丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

目的 从感染ＨＣＶ的中国患者血清中扩增编码ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶的ｃＤＮＡ,在大肠杆菌中进行表达。方法 从血清中提取ＨＣＶ ＲＮＡ,应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶ｃＤＮＡ,Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终引法测定其序列,与ｐＢＶ２２０载体构建重组粒,在大肠杆菌中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ分析重组蛋白。结果 用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶基因,序列分析表明其读码框架     

丙肝病毒(HCV)及乙肝病毒(HBV)双表达载体的构建及表达

目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游 ,称为pRSC HBV/HCV ,转染SP2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果 :pRSC HBV/HCV转染SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,SDS Page电泳显示在 14kD及 2 1kD处均可见蛋白条带 ,与HBcAg及HCV核蛋白的的理论预期值一致 ,Western印迹分析显示在 14kD及 2 1kD处可见特异性的蛋白条带。 5只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组全阴性。结论 :pRSC HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白 ,免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答 ,为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫奠定了实验基础。     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

核酶在细胞外切割HCV核心区RNA的研究

目的 研究核酶在细胞外切割HCV的作用。方法 设计核酶cDNA序列,构建核酶重组质粒及HCV核心区基因cDNA重组质粒。分别进行体外转录,并加入γ-^32P ATP以标记HCV RNA。将核酶RNA、HCV核心区RNA、RNA酶抑制剂及反应缓冲液混事浊国育,以核酶RNA切割HCV RNA。通过变性聚 烯酰胺凝胶电泳及放射自显影来分析结果。结果 β－半乳糖苷酶表型筛选均可见蓝色及白色菌落生长;核酶重组质粒直接测序结果见预期要苷酸序列;HCV重组质粒限制笥酶切分析见410bp条带。核酶切割反应显示：反应时间为15和30min时可见453、307、146nt3条带。反应时间为60min时仅见307及146nt2条带。结论 核酶重组质粒构建成功,所设计核酶对HCV有切割作用。     

基因芯片法特异性检测丙型肝炎病毒的基因分型

目的：采用基因芯片特异性检测血清中丙型肝炎病毒（HCV）并进行基因分型。方法：设计HCV基因型特异探针，将其固定在玻璃片上制成微阵列芯片。阳性组血清60份，阴性组血清15份，乙型肝炎血清5份（抗HCV阴性）。经核酸提取，多聚酶链式反应（PCR）扩增，与芯片上的探针杂交，最后分析结果并与测序分型结果比较。结果：阳性组血清全部检测到HCV-RNA，均有基因芯片分型结果。基因芯片分型结果与测序分型结果一致者56例。阴性组血清HCV-RNA全部阴性。乙型肝炎血清全部阴性。结论：基因芯片可准确对HCV感染血清做定性检测并同时检测HCV基因型，简便快捷，特异性好，并且不需荧光标记和昂贵的荧光扫描仪器，与乙型肝炎血清无交叉反应。可替代基因测序分型，适于临床大量样品的检测。     

丙型肝炎病毒在人T淋巴细胞中的体外感染

用丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ阳性的血清感染人类Ｔ淋巴细胞（Ｍｏｌｔ－４），１２小时后继续孵化１～２８天，将感染后的产物用聚合酶链反应（ＰＣＲ）测定，于第１、２、３天和第８天发现ＨＣＶ－ＲＮＡ的正链，第２和第８天发现ＨＣＶ－ＲＮＡ的负链。     

HCV E1基因序列的原核高效表达及表达产物的初步应用

目的 在原核表达系统中对HCV E1基因进行克隆和高效表达,并初步探讨表达产物在抗－HCV筛选中的作用。方法 通过RT－PCR法从HCV RNA阳性的血清标本中扩增出HCV E1片段,并在扩增用的引物中引入克隆所需的酶切位点,克隆产物经Xba I和EcoR I酶切后,在T4DNA连接酶的作用下克降人经同样双酶切的原核表达载体PMS－31b中,并用此连接产物转化大肠埃杀菌POP2136,挑取具有氨苄抗性的菌东扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定,鉴定出的阳性菌经42℃诱导后用SDS－PAGE检查其表达状况,并用Western blot鉴定表达产物有特异性,同时用初步纯化的表达产物用ELISA法检测病人血清。结果 经Sma I酶切后PCR产物被切成144bp和356bp的两个片段,在具有氨苄抗性的菌中提取的质粒经Sma I和Xba I酶切后产生了一356bp的片段;42℃诱导后在SDS－PAGE中出现了一条相对分子质量为31000的条带,其表达量约为17％,经Western blot鉴定后在该处出现了阳性信号;ELISA实验显示在抗HCV阳性的血清中的阳性率约为29．8％（26／90）,而在抗HCV阴性的 血清中其阳性率约为3．9％（3／76）。结论 通过RT－PCR方法将HCV E1基因从HCV RNA阳性的血清标本中调出,构建了HCV E1的原核表达载体－PMS－E1,其表达量为17％,表达产物具有良好的特异性,有望应用于抗HCV的检测中。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

丙型肝炎病毒结构蛋白在痘苗病毒中的表达

为研究中国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的抗原性及在细胞内的加工，将丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５’非编码区（ＮＴＲ）和结构基因（Ｃｏｒｅ＋Ｅ１＋Ｅ２／ＮＳ１）插入痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５中，转染ＴＫ－１４３细胞，经纯化得到丙型肝炎（ＨＣＶ）重组痘苗病毒ｖＪＳＡ１１７５ＣＥ株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交表明，ＨＣＶ结构基因存在于痘苗病毒之中。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现，ｖＪＳＡ１１７５ＣＥ表达蛋白带位于９０ｋＤａ，为一多聚蛋白；此蛋白为分泌型，分泌量与细胞裂解物内量大致相同