兔口腔黏膜细胞与灭活的3T3成纤维细胞的体外共培养

目的探讨口腔黏膜细胞的培养方法,为进一步以口腔黏膜细胞为种子细胞构建组织工程化尿道提供实验依据。方法体外分离口腔黏膜细胞,取部分细胞与经丝裂霉素灭活的3T3成纤维细胞进行共培养(共培养组),定期观察细胞形态变化及生长增殖情况。以非共培养的口腔黏膜细胞作为对照(非共培养组)。同时,对体外培养获得的口腔黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体(AE1/AE3)和K19免疫荧光染色鉴定;流式细胞仪检测第2代共培养组细胞的AE1/AE3阳性细胞百分比。结果共培养组口腔黏膜细胞,呈现典型的"铺路石"状,细胞形态均一,可传代至7~8代。非共培养组口腔黏膜细胞则形态多样,传至第2代时,即开始出现老化,细胞贴壁及增殖能力均明显减弱。免疫荧光染色显示,体外培养获得的口腔黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性,40%细胞K19染色阳性。流式细胞仪检测结果表明,第2代共培养组口腔黏膜细胞AE1/AE3阳性细胞百分比>95%。结论口腔黏膜细胞在有灭活的3T3成纤维细胞存在时可成功培养和扩增,为进一步将其作为种子细胞构建组织工程化尿道奠定了良好的基础。     

富集兔毛囊干细胞构建组织工程化尿道的研究

目的 富集兔毛囊干细胞构建组织工程化尿道,观察其对尿道缺损的修复效果.方法 应用机械分离与酶消化法分离培养兔毛囊细胞,体外原代培养扩增至3×106个,采用流式细胞仪富集毛囊干细胞,分选直径＜ 10 μm的integrin-α6 +/cd71-细胞,免疫荧光法检测细胞K19、p63和β1整合素表达.将毛囊干细胞接种于膀胱脱细胞基质支架材料上,构建组织工程化尿道,扫描电子显微镜观察细胞在支架上的分布状态.利用组织工程化尿道修复2.5 cm的兔尿道缺损,经尿道造影和组织学检查观察缺损修复效果.结果 免疫荧光法检测结果显示毛囊干细胞K19、p63、β1整合素表达阳性.扫描电子显微镜观察发现细胞与支架紧密贴附,细胞伸展适度且有基质分泌.组织学检查和免疫组织化学检测发现,毛囊干细胞形成复层上皮结构,AE1/AE3染色阳性.组织工程化尿道修复缺损后3个月,尿道造影显示尿道平滑通畅.结论 通过调整优化分选参数富集兔毛囊干细胞,构建的组织工程化尿道可用于修复兔尿道缺损.     

施万细胞对共培养的神经干细胞增殖与分化的影响

目的：探讨施万细胞诱导神经干细胞增殖与分化的影响因素。方法：大鼠胚胎神经干细胞单独培养及与新生SD大鼠施万细胞共培养，观察神经干细胞的形态变化，并分别检测特异性标志蛋白S-100、NF和GFAP的表达。结果：相差显微镜下可见共培养组大部分神经干细胞伸出多个细长突起；与单独培养组相比，免疫荧光染色显示共培养组NF表达阳性细胞数多；GFAP表达阳性细胞数少。结论：施万细胞可促进共培养的神经干细胞增殖，并可诱导神经干细胞向神经元方向分化。     

人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层的研究

目的：探讨人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞代替鼠源饲养层细胞在体外培养人口腔黏膜上皮细胞的可行性。方法：通过酶消化法从人眼睑组织中分离成纤维细胞传代培养，取P5代成纤维细胞通过丝裂霉素C方法制备饲养层细胞，将其制备成的饲养层细胞用来培养商品化人口腔黏膜上皮细胞。通过罗丹明染色观察其细胞克隆形成率；HE染色观察细胞片层的结构；免疫荧光检测特征蛋白P63、β1-integrin的表达。结果：人眼睑组织来源的成纤维细胞在体外具有较强的增殖能力，高表达成纤维细胞特异性标志性蛋白CD90，培养的人口腔黏膜上皮细胞呈克隆样生长，细胞克隆形成率约为2.2%，并将其构建成3～4层口腔黏膜细胞片层，且高表达上皮细胞标志物P63及β1-integrin。结论：人眼睑组织来源的成纤维细胞可以作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层，为临床应用提供一种新的人源化饲养层工具细胞。     

组织工程化人口腔黏膜的构建

目的:用组织工程方法培养人全层口腔黏膜.方法:婴儿唇裂多余口腔黏膜组织为取材对象,分离成纤维细胞与上皮细胞,分别接种在聚乳酸羟基乙酸(PLGA)膜上培养,后将其移至气液面进行复合.HE染色、免疫组化AE1/AE3及Vimentin染色,光镜、倒置相差显微镜、扫描电镜观察其形态结构.结果:口腔黏膜具备上皮层和上皮下纤维组织,上皮细胞3～7层,见桥粒连接,AE1/AE3阳性;同有层细胞核形Vimentin( ).结论:成功培养全层人口腔黏膜,PLGA可作为口腔黏膜组织工程支架材料.     

损伤后脑膜成纤维细胞对星形胶质细胞活性及胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的 体外观察损伤后脑膜成纤维细胞对星形胶质细胞活性及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法 体外分别培养SD大鼠大脑皮层的星形胶质细胞和大脑脑膜的成纤维细胞,经GFAP和纤维粘连蛋白(FN)免疫荧光染色鉴定后,将损伤后成纤维细胞来源条件培养基与星形胶质细胞共培养,根据成纤维细胞损伤时间不同分为正常对照组(A组)、损伤4h组(B组)、损伤24 h组(C组)、损伤72 h组(D组),应用CCK8试剂检测星形胶质细胞的活性,通过GFAP免疫荧光染色观察星形胶质细胞GFAP表达.将损伤的成纤维细胞与星形胶质细胞接触共培养72 h,根据与成纤维细胞的距离,将星形胶质细胞分为近(J)组和远(Y)组,通过FN和GFAP双重免疫荧光细胞化学染色观察GFAP表达.结果 B组星形胶质细胞活性低于A、C、D组(P＜0.05);非接触共培养时,C组星形胶质细胞GFAP表达强度显著高于B、D组(P＜0.05);接触共培养时,J组星形胶质细胞的GFAP表达强度显著高于Y组(P＜0.05).结论 损伤后脑膜成纤维细胞能触发星形胶质细胞反应性胶质化.     

骨髓来源血管内皮前体细胞的培养方法

目的: 明确骨髓单核细胞中是否存在血管内皮前体细胞(EPCs),在不同的培养条件下,细胞的增殖、分化是否受影响. 方法: 取SD大鼠股骨,用密度梯度离心法收集骨髓单个核细胞,分为3组,接种在EC基础培养基上:A组,在培养液中添加VEGF, bFGF;B组,与人脐静脉细胞共培养;C组为对照组. 分别在培养的第3, 7, 11和15日时,将细胞进行免疫荧光染色,流式细胞仪检测细胞总数、抗体标记阳性的细胞百分比. 结果: 培养7 d后,细胞逐渐成为梭形,呈现内皮细胞样的表现型,免疫荧光显示,细胞呈现Ⅷ factor relative antigen 及NOS3抗体阳性标记,说明细胞已分化为内皮细胞. 其中B组细胞总数、Ⅷ factor relative antigen 及NOS3的阳性细胞百分比均高于A, C组,有统计学差异(P=0). 结论: 骨髓细胞中存在EPCs,并可在体外分化为血管内皮细胞,与脐静脉内皮细胞共培养可一定程度地弥补生长因子的缺乏,但无法替代添加VEGF和bFGF.     

施万细胞对共培养的神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨施万细胞诱导神经干细胞增殖与分化的影响因素。方法:大鼠胚胎神经干细胞单独培养及与新生SD大鼠施万细胞共培养,观察神经干细胞的形态变化,并分别检测特异性标志蛋白S-100、NF和GFAP的表达。结果:相差显微镜下可见共培养组大部分神经干细胞伸出多个细长突起;与单独培养组相比,免疫荧光染色显示共培养组NF表达阳性细胞数多;GFAP表达阳性细胞数少。结论:施万细胞可促进共培养的神经干细胞增殖,并可诱导神经干细胞向神经元方向分化。     

体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性

目的 探讨体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性,为构建组织工程尿道提供种子细胞.方法 取尿道下裂患者尿道黏膜,经消化离心后,接种于培养基中连续培养,观察细胞形态变化及生长、增殖过程,并绘制生长曲线;对细胞进行常规冻存和复苏;应用免疫细胞化学技术进行角蛋白染色的鉴定.结论 体外培养的细胞呈铺路石样外观,可传至8代;可进行常规冻存和复苏;角蛋白免疫细胞化学染色呈阳性.结论人尿道黏膜上皮细胞的体外连续培养及扩增技术被建立,本实验培养的细胞可用于构建组织工程尿道.     

胎鼠听囊细胞体外培养研究

目的:了解哺乳动物听觉细胞的来源,探索听觉细胞前体细胞体外增殖和分化. 方法:取孕鼠胚胎听囊细胞进行体外培养,用免疫细胞化学方法,分别对培养的细胞进行细胞角蛋白、F-肌动蛋白和calretinin染色观察细胞特征;BrdU染色观察细胞增殖. 结果:培养的细胞在体外进行分化和增殖,细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种. 对细胞角蛋白和F-肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色呈阳性. 在原代培养就出现calretinin染色明显阳性的细胞. 传代后结果仍为阳性着染,但强度减弱. BrdU染色显示培养细胞具有明显的增殖活性. 本研究共传8代,历时4 mo,细胞形态维持稳定. 结论:胎鼠听囊细胞在体外自然培养条件下可以分化或者增殖为未成熟毛细胞. 本研究为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.     

14—3—3蛋白

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族，主要以同源／异源二聚体形式存在，通过磷酸化丝／苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的两个结构域结合。七种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有着密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在MAPK级联放大效应等信号转导途径中发挥调控作用。     

微卡（VACCAE）联合2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗初治涂阳肺结核的临床效果

目的应用微卡(VACCAE)联合常规抗结核药物2H3R3Z3E3/4H3R3治疗初治涂阳肺结核的临床疗效。方法选取100例初始涂阳肺结核患者,随机分为对照组50例和观察组50例,两组均采用"世界银行贷款+中国结核病控制项目"的2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗,观察组在上述常规化疗药基础上联用微卡22.50μg深部肌肉注射;观察两组的痰菌阴转率、病灶吸收率、空洞闭合率、临床症状改善情况、不良反应发生率。结果治疗1个月后,观察组临床症状完全消失率显著高于对照组(P<0.05)。观察组的痰菌转阴率、病灶吸收率、空洞闭合率均优于对照组(P<0.05)。微卡注射后无严重不良反应。结论微卡联合常规抗结核药物2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗初治涂阳肺结核能够快速缓解临床症状,且疗效显著不良反应小,具有临床应用价值。     

Hypoxia-induced MTA1 promotes MC3T3 osteoblast growth but suppresses MC3T3 osteoblast differentiation

Background

Bone fracture is one of the most common physical injuries in which gene expression and the microenvironment are reprogramed to facilitate the recovery process.

Methods

By specific siRNA transfection and MTT assay, we evaluated the effects of metastasis-associated gene 1 (MTA1) in osteoblast growth. To show the role of MTA1 in osteoblast under hypoxia conditions, by overexpressing and silencing MTA1 expression, we performed mineral deposition and alkaline phosphatase activity assay to observe the differentiation status of osteoblast cells. Real-time PCR and Western blot assays were adopted to detect the expression of certain target genes.

Results

Here, we reported that hypoxia-induced MTA1 expression through hypoxia-induced factor 1 alpha (HIF-1α) and stimulated the growth of osteoblast MC3T3 cells. Silencing of MTA1 through specific siRNA suppressed MC3T3 cell growth and elicited cell differentiation and induced alkaline phosphatase activation and the upregulation of bone morphogenetic protein-2 and osteocalcin.

Conclusions

We found that MTA1 was regulated by HIF-1α in hypoxia circumstance to suppress osteoblast differentiation. These findings provide new insights for bone fracture healing and new strategies to develop potential targets to promote fracture healing.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/s40001-015-0084-x) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

EB病毒核抗原3C提高Gemin3基因的表达

  目的 探讨EB病毒核抗原(EBNA)3C对Gemin3基因表达的影响。方法 共转染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293细胞。依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减EBNA3C基因的表达,并经嘌呤霉素筛选获得稳定的EBNA3C低表达细胞系,采用Western blot检测EBNA3C对Gemin3蛋白表达的影响。结果 Gemin3基因的表达随着EBNA3C表达量的增加而增加,呈剂量依赖性,在EBNA3C基因敲减细胞中Gemin3的表达减少。结论EBNA3C可提高Gemin3基因表达水平。     

新生儿脐血血清rT_3及T_3/rT_3值的测定

测定300例新生儿脐血血清T_4、T_3、rT_3及T_3/rT_3值。其平均值±标准差依次为98.65±27.6ug/L,0.49±0.19ug/L,3.06±0.25ug/L;T_3/rT_3值平均为0.16。脐血T_4、rT_3值高于正常成人,而T_3及T_3/rT_3值明显低于正常成人。     

血小板生长因子在NIH3T3成纤维细胞和MT3转化细胞应答中的作用

血小板生长因子(PDGF)通过促进细胞外Ca~(2 )内流,增加细胞内Ca~(2 )浓度,但在亲代NIH3T3成纤维细胞和转化的MT3细胞中,却表现出不同的作用。在亲代NIH3T3成纤维细胞中,PDGF能够抑制舒缓激肤介导的细胞内Ca~(2 )浓度增加,未能见到细胞内Ca~(2 )波动现象;而在转化的MT3细胞中,PDGF丧失了对舒缓激肽介导的细胞内Ca~(2 )浓度增加的抑制作用,常常引起细胞内Ca~(2 )波动现象。对于DNA的合成,PDGF在两种细胞中,也表现出有时程的差异。