lncRNA PVT1促进卵巢癌细胞自噬相关机制研究

目的探究长链非编码RNA PVT1对卵巢癌细胞自噬的影响及其调控机制。方法 Real-timePCR检测PVT1在卵巢癌组织样本中表达情况及PVT1在卵巢癌细胞株中的表达;免疫荧光实验和Western blot检测过表达PVT1对卵巢癌细胞自噬水平的影响;Western blot用于研究过表达PVT1对自噬相关蛋白ATG7表达的影响;利用共转染实验验证PVT1通过上调ATG7从而影响自噬水平。结果 Real-time PCR结果表明卵巢癌组织中PVT1的表达水平高于正常组织,各卵巢癌细胞系(ES2、OVCAR3、A2780)中PVT1表达高于正常卵巢细胞系(HOSEpiC)。Western blot和免疫荧光实验结果表明,与对照组相比,过表达PVT1能增加自噬标志蛋白LC3II/LC3I比例,能够显著促进卵巢癌细胞的自噬并通过上调ATG7的表达促进细胞自噬的发生。结论 lncRNA PVT1能够上调ATG7表达,促进卵巢癌细胞自噬的发生,有望成为卵巢癌新的治疗靶点。     

miR-30a通过靶向调控Beclin-1、ATG5影响食管癌细胞自噬及增殖过程北大核心CSCD

目的:探究miR-30a通过靶向调控Beclin-1、ATG5表达对食管癌细胞自噬及增殖过程的影响。方法:靶基因预测、双荧光素酶报告实验验证miR-30a对Beclin-1、ATG5的靶向调控作用。GEO、Human Protein Atlas和GEPIA在线分析TCGA数据库和GTEx项目中食管癌组织及癌旁组织miR-30a、Beclin-1、ATG5表达、患者预后生存期。免疫组化检测45例食管癌及癌旁组织标本Beclin-1、ATG5表达,并分析Beclin-1、ATG5表达与患者临床病理参数的关系。采用脂质体LipofectamineTM3000将靶向Beclin-1、ATG5的miR-30a-mimic转染至Eca-109细胞,体外常规培养并分为3组:未转染组(control组)、转染无义RNA的阴性对照组(mimic NC组)、转染miR-30a-mimic的干扰组(miR-30a组)。MTT和克隆形成实验测定细胞增殖活力;qRT-PCR检测miR-30a、Beclin-1、ATG5 mRNA表达;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭;Western blot检测Beclin-1、ATG5、LC3Ⅱ、p62蛋白表达。透射电镜观察细胞自噬泡形成情况。结果:生信分析结果显示,食管癌组织中miR-30a表达高于正常组织,Beclin-1、ATG5表达低于正常组织,且预后生存期与miR-30a表达呈负相关,与Beclin-1、ATG5表达呈正相关(P<0.05)。与control组和mimic NC组相比,miR-30a组细胞增殖、迁移和侵袭能力、p62蛋白表达明显升高,Beclin-1、ATG5、LC3Ⅱ表达、细胞自噬活力明显降低(P<0.05)。而control组与mimic NC组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:miR-30a靶向调控Beclin-1、ATG5表达;Beclin-1、ATG5在食管癌组织和细胞中表达均降低,具有肿瘤抑制基因作用,可能通过抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭、促进自噬发挥抑癌作用,为通过靶向调控自噬途径治疗食管癌提供了新思路。     

lncRNA XIST通过靶向miR-3666调控胃癌细胞增殖、侵袭转移机制北大核心CSCD

目的:探讨lncRNA XIST对胃癌细胞增殖、侵袭转移的影响及分子机制。方法:收集武汉市第四医院30例胃癌患者癌组织及癌旁组织,培养正常胃黏膜上皮细胞MRG-1、胃癌细胞SGC-7901和AGS,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA XIST和miR-3666表达水平;通过敲减胃腺癌细胞AGS中lncRNA XIST表达以及下调miR-3666表达水平,分析lncRNA XIST及miR-3666对胃癌细胞的调控作用,将细胞AGS分为si-NC组、si-XIST组、miR-NC组、miR-3666组、si-XIST+antimiR-NC组、si-XIST+anti-miR-3666组;MTT检测细胞增殖情况;Transwell检测细胞迁移和侵袭;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验检测lncRNA XIST和miR-3666的靶向关系。结果:与癌旁组织和正常胃黏膜上皮细胞MRG-1比较,胃癌组织和AGS、SGC-7901细胞中XIST表达水平升高,miR-3666表达水平降低(P<0.05)。敲除lncRNA XIST或过表达miR-3666,AGS细胞增殖能力减弱,迁移和侵袭能力降低,细胞凋亡率升高(P<0.05)。lncRNA XIST靶向调控miR-3666,抑制miR-3666逆转了XIST基因敲除对胃癌AGS细胞增殖、运动性及凋亡的影响。结论:敲除lncRNA XIST可通过上调miR-3666抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。     

MIF通过调节急性幽门螺杆菌感染介导的炎症反应、自噬和凋亡促进胃癌细胞增殖及细胞周期进展

目的：探究巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）在幽门螺杆菌（Hp）感染的胃癌细胞中的表达及MIF对Hp感染的胃癌细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。方法：体外培养胃癌细胞系AGS,Western blot检测随Hp感染时间的延长，AGS细胞中MIF蛋白表达变化；siRNA干扰与脂质体瞬时转染技术靶向沉默胃癌细胞中MIF表达，RT-PCR与Western blot检测si-MIF转染效率；Hp感染转染后的胃癌细胞，并将其分为：si-NC组、si-MIF组、Hp+si-NC组、Hp+si-MIF组，MTT检测各组胃癌细胞增殖活力，Annexin V-FITC/PI双染色联合流式细胞术检测各组细胞凋亡率，DCFH-DA法检测各组细胞中活性氧（ROS）含量，JC-1染色观察各组细胞线粒体膜电位水平，Western blot检测各组细胞线粒体自噬信号通路PINK1/Parkin中蛋白PINK1、Parkin和自噬标志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表达，免疫荧光检测各组胃癌细胞中自噬蛋白LC3B与线粒体特征蛋白Mito Tracker的共定位水平。结果：胃癌细胞中MIF蛋白水平随Hp刺激时间延长而逐渐升高，...     

胃癌中MCU的表达及对胃癌细胞转移的作用

目的探讨线粒体钙单向转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter, MCU)在胃癌组织中的表达以及对胃癌细胞转移的影响。方法采用免疫组化SP法检测60例原发性胃癌和癌旁组织中MCU的表达;采用免疫荧光法和Western blot法检测20例新鲜胃癌组织及癌旁组织中MCU的表达。采用CCK-8实验检测MCU诱导剂(Spermine)对人胃癌细胞(MGC-803)增殖的影响。应用Transwell和细胞划痕实验检测对照组、Spermine组、siRNA MCU组对MGC-803细胞侵袭和迁移能力的影响。根据不同分组,干预48 h,通过线粒体膜电位检测钙离子,Western blot法检测MCU蛋白的表达水平。结果胃癌组织中MCU表达水平显著高于癌旁组织。细胞实验结果显示,Spermine对MGC-803细胞增殖的影响呈剂量依赖性。Spermine显著增加MGC-803细胞迁移和侵袭能力,siRNA MCU组显著降低细胞侵袭和迁移的细胞数量。线粒体膜电位结果表明,MCU调控胃癌细胞线粒体膜电位钙离子的水平。siRNA MCU组显著降低HIF-1α、TGF-β和增加E-cadherin蛋白的表达。结论 MCU在胃癌组织中高表达并促进胃癌细胞侵袭和迁移,对HIF-1α和TGF-β表达具有调控作用。     

RNA甲基化相关蛋白Mettl-14在胃癌中的表达及对胃癌细胞功能的影响

目的探讨RNA甲基化相关蛋白Mettl-14在胃癌样本及癌旁组织中的表达差异,并分析其对胃癌细胞系功能的调节作用。方法用实时定量PCR方法检测83例分化程度不同胃癌及对应癌旁组织中Mettl-14 mRNA水平的表达;使用RNA干扰方法敲低Mettl-14在胃癌细胞系MGC-803中的表达,通过细胞增殖实验、细胞周期实验、划痕实验和Transwell实验检测Mettl-14敲低后对MGC-803细胞功能的影响。结果与癌旁组织相比Mettl-14 mRNA的表达水平在胃癌组织显著降低;且Mettl-14 mRNA的低表达与肿瘤分级相关(P0.05);在MGC-803细胞系中敲低Mettl-14,可促进细胞增殖、细胞周期运行、细胞迁移和侵袭。结论 Mettl-14可能在胃癌发生发展中发挥抑癌基因作用,并有可能成为胃癌诊断标志物及治疗靶点。     

ATG5敲低后抑制人肺癌细胞H1299自噬并增强南蛇藤素诱导的细胞凋亡

目的构建自噬相关基因5(autophagy-related gene 5,ATG5)低表达肺癌细胞株,观察肺癌细胞自噬活性,检测南蛇藤素对肺癌细胞凋亡的影响。方法用ATG5 shRNA技术构建ATG5敲低的人肺癌H1299细胞株作为ATG5敲低组,未敲低ATG5的H1299细胞作为对照组;荧光定量PCR和Western blot检测肺癌细胞中ATG5的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)及死骨片蛋白1的(sequestosome 1,P62)表达,并转染红色荧光标记的LC3质粒观察LC3斑点聚集情况;经南蛇藤素刺激后,以流式细胞术检测细胞凋亡,最后使用Western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax等蛋白的表达。结果慢病毒感染组ATG5较对照组mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05);ATG5敲低后LC3-Ⅱ水平下降,P62水平上升,并且转染后RFP-LC3斑点聚集减少(P0.05)。相比对照组,南蛇藤素明显促进ATG5敲低细胞凋亡(P0.01);ATG5敲低组中促凋亡分子Bax、cleaved caspase-3表达比对照组明显增加(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P0.05)。结论 ATG5敲低抑制肺癌细胞自噬后,南蛇藤素能够明显增强人肺癌细胞的凋亡,提示抑制肺癌细胞自噬可能为针对性处理肺癌细胞耐药提供新的思路。     

小檗碱对人骨髓增生异常综合征细胞MUTZ-1自噬活性的影响及机制

为探讨小檗碱(Berberine, Ber)对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)细胞MUTZ-1自噬活性的影响及机制,以MTT法检测Ber对MUTZ-1细胞的增殖抑制率、半数抑制浓度(half inhibitory concentration, IC_(50)),并绘制增殖抑制率曲线;免疫荧光法测定细胞中LAMP1表达;Western blotting测定LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p-mTOR、Beclin-1、p-Akt、p-ERK、ATG3、ATG4、ATG5、ATG7蛋白表达。结果显示,Ber作用后MUTZ-1细胞增殖抑制水平随时间而增强,Ber对MUTZ-1细胞24、48 h的IC_(50)分别为265.1μmol/L和143.2μmol/L;LAMP1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随时间而增加;Beclin-1、ATG3、ATG5表达水平增加,p-mTOR、p-Akt表达水平降低,p-ERK、ATG4、ATG7表达水平无明显变化。由此说明Ber可抑制MUTZ-1细胞增殖并诱导其自噬,自噬的诱导与Beclin-1、ATG3、ATG5表达上调和mTOR活性受抑制有关。     

子宫颈鳞状细胞癌组织中LC3B的表达及其与Ki-67表达的相关性

目的：探讨自噬标志物LC3B蛋白在子宫颈鳞状细胞癌组织中的表达及其与细胞增殖蛋白Ki-67表达的相关性。方法采用免疫组化SP法检测16例正常子宫颈和126例子宫颈鳞状细胞癌组织中LC3B及Ki-67的表达。结果 LC3B蛋白在子宫颈鳞状细胞癌组织中的表达低于正常子宫颈上皮,差异有统计学意义(P<0．05);LC3B与 Ki-67表达呈负相关(rs =-0．248,P<0．05)。结论子宫颈鳞状细胞癌中LC3B的表达降低,自噬活性减弱可能促进早期子宫颈鳞状细胞癌细胞的增殖,该发现为进一步探究自噬在子宫颈癌发生、发展中的作用提供临床参考依据。     

长链非编码RNA GASL1在乳腺癌组织及细胞系中的表达及作用

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA) GASL1在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌癌细胞增殖和凋亡的影响。方法RT-qPCR检测癌组织、癌旁组织、多个乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3)及正常乳腺细胞HBL-100中lncRNA GASL1的表达水平。MCF-7细胞经pc DNA3. 1质粒过表达lncRNA GASL1,或siRNA干扰lncRNA GASL1表达后,运用MTT法检测细胞增殖; caspase-3活力检测试剂盒检测caspase-3活力; Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达。结果 LncRNA GASL1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中表达水平降低(P 0. 05);过表达lncRNA GASL1可抑制MCF-7的增殖,促进其凋亡(P0. 05);干扰lncRNA GASL1表达可促进MCF-7的增殖,抑制其凋亡(P0. 05)。结论 lncRNA GASL1在乳腺癌中表达水平降低,通过调节乳腺癌细胞增殖和凋亡参与乳腺癌的发生发展。