骨髓基质细胞与白血病细胞耐药、抗凋亡相关研究进展

骨髓基质细胞与其分泌的细胞因子、细胞外基质构成的骨髓微环境在机体造血发育、血液病发生、恶性血液病细胞凋亡等生理病理过程中发挥着重要作用。本文综述了骨髓基质细胞保护白血病细胞抑制药物诱导的凋亡及其机制的相关研究进展。     

骨髓基质细胞在急性淋巴细胞白血病中作用的研究进展

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种常见的血液系统恶性肿瘤,其复发及耐药与骨髓微环境有很大程度的关联。骨髓基质细胞(BMSC)作为骨髓微环境的重要组成部分,其与白血病细胞间的相互作用不容忽视。BMSC主要通过分泌细胞因子或细胞外基质蛋白,参与并调节着与ALL细胞增殖或凋亡相关的信号通路,从而影响ALL细胞的生存。为此,本文归纳总结了骨髓基质细胞与ALL细胞相互作用的几条信号通路,综述两者间相互作用的研究进展。     

白血病骨髓基质细胞黏附培养对Jurkat细胞IAP家族主要成员表达的影响

目的:观察白血病骨髓基质细胞黏附培养对Jurkat细胞化疗敏感性及IAP家族主要成员表达的影响。方法:Jurkat细胞与60Co照射的基质细胞层黏附培养构建共培养模型,扫描电镜观察,0.5μmol/L DNR作用24h后FITC-Annexin V/PI标记流式细胞仪定量Jurkat细胞的凋亡率。Western blot检测黏附培养4、24及48h时Jurkat细胞总蛋白中XIAP和survivin的表达变化,流式细胞仪检测Jurkat细胞周期分布。结果:白血病基质细胞黏附培养组、正常基质细胞黏附培养组Jurkat细胞凋亡率分别为(6.05±0.54)%、(8.48±0.86)%,与悬浮对照组(25.74±6.15)%比较差异均有显著性(P<0.01),且白血病基质细胞黏附培养组与正常基质细胞黏附培养组间差异也有显著性(P<0.05)。Western blot检测结果示,与白血病基质细胞黏附培养4h即观察到XIAP表达的上调,24h和48h尤为明显,但survivin表达的变化呈现相反趋势。与Western blot结果相一致,Jurkat细胞周期阻滞于G0-G1期。结论:白血病骨髓基质细胞黏附培养能介导Jurkat细胞耐药,其机制可能与Jurkat细胞XIAP表达上调和survivin表达下调有关。     

骨髓基质细胞-白血病细胞共培养模型中主要微环境成分对化疗敏感性的影响

背景：目前多数耐药机制研究均采用单细胞培养模型。目的：构建骨髓基质细胞．白血病共培养模型，探讨该模型中纤维连接蛋白、基质细胞膜蛋白及基质细胞因子等白血病微环境成分对白血病细胞化疗敏感性的影响。设计、时间及地点：开放性实验，于2006—03／10在解放军沈阳军区总医院中心实验室完成。材料：血常规、骨髓涂片细胞检查正常的骨髓标本11份，其中男6例，女5例，中位年龄34岁；经临床和血常规、骨髓涂片细胞检查确诊的未经治疗的急性淋巴细胞白血病患者骨髓标本13份，其中男7例，女6例，中位年龄28岁；每份骨髓1．0～2．0mL，50U／mL肝素抗凝。方法：①常规分离、培养骨髓基质细胞，Jurkat细胞与^60Co照射的基质细胞层黏附培养48h，收集上清，扫描电镜观。②2％戊二醛固定灭活基质细胞层，去除其细胞因子分泌功能，保留基质细胞膜蛋白。③通过MTT法测定柔红霉素的IC50、FITC-Annexin V／PI标记流式细胞仪定量细胞凋亡率。主要观察指标：采用倒置显微镜、扫描电镜及荧光显微镜对骨髓基质细胞、骨髓基质细胞-Jurkat细胞共培养模型及凋亡的Jurkat细胞进行形态学观察；通过流式细胞仪定量细胞凋亡率；MTT法测定IC50评价化疗药物敏感性。结果：①成功构建骨髓基质细胞-Jurkat共培养模型，扫描电镜发现Jurkat细胞通过伪足黏附于基质细胞层。②纤维连接蛋白黏附、灭活基质细胞黏附培养、活性基质细胞黏附及共培养上清均明显黏附抑制了柔红霉素对Jurkat细胞的细胞毒作用。③纤维连接蛋白黏附、灭活基质细胞黏附培养、活性基质细胞黏附及共培养上清均明显黏附抑制了柔红霉素对Jurkat的凋亡诱导效应。结论：骨髓基质细胞-Jurkat细胞共培养模型中微环境成分骨髓基质细胞膜蛋白、纤维连接蛋白和基质细胞因子均参与了Jurkat细胞耐药的形成。     

骨髓造血微环境的基质细胞

本文对骨髓基质细胞的起源、分化，特征及形成骨髓空间、支持造血的作用等问题的进展作了综述。     

骨髓基质细胞对白血病细胞的直接抑制作用及其机制探讨

我们已经初步证实,功能正常的骨髓基质细胞能将白血病细胞的肿瘤抗原特异地提呈给Ｔ淋巴细胞,诱导出特异性抗肿瘤免疫应答（另文报道）,因此,除了造血支持作用以外,功能正常的骨髓基质细胞可能具有免疫监视功能,特别是在清除白血病细胞中至关重要。除了提呈肿瘤抗原...     

骨髓基质细胞在造血调控中的作用

骨髓基质细胞是造血诱导微环境的重要组成成分,一直是造血调近研究的重点。骨髓基质细胞通过与造血细胞密切接触而直到支持造血细胞的作用。随着近年分子生物学技术的发展,揭示了基质细胞通过其粘附结构对造血下／祖细胞的回髓定位以及基质细胞产生多种细胞因子调控造血的机理。本文就骨髓基质细胞的造血调控的研究进展作一综述。     

白血病骨髓基质增强HL-60细胞抵抗IDA化疗药物研究

为了研究造血微环境异常在残留白血病发生中的作用和机制 ,采用Dexter型骨髓培养体系形成白血病骨髓基质细胞贴壁层 ,接种HL 6 0细胞共培养 ,用去甲氧基柔红霉素 (IDA)处理 ,观察HL 6 0细胞的活性变化。结果表明 :随着IDA剂量的增加及培养时间的延长 ,HL 6 0细胞活性逐渐减弱 ,与白血病骨髓基质共培养的HL 6 0细胞数明显高于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ,骨髓基质细胞层或单纯基质细胞条件培养液体外使IDA对HL 6 0细胞杀伤能力减弱。结论 :白血病骨髓基质有助于HL 6 0细胞抵抗化疗药物 ,对残留白血病的发展具有一定作用。     

RNA干扰骨髓基质细胞衍生因子表达对共培养Jurkat细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨阻抑骨髓基质细胞衍生因子(SDF1)表达对与其共培养的Jurkat细胞增殖、凋亡的影响。方法脂质体介导SDF1特异性RNA干扰质粒转染培养的急性白血病骨髓基质细胞,G418筛选阳性克隆(A组),采用ELISA法检测SDF1表达变化;与Jurkat细胞共培养,绘制生长曲线并计算倍增时间,用流式细胞术检测细胞周期,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺失末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl2、Bax、Fas、FasL表达。以未转染急性白血病骨髓基质细胞(B组)及正常骨髓基质细胞(C组)作为对照。结果A组骨髓基质细胞培养上清SDF1含量为(384±41)pg/ml,较B组[(2474±271)pg/ml]、C组[(1324±154)pg/ml]明显降低。与之共培养的Jurkat细胞,A组与B组、C组比较,细胞增殖速度减缓,倍增时间延长(A组42h,B组29h,C组33h);细胞周期分析G0/G1期细胞比例增多[A组(28.47±2.39)%,B组(19.43±2.80)%,C组(27.15±2.07)%],S期细胞减少[A组(25.57±1.90)%,B组(74.48±3.23)%,C组(60.99±2.33)%],G2/M期细胞增多[A组(45.96±3.24)%,B组(6.09±1.96)%,C组(11.86±1.98)%];细胞凋亡率增加[A组(15.2±0.8)%,B组(5.4±0.7)%,C组(9.5±0.4)%];PCNA、Bcl2、Fas表达减少,Bax、FasL表达增多。结论阻抑SDF1表达在一定程度上抑制与骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞的增殖活性,并促进其凋亡。     

两种巢式PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓移植后微小残留病的比较

目的　比较 2种巢式聚合酶链反应 (PCR)检测骨髓移植后慢性粒细胞白血病 (CML)患者微小残留病。方法　分别用一步法逆转录 PCR(RT PCR)和两步法RT PCR 2种巢式PCR检测骨髓移植后CML患者BCR ABL融合基因 ,并做 2种方法的灵敏度实验。结果　 2种巢式PCR灵敏度实验中 ,一步法RT PCR和两步法RT PCR的巢式PCR可分别检测出 0 .1和 1pgK5 6 2细胞总RNA中的BCR ABL融合基因 ;同时对 19份来自 12例骨髓移植后CML患者标本检测 ,一步法RT PCR的巢式PCR检测出阳性的最长移植时间为 6 90d ;两步法RT PCR的巢式PCR为 4 15d。结论　一步法RT PCR的巢式PCR检测骨髓移植后CML微小残留病具有较高灵敏度 ,操作简便快速 ,特别适用于临床检测。     

鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化肝干细胞的研究

目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow stromal cells,rBMSCs)定向分化为肝干细胞的可行性。方法:采用全骨髓培养法体外培养rBMSCs,设实验组及对照组,应用肝细胞生长因子(HGF)诱导分化,采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化检测CK18、CK19及波形蛋白Vimentin;ELASA等方法检测甲胎蛋白,白蛋白及碱性磷酸酶。结果:rBMSCs经体外培养诱导后呈多角形、卵圆形改变,白蛋白,AFP,CK18、CK19表达阳性,碱性磷酸酶出现明显改变。结论:rBMSCs体外经HGF诱导下,具有向肝干细胞分化的能力,可成为肝组织工程主要种子细胞来源。     

定向诱导的骨髓基质细胞移植后在大鼠缺血脑组织中的分布

目的探讨人骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，MSCs）源神经细胞体内移植后的分布状况。方法采用密度梯度离心结合贴壁分离法分离、纯化人MSCs。MSCs经bFGF预诱导24h及阿魏酸钠（Sodium Ferulate）诱导24h后用于移植。采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注动物模型．缺血2h后行再灌注，24h后经栓塞侧颈内动脉注入诱导后的MSCs（5×10^6/0．8ml）（n=61。2w后取脑组织行冰冻切片．通过检测人细胞核特异抗体MAB1281来鉴定移植的人MSCs。结果MSCs经阿魏酸钠诱导后．细胞逐渐圆缩并伸出突触．呈现神经细胞样形态。在移植大鼠脑内可检测到MAB1281呈阳性表达的人MSCs．且MSCs主要分布在缺血侧损伤灶的周围，明显高于对侧同部位及其它脑区。结论人MSCs源神经细胞移植后在大鼠脑内存活并主要聚集在脑内缺血灶的周围。     

骨髓基质细胞诱导为神经原及胶质细胞

目的:发现一种新的方法代替雪旺细胞用来修复周围神经缺损。方法:从大鼠抽取骨髓在体外诱导为胶质细胞并做免疫组化。结果:骨髓基质细胞在体外培养数代,显示出极强的扩增能力,并在条件培养液的作用下分化为神经原及神经胶质细胞。结论:经论证,本实验在治疗中枢及外周神经疾病方面有重要意义。     

大鼠骨髓基质干细胞诱导分化神经细胞的实验研究

目的探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性，为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法无菌取成熟大鼠长骨骨髓，密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞，在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞，通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定。结果骨髓基质细胞能在神经干细胞条件培养基中增殖、分化，表达巢蛋白抗体抗原，在适宜诱导分化因子及条件下进一步分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有神经细胞特异性核蛋白抗体抗原表达阳性。结论在适宜培养条件及诱导因子联合作用下，骨髓基质细胞可成功诱导出神经元样细胞。     

骨髓间质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的：应用转化型生长因子TGF-β1，体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）向成软骨细胞表型分化，探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法：由大鼠骨髓中分离出MSCs，体外传代培养，取第3代细胞通过TGF-β1、地塞米松和维生素C诱导向软骨细胞分化。诱导后14d观察细胞形态变化，进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达。采用Western-blot和RT-PCR检测诱导前后成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果：诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中，免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。RT-PCR检测示成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型腔原mRNA表达阳性。Western-blot印迹检测示细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论：MSCs在特定培养液的诱导下可向软骨细胞表型分化．并能分泌软骨细胞特异性基质．可成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。     

腺病毒介导的BMP-2基因转染骨髓基质干细胞及种植异种骨支架的体外观察

目的　用人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad BMP 2 )转染的兔骨髓基质干细胞 (BMSC) ,种植BCB(去抗原牛松质骨 )支架体外构建组织工程骨。方法　蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,ALP活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果　转染后 ,BMSC表达BMP 2 ,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论　Ad BMP 2可高效转染BM SC ,且促进细胞分化。转染后细胞在BCB上生长良好 ,BMP 2基因治疗的组织工程骨构建成功     

原代白血病骨髓基质细胞对Jurkat细胞CRIF1基因表达的影响

目的研究与原代白血病骨髓基质细胞共培养后。白血病细胞的CRIF1基因表达情况。方法:1)采用Percoll体外分离正常、初治白血病患者骨髓单个核细胞,贴壁培养骨髓基质细胞;2)应用RT-PCR技术检测白血病骨髓基质细胞屏蔽的Jurkat细胞CRIF1 mRNA表达的改变。结果发现Jurkat细胞CRIF1 mRNA有一定量的基础表达,白血病骨髓基质细胞屏蔽的Jurkat细胞CRIF1 mRNA的表达与对照组相比明显上调。结论CRIF1高表达可能与白血病骨髓基质细胞抑制白血病细胞增殖有关。     

改良法培养骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的:研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和在诱导条件下的成骨能力。方法:通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测骨钙素的分泌、碱性磷酸酶的活性和细胞矿化作用。结果:原代培养基质干细胞首先形成细胞集落,12d时集落间接近融合;传代细胞体积变大,约5～7d传代一次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论:骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,成骨能力肯定,可作为骨组织工程的种子细胞