大鼠β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞的体外分选及鉴定

目的尝试从骨髓干细胞(BMSC)中分选出具备干细胞和肝细胞双重特性的β2m-/Thy-1 骨髓源性肝干细胞(BDLSC)亚群,为细胞移植治疗肝病提供合适的供体细胞。方法利用免疫磁珠细胞分选(MACS)方法体外分选淤胆型大鼠模型的β2m-/Thy-1 BDLSC,流式细胞仪检测其纯度,RT-PCR法和免疫荧光染色法鉴定其肝相关性表型的表达。结果MACS法能成功分选纯化BDLSC,其在基因和蛋白水平均表达肝细胞样表型。结论β2m-/Thy-1 BDLSC是BMSC中较特异的肝干细胞亚群,具有可能益于肝病治疗的巨大潜力。     

大鼠骨髓Thy-1.1+干细胞的分选与表型研究

目的采用免疫磁珠分选系统（MACS）分离大鼠骨髓Thy-1.1^＋干细胞群，研究Thy-1.1^＋干细胞与肝脏分化潜能相关的表型特征。方法收集大鼠胫骨、股骨骨髓细胞．Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，Thy-1．1单抗标记，间接免疫磁珠系统分离纯化Thy-1.1^＋干细胞群，流式细胞仪检测其纯度，锥虫蓝拒染法检测细胞活力，计算回收率。同时流式检测分选前细胞及分选后Thy-1.1^＋干细胞的表型。结果经MACS分选后Thy-1.1^＋细胞比例由56．65％升至94．20％；分选后的细胞活力为99．62％，与分选前的99．79％无明显差异；MACS分选Thy-1.1^＋细胞的回收率为64．65％。Thy-1.1^＋细胞不表达CD34和c-kit；高表达β2微球蛋白（β2M）和CD45；部分表达Flt-3。分选前后CD34^＋和c—kit^＋比例无显著差异；β2M^＋的比例由93．38％下降至86．39％（P〈0．05）；CD45^＋和Fit-3^＋的比例则由67．18％、14．36％升高至分选后的81．12％和58．72％（均P〈0．01）。结论MACS方法能有效分选大鼠骨髓Thy-1.1^＋干细胞群，所得细胞纯度高，细胞活力保持好。大鼠Thy-1．1抗原与CD34、c—kit分子无明显相关性；而与CD45、Fit-3有一定的正相关性；与β2M呈一定的负相关性。     

骨髓衍生肝干细胞亚群Thy-1.2+lin-细胞的免疫磁珠分选

目前治疗肝功能衰竭最常用的方法是肝移植,最有效的治疗手段是原位肝脏移植(orthotopic liver transplantation,OLT).但由于供体匮乏、免疫排斥和高额费用等问题,OLT的运用受到了限制[1-3].骨髓细胞可以分化形成肝细胞的特定干细胞群,被称之位骨髓衍生肝干细胞(bone marrow derived liver stem cells BMDLSC),为肝脏疾病治疗提供了新思路和新手段[4].我们可以利用骨髓获取BMDLSC,体外扩增后进行体内或肝内移植,进而促进受损伤肝功能的恢复.然而骨髓细胞中BMDLSC含量极低,为进一步研究,分离纯化出BMDLSC必不可少.文献报道显示[5-8],Thy1.2即CD90是肝干细胞的一种,在淋巴器官细胞中表达较高,骨髓细胞中也有表达.Lin即系相关性膜标志,Krause等[9]实验证实,纯化的Lin-细胞可分化为肝细胞.本实验运用免疫磁珠(magnetic activated cell sorting MACS系统)法分离纯化BMDLSC中的Thy-1.2 lin-细胞,为进一步体外扩增等后续研究作准备.     

骨髓源性肝干细胞的研究进展

肝干细胞用于肝病治疗的研究日益增多,尤其是骨髓分离骨髓源性肝干细胞.文章就骨髓源性肝干细胞的分离、培养、纯化、诱导分化、检测及肝内移植的可能机制和应用前景进行综述.     

骨髓源性肝干细胞的研究进展

肝干细胞用于肝病治疗的研究日益增多,尤其是骨髓分离骨髓源性肝干细胞。文章就骨髓源性肝干细胞的分离、培养、纯化、诱导分化、检测及肝内移植的可能机制和应用前景进行综述。     

大鼠骨髓源性肝干细胞形态学特征的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓源性肝干细胞的形态特性和来源。方法：HGF体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝样细胞分化,诱导第0、7、14、21天,相差显微镜观察细胞形态特征,电镜观察第21天诱导组与非诱导组细胞超微结构变化;免疫细胞化学法检测甲胎蛋白（AFP）、细胞角质蛋白18（CK18）的表达;PAS检测细胞糖原。结果：HE染色较深的小圆形细胞在非诱导条件下各时相直径未发生明显变化,AFP、CK18、糖原染色均为阴性;诱导组HE染色较深的小圆形细胞与AFP、CK18、糖原染色阳性的细胞形态大小一致,随诱导时间延长其直径增大。透射显微镜观察：第21天诱导组细胞间有大量的微绒毛,细胞内可见到丰富的粗面内质网、线粒体、溶酶体、吞饮泡;第21天非诱导组细胞间仅有少量微绒毛,细胞质较少。结论：骨髓源性肝干细胞很可能来源于集落中HE染色较深的小圆形细胞,在HGF诱导下可以分化为肝样细胞,其形态学及超微结构与肝细胞结构相符合。     

肝损伤大鼠骨髓源性肝干细胞的筛选分化与扩增

目的探讨利用肝损伤早期和淤胆血清培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选、诱导分化和扩增肝干细胞亚群,以快速、高效地获取骨髓源性肝干细胞.方法建立淤胆型肝损伤大鼠模型和制备含5%淤胆血清病理条件培养液,以促进骨髓源性肝干细胞的体内、外筛选和扩增,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养2周时骨髓细胞各种肝干细胞标志表达.结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,细胞表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白.结论淤胆型肝损伤早期大鼠体内环境和含淤胆血清体外病理微环境可能有效地从骨髓细胞中筛选骨髓源性肝干细胞,从而为临床细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞.     

肝损伤大鼠骨髓源性肝干细胞的筛选分化与扩增

目的探讨利用肝损伤早期和淤胆血清培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选、诱导分化和扩增肝干细胞亚群,以快速、高效地获取骨髓源性肝干细胞。方法建立淤胆型肝损伤大鼠模型和制备含5%淤胆血清病理条件培养液,以促进骨髓源性肝干细胞的体内、外筛选和扩增,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养2周时骨髓细胞各种肝干细胞标志表达。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,细胞表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。结论淤胆型肝损伤早期大鼠体内环境和含淤胆血清体外病理微环境可能有效地从骨髓细胞中筛选骨髓源性肝干细胞,从而为临床细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞。     

转基因骨髓源性肝干细胞移植对大鼠肝纤维化的影响

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的影响.方法 采用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清的培养液筛选和扩增BDLSC,使用RT-PCR方法检测培养2周时肝干细胞标志表达.体外将携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染BDLSC并移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,观察大鼠肝功能、胶原面积及病理组织学的变化.结果 病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,并表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白.体内研究显示,与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)及总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低,凝血酶原时间(PT)时间缩短,白蛋白(ALB)水平升高,肝组织细胞外基质(ECM)水平及羟脯氨酸(Hyp)含量明显降低;肝组织结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,胶原面积明显减少.结论 uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,从而为转基因BDLSC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础.     

转基因骨髓源性肝干细胞移植对大鼠肝纤维化的影响

目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的影响。方法采用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清的培养液筛选和扩增BDLSC,使用RT-PCR方法检测培养2周时肝干细胞标志表达。体外将携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染BDLSC并移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,观察大鼠肝功能、胶原面积及病理组织学的变化。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,并表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。体内研究显示,与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)及总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低,凝血酶原时间(PT)时间缩短,白蛋白(ALB)水平升高,肝组织细胞外基质(ECM)水平及羟脯氨酸(Hyp)含量明显降低;肝组织结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,胶原面积明显减少。结论uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,从而为转基因BDLSC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础。     

肝纤维化小鼠骨髓源性肝干细胞动员及确定

目的 建立小鼠四氯化碳性及酒精性肝纤维化模型并初步探讨干细胞动员情况,确定骨髓源性肝干细胞的表面标记.方法 四氯化碳皮下注射和酒精灌胃法使小鼠形成肝纤维化,分别取其骨髓干细胞,采用流式细胞仪检测肝纤雏化模型中不同干细胞标记的细胞群体包括c-kit Lin-,Thy1.2 Lin-,CD34 Lin-,Sca 1 Lin-的数量变化,寻找可能的肝干细胞动员情况.结果 与对照组相比,两组纤维化模型小鼠骨髓内c-kit Lin-细胞显著增高,其他干细胞类型细胞数量变化小.结论 c-kit Lin-细胞的数量在肝纤维化模型小鼠中存在明显动员情况,可能参与肝脏的修复,并成为肝干细胞的标记物.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞,利用 Percoll 法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞,应用肝细胞生长因子(HGF)20ng/ml 表皮生长因子(EGF)1.5μg/ml 联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的 mRNA 的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形,两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物 CK18和白蛋白表达,RT-PCR 检测有白蛋白的 mRNA 的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

骨髓源性肝干细胞的发现、诱导与移植

与原位肝移植（orthotopic liver transplantation,OLT）相比,肝细胞移植（hepatocyte transplantation,HCT）操作简单,费用低廉,风险小,而且来自一个肝脏的细胞可供给多个受体,大大缓解了供肝短缺的矛盾.HCT不仅可以作为原位肝移植手术前的一种过渡疗法,在逆转急性肝功能衰竭及治疗代谢缺陷性肝病等方面也显示了巨大的潜力.     

骨髓源性肝干细胞研究进展

近年来,全球掀起了有关干细胞的研究热潮,而肝干细胞是引人注目的内容之一。肝干细胞的起源可能是多源性的。肝内干细胞有卵圆细胞、小肝细胞,肝外来源可以是胰腺的上皮细胞、胰岛前体细胞、胚胎干细胞,另一个重要来源是骨髓细胞。本文对骨髓源性肝干细胞研究进行综述。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养及初步鉴定

目的探讨并建立一种简便有效的体外分离纯化及扩增大鼠骨髓间质干细胞的方法,并研究其生物学特性,对其进行初步鉴定,为进一步诱导分化为胃黏膜上皮细胞奠定基础。方法利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,传代扩增,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,并用免疫组化方法鉴定骨髓间质干细胞表面CD29,CD44,CD34的表达。将加入成骨、成脂肪诱导剂的骨髓间质干细胞体外培养2～3周,观察细胞形态变化,并做油红0染色,鉴定成骨及成脂肪分化的结果。结果原代培养8—10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3～4d。免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性,且可以将其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用贴壁培养法可分离培养出大量大鼠骨髓间质干细胞,且此方法简便易行。     

人骨髓源性肝干细胞体外扩增方案的探讨

目的探讨体外扩增骨髓源性肝干细胞的可行方案。方法采用密度梯度离心分离法从新鲜骨髓中获取富含CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的组分,然后将细胞在体外培养扩增0、7d、14d,扩增方案采用含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中和无血清的高糖DMEM培养基体系中加入不同浓度的促肝细胞生长素(HGPF)、促血小板生长素(TPO)和白细胞介素3(IL-3),最后用流式细胞计数法测定扩增细胞中CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的数量变化。结果含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中加入HGPF40μg/ml、TPO50ng/ml、IL-310ng/ml组的扩增效果最好,扩增7d的CD117阳性细胞数量和CD184阳性细胞数量分别增加6.55倍和6.20倍,扩增14d的CD117阳性细胞数量和CD184阳性细胞数量分别增加11.62倍和20.57倍。结论含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中加入HGPF40μg/ml、TPO50ng/ml、IL-310ng/ml是体外扩增骨髓源性肝干细胞的可行方案。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

骨髓造血干细胞横向分化肝干细胞的可塑性

干细胞作为细胞生物学的一个基本概念已有近100年的历史,但其研究并没有失去新颖和创新的光环.20世纪90年代末,干细胞自我更新、组织重建的传统概念受到了严重挑战,传统认为成体组织或器官内的干细胞具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织.但新的研究表明成体细胞(ma-ture cells)具有强大的分化可塑性,组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能.     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物,并进行成脂、成骨分化诱导。结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长。生长曲线呈S形,细胞周期显示86.02%P3代细胞为G0/G1期,保持活跃的扩增能力。BMSCs高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。成脂诱导21 d后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。