大黄素抑制HBSS诱导的肾小管上皮细胞自噬的分子机制

目的:探讨大黄素(emodin)对饥饿诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)自噬的调节作用及其可能机制。方法:首先,用Western blot检测大黄素对Hank's平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution,HBSS)饥饿诱导的细胞自噬标志性蛋白——哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅰ/Ⅱ表达水平的影响;其次,用红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(redfluorescent protein-microtubule associated protein light chain3,RFP-LC3)质粒瞬时转染NRK-52E细胞,以HBSS(1 mL)联合巴弗洛霉素A1(10 nmol·L^-1)处理,予大黄素(10 μmol·L^-1)干预后,荧光显微镜下观察RFP-LC3荧光颗粒的变化;然后,以哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂雷帕霉素(100 nmol·L^-1)干预,观察阻断mTOR信号通路对大黄素抑制细胞自噬作用的影响;最后,通过诱导内源性mTOR抑制蛋白DEPTOR(DEP domain-containing mTOR-interacting protein)过表达,进一步评估mTOR信号通路对大黄素抑制细胞自噬的影响。结果:HBSS饥饿可诱导NRK-52E细胞LC3Ⅱ蛋白高表达,大黄素干预后可逆转HBSS诱导的LC3Ⅱ蛋白表达增加;HBSS联合巴弗洛霉素A1处理后可引起RFP-LC3荧光颗粒数目增多,大黄素干预后可抑制其数目的增加;雷帕霉素与大黄素、HBSS联合干预后,雷帕霉素可以恢复HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3Ⅱ蛋白表达水平;而过表达内源性mTOR抑制蛋白DEPTOR同样可以阻断大黄素对LC3Ⅱ蛋白表达的抑制作用。结论:大黄素可以抑制HBSS诱导的肾小管上皮细胞LC3Ⅱ蛋白表达和自噬活化,其阻断自噬的作用可能是通过mTOR信号通路介导的。     

大黄酸调控mTOR信号通路活性抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白表达的分子机制

目的:探讨大黄酸抑制饥饿诱导的肾小管上皮(NRK-52E)细胞自噬蛋白的作用和分子机制。方法:用Hank’s平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)诱导NRK-52E细胞产生饥饿状态,在干预后的各时间点(0,0.5,1,2,6 h),首先,检测细胞自噬标志性蛋白——哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)I/II的表达水平;其次,检测细胞哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)表达及其磷酸化水平(phosphorylated-m TOR Ser2448,p-m TOR S2448);然后,以大黄酸(5 mg·L-1)、HBSS(1 m L)以及m TOR抑制剂雷帕霉素(100 nmol·L-1)单独或联合干预,分别检测其LC3 I/II,m TOR,p-m TOR S2448蛋白表达水平的变化。结果:HBSS诱导NRK-52E细胞LC3II蛋白高表达、p-m TOR S2448蛋白低表达;大黄酸与HBSS联合干预可以逆转HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 II和p-m TOR S2448蛋白表达水平;雷帕霉素与大黄酸、HBSS联合干预可以恢复HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 II蛋白表达水平。结论:HBSS抑制m TOR信号通路活性而诱导肾小管上皮细胞发生自噬;大黄酸调控m TOR信号通路活性而抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白的表达,这可能就是其干预细胞自噬的作用和分子机制。     

犀角地黄汤对脑缺血大鼠自噬相关蛋白表达的相关研究

目的探讨犀角地黄汤对内毒素诱导下持续性大脑中动脉栓塞模型(pMCAO)大鼠脑组织的自噬相关LC3-II蛋白的表达;以及透射电镜下观察双层膜的自噬体。方法造模后进行分组,并采用不同剂量犀角地黄汤进行干预,分别在透射电镜下观察自噬体;检测自噬体膜标志性蛋白质LC3-II的表达。结果模型组有明显的空泡现象出现,中等剂量的犀角地黄汤治疗组有明显空泡现象。造模后第3天和第6天,LC3-II蛋白表达增强,LC3-II/LC3-l比值增加(P0.05)。结论细胞质LC3-I脂质化形成LC3-Ⅱ。中高剂量组明显降低LC3-II蛋白含量,中剂量组效果更佳,能更好地抑制自噬相关蛋白的表达。     

姜黄素联合雷帕霉素诱导去势难治性前列腺癌Pten-CaP8细胞自噬及凋亡研究

目的探讨姜黄素联合雷帕霉素对去势难治性前列腺癌(CRPC)Pten-CaP8细胞增殖、自噬及凋亡的影响。方法将不同浓度的姜黄素单独或与雷帕霉素共同处理Pten-CaP8细胞24 h后,MTT法检测细胞增殖,光镜下观察细胞形态,Westernblotting法检测相关蛋白表达。结果姜黄素联合雷帕霉素可显著抑制Pten-CaP8细胞增殖(P<0.05),上调LC3-II/LC3-I表达,诱导PARP裂解,还可下调p-AKT(S473)、p-S6(S240/244)、AR(N-20)和Cyclin D1蛋白表达水平,使Pten-CaP8细胞形态变短且胞浆内出现空泡改变。结论姜黄素联合雷帕霉素可共同诱导Pten-CaP8细胞自噬及凋亡且效果显著,两者协同抗癌机制与其拮抗PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。     

虫草菌丝抑制自噬相关AMPK/ULK1信号活性改善肾小管上皮细胞衰老的分子机制

为了探讨虫草菌丝(mycelium of Cordyceps sinensis,MCs)改善D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导的肾小管上皮细胞衰老的作用和分子机制,将体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为正常组(normal group,N),模型组(D-gal model group,D),低剂量MCs组(low dose of MCs,L-MCs),中剂量MCs组(medium dose of MCs,M-MCs),高剂量MCs组(high dose of MCs,H-MCs),分别进行不同的干预。具体而言,N组加入1%胎牛血清(fetal bovine ser-um,FBS)1 m L;D组加入100 mmol·L~(-1)D-gal;L-MCs组加入100 mmol·L~(-1)D-gal+20 mg·L~(-1)MCs;M-MCs组加入100 mmol·L~(-1)D-gal+40 mg·L~(-1)MCs;H-MCs组加入100mmol·L~(-1)D-gal+80 mg·L~(-1)MCs。在干预后的24或48 h,首先,观察D-gal对NRK-52E细胞klotho,P27,P16蛋白表达水平,β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色以及腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/不协调的51类激酶1(uncoordinated 51-like kinase 1,ULK1)信号活性的影响;其次,观察MCs对NRK-52E细胞增殖活性的影响;最后,观察MCs对D-gal诱导的NRK-52E细胞klotho,P27,P16蛋白表达水平,SA-β-gal染色以及哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和AMPK/ULK1信号活性的影响。结果表明,对于NRK-52E细胞,D-gal能引起衰老,并诱导磷酸化AMPK(phosphorylated-AMPK,p-AMPK)和磷酸化ULK1(phosphorylated-ULK1,p-ULK1)蛋白高表达,激活AMPK/ULK1信号通路;中、高剂量MCs与D-gal联合干预能明显改善klotho,P27,P16蛋白表达水平和SA-β-gal染色程度,具有抗细胞衰老的作用;此外,中、高剂量MCs与D-gal联合干预能明显改善LC3,p-AMPK,p-ULK1蛋白表达水平,抑制AMPK/ULK1信号活性,提高自噬水平。总之,对于D-gal诱导的肾小管上皮细胞衰老模型,MCs在体外有抗衰老的作用,并且,通过抑制自噬相关AMPK/ULK1信号活性而干预其衰老进程。这可能是MCs抗肾小管上皮细胞衰老的新的分子机制。     

顺铂诱导肺癌A549细胞保护性自噬及肺岩宁对自噬蛋白Atg5、Atg7的影响

目的观察顺铂作用肺癌A549细胞后自噬的发生,及肺岩宁对自噬相关蛋白Atg5、Atg7的影响。方法顺铂和肺岩宁处理肺癌A549细胞,CCK-8筛选顺铂和肺岩宁的优化给药浓度,CCK-8检测各组A549细胞增殖能力,Western blot检测各组自噬蛋白表达。结果与单药顺铂相比,3 mg/L的顺铂联合20 mmol/L的自噬抑制剂氯喹明显提高了A549细胞增殖的抑制率(P0.05)。同时,顺铂导致了微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3Ⅱ)蛋白表达增加(P0.01)。肺岩宁干预A549细胞后,自噬蛋白Atg5蛋白表达低于模型组和顺铂组(P0.05),Atg7蛋白表达显著低于模型组和顺铂组(P0.01)。结论顺铂诱导了A549细胞产生保护性自噬,肺岩宁可能通过抑制肺癌细胞自噬来发挥抗肺癌细胞增殖作用。     

新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体自噬的机制研究

目的探讨新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体自噬的机制。方法 MTT试验检测新藤黄酸对黑色素瘤B16细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜观察黑色素瘤B16细胞在新藤黄酸作用下产生的形态变化;透射电镜观察新藤黄酸对黑色素瘤B16细胞线粒体超微结构的影响;流式细胞术检测新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位及ROS的改变;Western blot法检测LC-3、m TOR、AMPK及SIRT3等自噬相关蛋白的变化。结果 MTT结果显示新藤黄酸在体外对黑色素瘤B16细胞的生长及增殖有明显抑制作用,且随着新藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长,细胞活力明显下降;倒置显微镜观察黑色素瘤B16细胞显示随着新藤黄酸浓度增加,细胞结构被明显破坏,细胞死亡增多;透射电镜观察发现新藤黄酸作用黑色素瘤B16细胞后,细胞发生明显的线粒体自噬的形态学变化;Western blot法检测表明随着新藤黄酸给药时间的延长,AMPK、SIRT3及LC3-Ⅱ蛋白表达量呈时间依赖性上升,LC3-I蛋白表达量呈时间依赖性下降,m TOR蛋白表达量随着时间延长有所下降。结论新藤黄酸在一定时间和浓度范围内能够抑制黑色素瘤B16细胞的增殖,诱导细胞发生线粒体自噬,其诱导细胞线粒体自噬的机制可能与调控ROS/SIRT3/AMPK信号通路有关。     

自噬对双去甲氧基姜黄素诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用的影响

目的:探讨自噬对双去甲氧基姜黄素诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用的影响。方法:以24 mg·L~(-1)双去甲氧基姜黄素或联合5 mol·L~(-1)自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对HepG2细胞作用24,48 h,以四甲基偶氮唑盐(methye thiazolye telrazlium,MTT)比色法检测细胞活力;以24 mg·L~(-1)双去甲氧基姜黄素单用或联合3-MA对HepG2细胞作用48 h,Hoechst 33342染色倒置荧光显微镜观察细胞凋亡形态,磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annxin V/propidium iodide,PI)双染检测细胞凋亡率,罗丹明123(Rhodamine 123,Rh123)染色检测线粒体膜电位,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白Beclin-1,LC3,半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)的活性表达。结果:与空白组比较,双去甲氧基姜黄素可抑制HepG2细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低线粒体膜电位,使pro-Caspase-3,Bcl-2,LC3-Ⅰ蛋白表达降低(P0.01),升高cleaved Caspase-3,Bax,Beclin-1,LC3-Ⅱ蛋白的表达(P0.01);3-MA可增强双去甲氧基姜黄素所诱导的HepG2细胞凋亡,提高凋亡率(P0.01),增加其降低线粒体膜电位作用(P0.01),明显下调pro-Caspase-3,Bcl-2蛋白的表达(P0.01),并上调Beclin-1,LC3,cleaved Caspase-3蛋白的表达(P0.01)。结论:双去甲氧基姜黄素可经线粒体机制诱导HepG2细胞凋亡,并诱导细胞自噬,自噬对凋亡有抑制作用。     

迷迭香酸抑制自噬诱导HepG2细胞凋亡的作用研究

目的:观察迷迭香酸(RA)对HepG2细胞凋亡和自噬的作用,探讨自噬与凋亡之间的相互作用。方法:用不同浓度迷迭香酸作用于HepG2细胞24h、48h、72h。MTT法检测细胞存活率,观察迷迭香酸对HepG2细胞核形态的影响,流式细胞术检测细胞凋亡变化,台盼蓝染色法观察细胞自噬泡情况,透射电镜观察HepG2细胞的自噬变化,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Bcl-2和自噬相关蛋白(LC3)、p62的表达水平。采用迷迭香酸+3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬抑制剂)或迷迭香酸+雷帕霉素(RAP,自噬诱导剂)分别培养处理HepG2细胞,观察细胞增殖、细胞凋亡情况及相关蛋白表达变化。结果:与对照组相比,迷迭香酸(6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L)均能降低HepG2细胞的存活率,诱导HepG2细胞发生凋亡,具有量效和时效关系,减少细胞内自噬泡和自噬小体,降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值,减少Bcl-2的表达,增加Cleaved Caspase-3、p62蛋白的表达。与迷迭香酸25μmol/L处理组相比,迷迭香酸25μmol/L+3-MA 1.0μM/mL应用可诱导HepG2细胞凋亡增加,可进一步减少细胞内自噬泡和自噬小体数目,降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,进一步抑制HepG2细胞的自噬水平,减少Bcl-2的表达,增加Cleaved Caspase-3和p62表达;迷迭香酸25μmol/L+RAP 1.0μM/mL处理HepG2细胞,增加细胞内自噬泡和自噬小体数目,升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,可以抑制和逆转迷迭香酸诱导的细胞自噬水平下降,增加Bcl-2的表达,减少Cleaved Caspase-3和p62表达,细胞凋亡水平下降,这说明抑制或增强自噬时,迷迭香酸能改变对HepG2细胞的凋亡影响作用。结论:迷迭香酸可通过抑制自噬促进HepG2细胞的凋亡。     

葛根素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及其分子机制研究

[目的] 探索葛根素（Puerarin）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及其可能的分子机制。[方法] 以二甲基亚砜（DMSO，空白组）、葛根素（50、100、200 μg/mL）、顺铂20 μg/mL分别干预对数生长期人肝癌HepG2细胞。48 h后，CCK-8法检测细胞增殖抑制率，Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平，吖啶橙染色法观察细胞自噬状况，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、激活型半胱氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、酵母ATG6同源物（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白表达。[结果] 与空白组比较，葛根素100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组HepG2细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高（P<0.01），自噬溶酶体数量明显增多（P<0.01），p-Akt、p-mTOR、bcl-2表达明显下调而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-I、LC3-Ⅱ表达明显上调（P<0.05或P<0.01），Akt磷酸化（p-Akt/Akt比值）降低且Bax/bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P<0.01）。与顺铂20 μg/mL组比较，葛根素200 μg/mL组细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高（P<0.05或P<0.01），自噬溶酶体数量明显增多（P<0.05），p-Akt、p-mTOR表达下调而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅱ明显上调（P<0.05或P<0.01），Akt磷酸化降低且Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-I比值升高（P<0.01）。[结论] 葛根素具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬的作用，该作用具有一定的剂量依赖性；抑制Akt/mTOR/Beclin1通路进而诱导促凋亡、促自噬相关蛋白表达和活化可能是其重要的分子机制。     

迷迭香酸通过AMPK/mTOR通路减轻新生大鼠缺血缺氧性脑损伤研究

目的 探讨迷迭香酸对新生大鼠缺血缺氧脑损伤（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）的影响,及其对单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路的调控作用,初步探讨其脑保护机制。方法 取7 d龄SD新生大鼠,随机分为对照组、模型组、迷迭香酸（300 mg/kg）组、AMPK/mTOR激动剂MT6378（10 mg/kg）组、AMPK抑制剂GSK-690693（30 mg/kg）组和迷迭香酸（300 mg/kg）+MT6378（10 mg/kg）组,每组20只。建立HIE模型,给予相应药物进行干预,采用TTC染色法检测大鼠脑梗死情况;透射电镜（TEM）观察大鼠海马神经元结构损伤及自噬状况;免疫荧光法检测大鼠海马神经元自噬标记物微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B）阳性表达;TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡率;免疫组化法检测大鼠海马神经元磷酸化AMPK（p-AMPK）阳性表达;Western blotting检测大鼠海马组织活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、mTOR及其磷酸化蛋白（p-mTOR）、Unc-51样自噬激活激酶1（uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1,Ulk1）及其磷酸化蛋白（p-Ulk1）、LC3B表达。结果 与对照组相比,模型组大鼠脑梗死严重,海马神经元结构损伤及自噬空泡形成较多,细胞自噬及凋亡水平升高,AMPK/mTOR通路活化（P<0.05）。与模型组相比,迷迭香酸组及GSK-690693组大鼠脑梗死、海马神经元结构损伤、凋亡及自噬减弱,AMPK/mTOR通路被抑制（P<0.05）;MT6378组海马组织AMPK/mTOR通路进一步激活,大鼠脑梗死、海马神经元结构损伤、凋亡及自噬进一步加重（P<0.05）;MT6378可逆转迷迭香酸的上述作用（P<0.05）。结论 迷迭香酸可能通过抑制AMPK/mTOR通路激活,降低海马神经元自噬及凋亡进程,发挥抗HIE脑损伤作用。     

Ginkgo biloba extract protects against diabetic cardiomyopathy by restoring autophagy via adenosine monophosphate-activated protein kinase/mammalian target of the rapamycin pathway modulation

Studies demonstrated that Ginkgo biloba extract (GBE) played a cardioprotective role in diabetic conditions. Impaired autophagy is one of the mechanisms underlying diabetic cardiomyopathy (DCM). The effect of GBE on autophagy has been observed in several diseases; however, whether GBE can ameliorate DCM by regulating autophagy remains unclear. Here, we investigated the effect of GBE on DCM and the potential mechanisms regarding autophagy using a streptozotocin (STZ)-induced diabetic rat model and a high-glucose (HG)-stimulated H9C2 cell model. We demonstrated that GBE attenuated metabolic disturbances, improved cardiac function, and reduced myocardial pathological changes in diabetic rats. Impaired autophagy as well as dysregulation of the adenosine monophosphate-activated protein kinase/ mammalian target of the rapamycin (AMPK/mTOR) signaling pathway were observed in diabetic hearts, as evidenced by the reduced conversion of LC3B-I to LC3B-II along with excessive p62 accumulation, decreased AMPK phosphorylation, and increased mTOR phosphorylation, which could be reversed by GBE treatment. In vitro, GBE reduced the apoptosis induced by HG in H9C2 cells by activating AMPK and inhibiting mTOR to restore autophagy. However, this effect was inhibited by the AMPK inhibitor Compound C. In conclusion, the ameliorative effect of GBE on DCM might be dependent on the restoration of autophagy through modulation of the AMPK/mTOR pathway.     

基于mTOR信号通路探讨中医药干预冠心病研究进展

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路具有调控细胞生长、自噬、增殖和凋亡等生物学功能,在肿瘤、心脑血管疾病中发挥着重要作用。近年来mTOR信号通路的磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/mTOR和蛋白激酶B(Akt)/mTOR通路日益受到重视。基于2条通路与冠心病关系及中医药的干预作用进行综述。     

活血消瘿方含药血清调控AMPK/mTOR通路对脂多糖诱导的甲状腺滤泡上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨活血消瘿方含药血清对脂多糖(LPS)诱导的甲状腺滤泡上皮细胞(TFECs)自噬和凋亡的影响以及作用机制。方法 光学显微镜观察分离培养的SD大鼠TFECs细胞的形态;免疫荧光染色鉴定TFECs中特异抗原甲状腺球蛋白(Tg)。取对数生长期的TFECs,分为对照组、LPS组、含药血清组、含药血清+compound C(AMPK抑制剂)组、含药血清+MHY1485(mTOR激活剂)组,MTT法检测各组细胞活力;绿色荧光蛋白(GFP)标记质粒转染检测各组细胞自噬小体变化;流式细胞术检测各组细胞凋亡;western blot检测各组细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)I、LC3II、Beclin1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达。结果 光学显微镜观察显示,TFECs形态为梭形、形态均一,且可成簇生长。免疫荧光结果显示,TFECs细胞质中可见较强的Tg荧光染色。与对照组比较,LPS组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著降低,炎性因子IL-6 、TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著升高(P< 0.05);与LPS组比较,含药血清组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著升高,炎性因子IL-6 、 TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著降低(P< 0.05);与含药血清组比较,含药血清+compound C组、含药血清+MHY1485组TFECs中相应指标与上述趋势相反。结论 活血消瘿方含药血清对LPS诱导的TFECs自噬的促进作用及细胞凋亡的抑制作用可能与激活AMPK/mTOR通路有关。     

电针通过调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对衰老小鼠肝脏自噬与氧化应激的影响

目的:观察电针对衰老小鼠体力及肝脏AMP活化的蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、Atg5、Atg7、Atg13和Beclin1表达的影响,探索其通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路延缓衰老的机制.方法:将30周龄雄性SAMP8小鼠随机分为模型组、雷帕...     

当归多糖对糖尿病肾病KK-Ay小鼠肾脏AMPK信号通路及线粒体自噬的影响

目的 研究当归多糖对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）KK-Ay小鼠肾脏磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase,AMPK）信号通路及线粒体自噬的影响。方法 SPF级雄性KK-Ay小鼠用高糖高脂饲料喂养,随机分为模型组、厄贝沙坦（25 mg/kg）组和当归多糖高、中、低剂量（400、200、100 mg/kg）组,每组10只;将10只雄性C57BL/6J小鼠作为对照组。给予药物干预4周,观察小鼠一般情况,每周称定体质量并检测血糖;末次给药后,心脏取血并处死小鼠,分离血清检测尿微量白蛋白（urine microalbuminuria,U-ALB）、肌酐（creatinine,SCr）、尿素氮（urea nitrogen,BUN）;采用苏木素-伊红（HE）染色观察肾组织病理变化;采用Western blotting检测肾组织线粒体自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62、Nix]和线粒体裂变蛋白[线粒体动力相关蛋白1(dy...     

Tanshinone IIA Induces Autophagic Cell Death via Activation of AMPK and ERK and Inhibition of mTOR and p70 S6K in KBM‐5 Leukemia Cells

Although tanshinone IIA (Tan IIA) from Salviae miltiorrhizae was known to induce apoptosis in various cancers, its underlying mechanism of autophagic cell death was not reported yet. Thus, in the present study, the molecular mechanism of autophagic cell death by Tan IIA was investigated in KBM‐5 leukemia cells. Tan IIA significantly increased the expression of microtubule‐associated protein light chain 3 (LC3) II as a hallmark of autophagy in western blotting and immunofluorescence staining. Tan IIA augmented the phosphorylation of adenosine monophosphate‐activated protein kinase (AMPK) and attenuated the phosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR) and p70 S6K in a dose‐dependent manner. Conversely, autophagy inhibitor 3‐methyladenine partly reversed the cytotoxicity and the phosphorylation of AMPK, mTOR and p70 S6K induced by Tan IIA in KBM‐5 leukemia cells. In addition, Tan IIA dramatically activated the extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathway including Raf, ERK and p90 RSK in a dose‐dependent and time‐dependent manner. Consistently, ERK inhibitor PD184352 suppressed LC3‐II activation induced by Tan IIA, whereas PD184352 and PD98059 did not affect poly (ADP‐ribose) polymerase cleavage and sub‐G1 accumulation induced by Tan IIA in KBM‐5 leukemia cells. Furthermore, Tan IIA could induce autophagy via LC3‐II activation in various cancer cells such as prostate (PC‐3), multiple myeloma (U266), lung (NCI‐H460), and breast (MDA‐MB‐231) cells. Overall, these findings suggest that Tan IIA induces autophagic cell death via activation of AMPK and ERK and inhibition of mTOR and p70 S6K in KBM‐5 cells as a potent natural compound for leukemia treatment. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.     

丹参酮Ⅱa通过AMPK/mTOR通路调节自噬促进急性白血病细胞凋亡作用机制研究

目的观察丹参酮Ⅱa对HL-60的凋亡与自噬以及相关因子水平的影响,探讨丹参酮Ⅱa抗急性髓系白血病的分子机制。方法使用不同浓度的丹参酮Ⅱa处理HL-60细胞24、48 h后用CCK-8法检测增殖抑制率,吉姆萨染色观察细胞形态,Western blotting检测Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP-1、p-AMPK、pmTOR、LC3B水平变化,联用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1以CCK-8测细胞存活率。结果以0、1、2、4、8、16、32、64、128μmol/L丹参酮Ⅱa处理HL-60细胞24、48 h后HL-60增殖被抑制,其作用随浓度增加和时间延长而加强,24、48 h的IC₅₀分别为32.87、18.4μmol/L;吉姆萨染色镜下观察见,随着药物浓度增加HL-60凋亡增加;Western blotting显示Caspase-3减少、Cleaved-Caspase-3增加,PARP-1切割增加,凋亡增强;p-AMPK增加、pmTOR减少、LC3B增加,显示AMPK/mTOR自噬通路激活,联用巴弗洛霉素A1后丹参酮Ⅱa增殖抑制作用减弱。结论丹参酮Ⅱa通过诱导HL-60凋亡和自噬发挥抗白血病作用,AMPK/mTOR可能是介导这一效应的重要信号通路。     

背俞指针疗法对GERD大鼠食管下端组织的ICC内质网AMPK/mTOR自噬通路的影响

目的研究背俞指针疗法对胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)大鼠食管下端组织的ICC内质网中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA及蛋白表达的影响,探讨背俞指针疗法的效应机制。方法将76只大鼠随机分为空白组、空白指针组、模型组、指针组。采用贲门钢圈固定法制作GERD动物模型,指针组予背俞指针疗法干预,疗程均为2周。干预结束后,切取大鼠食道下段组织制作标本。采用Western Blot检测食管下端组织ICC内质网中的AMPK和mTOR蛋白表达情况;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测食管下端组织ICC内质网的AMPK mRNA、mTOR mRNA水平。结果Western Blot检测结果表明:模型组AMPK蛋白表达低于空白组,指针组AMPK蛋白表达显著高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05);空白指针组AMPK蛋白表达与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05);mTOR蛋白表达情况组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测结果表明,mTOR mRNA及AMPK mRNA水平组间比较均无统计学差异(P>0.05)。结论GERD的发病机制可能与食管下段组织ICC AMPK蛋白水平下调有关,与AMPK/mTOR自噬信号通路可能不相关。背俞指针疗法治疗GERD的起效机制可能通过提高ICC细胞AMPK蛋白表达而实现。