Ang II诱导的心脏成纤维细胞激活

 目的：探讨胎盘生长因子（PLGF）在血管紧张素II（Ang II）激活心脏成纤维细胞(CFs)中的表达及其作用。方法：原代分离培养并鉴定新生SD大鼠CFs。蛋白免疫印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、PLGF和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2),免疫荧光观察α-SMA的表达,WST-1法检测细胞增殖,RT-PCR检测PLGF、I型和III型胶原蛋白的mRNA表达水平。结果：(1)Ang II组PLGF mRNA 表达明显高于对照组（P<0．01),联用替米沙坦后,PLGF mRNA表达水平下降;Ang  II组PLGF蛋白表达水平高于对照组（P<0.05); (2)PLGF诱导CFs增殖及α-SMA蛋白表达增加（P<0.05）;PLGF干预CFs 60 min后,p-ERK1/2蛋白水平表达明显高于对照组（P<0.01);(3)Ang II+anti-PLGF组与Ang II组比较,细胞增殖和α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,I型和III型胶原蛋白mRNA表达水平亦下调（P<0.05）。结论：PLGF可能参与Ang II诱导的CFs增殖和纤维化过程。     

人羊膜上皮细胞静脉移植治疗大鼠心肌梗死

背景：人羊膜上皮细胞在体外适当诱导条件下可分化为心肌样细胞,可望成为细胞心肌成形术的种子细胞,但在心肌梗死原位是否能分化成心肌细胞值得探讨。 目的：探讨人羊膜上皮细胞移植在心肌梗死原位的分化及对心肌梗死后心室重构和心功能的影响。 方法：用胰酶消化分离人羊膜上皮细胞,行流式细胞仪检测和免疫组化染色以鉴定其表型特征。结扎SD大鼠左冠状动脉前降支以建立心肌梗死模型,实验分为人羊膜上皮细胞移植组、模型组及假手术组,人羊膜上皮细胞移植组于造模后1周经舌下静脉移植Brdu标记的人羊膜上皮细胞。移植后1,4,6周采用超声心动图检查心功能变化,应用苏木精-伊红和Masson染色观察心肌重构的变化,以免疫荧光双染色法检测人羊膜上皮细胞在心肌梗死区的植活与分化。 结果与结论：①所分离的人羊膜上皮细胞表达CD29、CD166、CD73和CK19,不表达CD44、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR。②人羊膜上皮细胞移植后6周,心肌梗死区仍可见Brdu标记的阳性细胞,表达心肌特异蛋白连接蛋白43、α-辅肌动蛋白和结蛋白。③移植组大鼠左心室纤维化程度明显低于模型组。④移植组大鼠射血分数、左室短轴缩短率显著高于模型组(P < 0.01);舒张期左室前壁厚度和收缩期左室前壁厚度也显著大于模型组(P < 0.05)。提示人羊膜上皮细胞在心肌梗死原位可分化为心肌细胞,可减缓心室重构并改善心脏功能。     

大鼠肝纤维化组织内ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697和α-SMA表达增强

 目的 探讨ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA蛋白及其mRNA在实验性大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达及肌动蛋白细胞骨架的变化。方法 结扎胆总管制备肝纤维化模型,用免疫组织化学、Western blot与RT-PCR检测ROCK-I、α-SMA蛋白及其mRNA的表达,用特异性荧光染色检测肌动蛋白细胞骨架。结果 随着肝纤维化的发展,大鼠肝脏中ROCK-I及α-SMA阳性细胞明显增多;造模1~4周肝组织ROCK-I、α-SMA的阳性面积及ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA蛋白表达显著性高于正常组（P<0.05）;ROCK-I基因表达与α-SMA表达呈正相关(r=0.718,P<0.05);随着造模时间延长,肝组织肌动蛋白荧光信号增强。结论 ROCK-I在肝纤维化发生过程中有表达上调和功能活化,可能通过诱导肌成纤维细胞表型形成而参与肝纤维化的发生。     

微小RNA-199a-5p通过靶向SIRT1促进心肌纤维化相关基因表达

目的:研究微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)对心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达的调控作用及其可能作用的靶基因。方法:原代分离并体外培养成体C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞;双萤光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p与潜在靶基因沉默信息调节因子1(SIRT1)3’端非翻译区(3’-UTR)的结合作用;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western blot法分别检测SIRT1以及纤维化标志物胶原蛋白(Col)1a1、Col3a1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表达。结果:在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠心肌成纤维细胞中,Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达增强,miR-199a-5p表达上调。在心肌成纤维细胞中过表达miR-199a-5p可以增强Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。双萤光素酶报告基因实验显示miR-199a-5p与SIRT1 3’-UTR有结合作用。RT-q PCR和Western blot结果证实miR-199a-5p可在转录水平抑制SIRT1表达。过表达miR-199a-5p和沉默SIRT1均能一致性促进心肌成纤维细胞中Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。抑制AngⅡ诱导的小鼠心肌成纤维细胞中NF-κB激活,可显著降低miR-199a-5p表达。结论:SIRT1是miR-199a-5p的作用靶基因,并介导miR-199a-5p促进纤维化标志物Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。     

慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白载体转染大鼠心肌成纤维细胞

目的探讨慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白(LV-SDF-1α-GFP)对心肌成纤维细胞影响,最佳感染条件及目的蛋白表达和分泌特点。方法差速贴壁法分离培养乳大鼠心肌成纤维细胞,观察和免疫荧光鉴定。不同滴度及条件的LV-SDF-1α-GFP转染心肌成纤维细胞,观察荧光表达,探索最佳转染条件。LV-SDF-1α-GFP目的基因病毒以及阴性对照CON145病毒的转染心肌成纤维细胞,绘制生长曲线,探索转染对心肌成纤维细胞的增殖有无明显影响。利用最佳转染剂量组转染心肌成纤维细胞,斑点印迹法(Dot blotting)检测SDF-1α目的蛋白分泌。计量资料进行统计学分析。结果心肌成纤维细胞具很高活性,传至4代纯度高,折光度好,无自发性搏动。LV-SDF-1α-GFP最佳转染感染复数(MOI)值为10,添加感染增强液,聚凝胺组感染效果最好,效率达80%。LV-SDF-1α-GFP组以及阴性对照CON145组对心肌成纤维细胞毒性作用小,细胞形态无明显变化,与非转染组生长曲线相似,差异无统计学意义(P0.05)。转染LV-SDF-1α-GFP的心肌成纤维细胞培养至第4天SDF-1α蛋白分泌量达最高值,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 LV-SDF-1α-GFP载体对心肌成纤维细胞具很高的转染效率,细胞毒性小,并能够分泌SDF-1α目的蛋白。     

CTRP3通过抑制Smad3通路和肌成纤维细胞转化减轻心肌梗死后心肌纤维化

<正>目的:观察CTRP3在心肌纤维化中的作用并探讨其可能的分子机制。方法:结扎冠状动脉左前降支制备大鼠心肌梗死模型,采用马松三色法评价心肌纤维化程度;培养大鼠心肌成纤维细胞,采用real-time PCR与免疫印迹法检测纤维化相关指标。结果:心肌梗死大鼠心脏CTRP3表达水平降低;心肌注射腺病毒过表达CTRP3可以减轻心肌梗死引起心肌肥大,抑制间质纤维化,减少肌成纤维细胞数量。CTRP3孵育心肌成纤维细胞可以显著抑制TGF-β1诱导的SMA表达,减少结缔组织生长因     

神经调节蛋白1β与卡托普利对慢性心衰大鼠心肌纤维化及转化生长因子β1的影响

目的:探讨神经调节蛋白1β(neuregulin-1β,NRG-1β)与卡托普利联合应用对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达的影响。方法:将青年雄性SpragueDawley大鼠随机分为假手术组、心衰组、NRG组、卡托普利组和联合用药组,采用腹主动脉-下腔静脉穿刺造瘘法制备心衰模型。通过超声心动图评价大鼠心功能;Masson染色检测心肌纤维化程度,并计算胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF);放射免疫法检测血浆中血管紧张素II(Ang II)的浓度;Western blot检测各组大鼠左心室心肌组织中TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平;透射电镜观察左室心肌的超微结构。结果:与心衰组比较,NRG组、卡托普利组及联合用药组左心室舒张末直径和心肌纤维化程度明显降低,射血分数明显升高(P0.05);TGF-β1和α-SMA蛋白表达明显降低(P0.05);电镜下显示,NRG组、卡托普利组及联合用药组心肌纤维化程度较心衰组明显减轻,而与NRG组和卡托普利组相比,联合用药组效果更加显著(P0.05)。结论:神经调节蛋白1β与卡托普利单用及联合应用均可有效改善心功能、抑制心肌纤维化,且联合用药的疗效优于单独用药。     

纤溶酶原激活物抑制剂1 siRNA对大鼠肺纤维化的治疗作用

 目的： 观察纤溶酶原激活物抑制剂1 （PAI-1）siRNA对博来霉素(BLM)诱导的大鼠肺纤维化的治疗作用,并初步探讨其机制。方法： 72只Wister大鼠分为4组,即对照组（control组）、BLM组、BLM+非特异 siRNA 组(BLM+N组)和BLM+PAI-1 siRNA组(BLM+P组)。BLM 5 mg/kg气管内滴入制作肺纤维化模型,control组注入等体积的生理盐水。造模后,于局麻下BLM+P组每周2次气管内注入PAI-1 siRNA 7.5 nmol (0.2 mL);BLM+N组注入相同剂量的非特异siRNA;control组和BLM组注入等体积的生理盐水,28 d共给药8次。分别于第7 d、14 d和28 d每组处死6只,左肺行肺泡灌洗测定PAI-1活性,右中叶肺组织RT-PCR法检测Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）的mRNA表达。结果： 造模后,7 d、14 d和28 d肺泡灌洗液中PAI-1活性持续升高,每周2次气管内注入PAI-1 siRNA可以使肺泡灌洗液中PAI-1的活性降低,与同一时点BLM组比较有明显差异（均P<0.05）;模型组7 d、14 d和28 d  Ⅲ型胶原、α-SMA和TIMP-1的mRNA表达明显增高,BLM+P组3个时点Ⅲ型胶原、α-SMA和TIMP-1的mRNA表达明显减少,分别与同一时点BLM组比较有明显差异（均P<0.05）。结论： 每周2次气管内给予PAI-1 siRNA可以持续减少PAI-1表达。PAI-1 siRNA不但直接抑制肺纤维化进展,而且可以打破基质金属蛋白酶及组织抑制因子之间的平衡。     

慢性酒精摄入所致的肝细胞上皮-间充质转化参与小鼠肝纤维化形成

 目的：探讨慢性酒精摄入对肝组织病理学改变的影响及上皮-间充质转化对肝纤维化形成的作用。方法：将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组：对照组灌胃给予与酒精组等体积的蒸馏水,低剂量和高剂量酒精组分别灌胃给予2.0 g·kg -1·d -1和 4.0 g·kg -1·d -1酒精5个月。肝组织病理学改变和纤维化分别用HE和 Masson三染色观察;荧光标记的TUNEL法检测肝组织细胞凋亡;自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性;肝组织成纤维细胞特异性蛋白1（FSP-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏素表达采用免疫荧光观察;E-钙黏素、α-SMA、FSP-1、转化生长因子β 1 (TGF-β 1) 和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白表达水平用Western blotting 检测。结果：与对照组相比,小鼠酒精灌胃5个月后,血清ALT和AST活性升高;肝组织细胞凋亡增加;低剂量酒精组呈现肝脂肪变性和轻度的肝纤维化,高剂量酒精组呈现出严重的肝纤维化;肝组织丙二醛（MDA）含量升高,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）下降;肝细胞E-钙黏素表达下降,α-SMA表达增加;低剂量酒精组肝细胞内白蛋白和FSP-1共定位,而高剂量酒精组肝细胞内只表达FSP-1;Western blotting检测结果显示,E-钙黏素表达下降,而α-SMA、FSP-1、TGF-β 1和HIF-1α蛋白表达水平升高,但是HIF-1α蛋白表达水平在高、低酒精组之间无差别。结论：慢性酒精摄入可诱导肝纤维化,部分成纤维细胞来源于肝细胞上皮-间充质转化,其机制可能与肝细胞氧化状态、TGF-β 1及HIF-1α升高有关。     

miR-219与TGFBR2的调控关系在肾脏纤维化中的作用

目的:研究微小RNA-219(miR-219)通过靶向调控转化生长因子βⅡ型受体(TGFBR2)在肾脏纤维化中发挥的作用。方法:收集2017年9月～2018年3月于我院就诊的70例肾脏纤维化患者,选取同期来本院体检的20例健康人设为对照组,RT-qPCR检测肾脏纤维化患者及对照组血清中miR-219的表达水平,并检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠肾成纤维细胞NRK49F后miR-219的表达水平。Western blot检测转染miR-219模拟物(miR-219 mimics)的NRK49F细胞在AngⅡ刺激后α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达情况。筛选出miR-219的潜在靶基因TGFBR2,并通过萤光素酶报告基因法进行验证。RT-qPCR和Western blot检测miR-219 mimics对TGFBR2的mRNA及蛋白表达的影响。RT-qPCR检测miR-219 mimics对α-SMA、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)和COL3A1的mRNA表达水平的影响。构建单侧输尿管闭塞(UUO)小鼠模型并检测其肾脏组织中miR-219的表达水平,对UUO小鼠注射miR-219后观察肾脏纤维化的变化情况,并检测COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平。结果:肾脏纤维化患者血清中miR-219的表达水平明显低于对照组,UUO小鼠肾脏组织中miR-219的表达显著下降(P0.01);AngⅡ刺激NRK49F细胞后miR-219的表达水平明显降低,且miR-219 mimics可抑制α-SMA蛋白的表达(P0.01);miR-219 mimics对TGFBR2具有靶向调控作用,可抑制TGFBR2的mRNA及蛋白表达;miR-219 mimics可抑制α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平;miR-219可下调UUO小鼠中COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平并抑制其肾脏纤维化进程。结论:miR-219可通过抑制TGFBR2的表达从而抑制肾脏纤维化的发展,可能成为肾脏纤维化诊断及治疗的新靶点。     

葛根素注射液对糖尿病KKAy小鼠肾小管上皮细胞的影响

 目的：观察葛根素治疗糖尿病小鼠肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）过程中肾小管上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白表达的变化,为临床药物治疗糖尿病RIF提供实验依据。方法：将16只2型糖尿病模型KKAy小鼠随机分为模型组（n=8）和葛根素注射液治疗组（n=8）。8只C57BL/6J小鼠作为正常组。用药组小鼠14周龄开始以腹腔注射的方式给药,观测小鼠日常状态及血糖变化,于24周龄处死小鼠,取肾脏分别观察肾组织病理形态学变化,免疫组织化学法检测小鼠肾组织中α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)、转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）和转化生长因子β I型受体（TGF-β-RI）蛋白的表达。结果：形态学观察可见模型组发生明显的纤维化改变,而经葛根素注射液治疗后,小鼠肾间质基质轻度增多,病变较轻微。治疗组KKAy小鼠肾组织中较模型组小鼠肾组织中α-SMA、TGF-β1和TGF-β-RI蛋白的表达减少。结论：葛根素注射液可在一定程度上减少α-SMA的表达,抑制KKAy小鼠肾脏组织中TGF-β1和TGF-β-RI蛋白表达,阻断并逆转EMT的过程,延缓肾间质纤维化的发生和发展。     

LPS诱导心肌成纤维细胞HMGB1的释放与Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白分泌的相关性研究

目的:探讨小鼠心肌成纤维细胞(CFs)在LPS刺激下高迁移率族蛋白(HMGB1)释放与Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白分泌的相关性。方法:从7～14 d BALB/c小鼠心脏中分离培养心肌成纤维细胞,分别用LPS(500 ng/mL)刺激0,6,12,24,36,48 h后收取细胞及其上清。采用RT-PCR检测HMGB1以及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平,通过Western blot检测细胞及其培养上清中HMGB1以及Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;采用免疫荧光分析HMGB1在细胞内的定位。结果:LPS刺激CFs 6 h时HMGB1以及Ⅰ、Ⅲ型胶原水平无明显变化,12、24、36、48 h后HMGB1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量均增加。Western blot检测发现,LPS刺激CFs 24 h后细胞上清可检测到HMGB1蛋白,且细胞中HMGB1的表达呈现先增加后降低的现象。免疫荧光观察到HMGB1的释放伴随着从细胞核到细胞质的转位过程。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的Western blot结果均呈现增加趋势。结论:LPS刺激CFs后HMGB1由细胞核转移到细胞质并可主动分泌到胞外,其作用呈现一定的时间依赖性。与心肌纤维化密切相关的Ⅰ、Ⅲ型胶原在LPS刺激后表达量明显增加,提示内源性HMGB1的定位及分泌可能与脓毒症引起的心功能紊乱后期的心肌纤维化可能有一定的关系。     

CTGF反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原合成的抑制效应

目的：研究结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及CTGF表达的抑制作用。 方法： 差速贴壁法分离新生SD大鼠心肌成纤维细胞(CFs)。反义、正义、错义CTGF寡核苷酸分别经阳离子脂质体介导转染CFs，并与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)10-6mol/L共培养48 h，采用MTT法测CFs生长数目，羟脯氨酸法测胶原蛋白含量，RT-PCR法及Western blotting法分别测CTGF mRNA及蛋白水平的表达。 结果： AngⅡ可以在mRNA及蛋白水平明显促进CFs CTGF的表达(P<0.01)，且呈浓度-时间依赖性。CTGF反义链组的MTT反应A值、胶原蛋白含量、CTGF mRNA及蛋白水平的表达量均明显低于AngⅡ组（P<0.01），而CTGF正义链组和错义链组与AngⅡ组无显著差异(P>0.05)。 结论： AngⅡ刺激下产生的CFs CTGF mRNA和蛋白水平的表达上调，可能是心肌纤维化传导通路中的关键环节，CTGF反义寡核苷酸可以序列特异性地阻断CTGF的介导，从而抑制AngⅡ对心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及CTGF表达的诱导作用，进一步证实CTGF可能是拮抗心肌纤维化的特异性靶位。