牛蛙核糖核酸酶的表达和鉴定及功能检测

目的:在大肠埃希菌中高效表达牛蛙核糖核酸酶(ranacatesbeianaribonuclease,RCRNase),并对其纯化产物进行噻唑蓝(tetrazoliumblue,MTT)实验,观察对肝癌细胞的抑制效果。方法:用异丙基硫代D半乳糖苷(isopropylthioDgalactoride,IPTG)诱导原核表达质粒PET32aRCRNase在大肠埃希菌E.coliBl21(DE3)plysS中表达。菌体经超声、离心后,用NiNTAAgarose亲和层析法对包涵体进行纯化。采用MTT法检测纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞的杀伤活性。结果:纯化的目的蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulphatepolyacrylamidegeleletrophoresis,SDSPAGE)蛋白电泳表明,RCRNase在大肠埃希菌中是以包涵体的形式表达。用MTT法的结果中可以看出,纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的抑制效果,其IC50值(半抑制浓度)是22.44μg/mL。结论:牛蛙核糖核酸酶在大肠埃希菌中得到大量表达,为进一步研究其生物学特性以及功能打下了良好的基础。     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

恶性肿瘤患者血液中核糖核酸酶及核糖核酸酶抑制因子活性测定

本文测定了２６例正常中老年人（４０～６１）岁）、７８例初诊恶性肿瘤患者和８例术后恶性肿瘤患者（均为４０～６０岁）的血清酸性核糖核酸酶（ＡＣＲ）及游离碱性核糖核酸酶（ｆＡＫＲ）的活性。测定了１６例正常人（４０～６０岁）、５０例同龄的恶性肿瘤患者、１０例卵巢囊肿及７例胃溃疡患者红细胞中核糖核酸酶抑制因子（ＲＩ）的活性。结果表明，恶性肿瘤患者血清ＲＮａｓｅ活性显著高于正常对照组；恶性肿瘤组与正常组比较，红细胞中ＲＩ活性显著下降。胃溃疡及卵巢囊肿患者红细胞中的ＲＩ活性，与正常组比较，无明显差异。     

编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

目的：获得编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列。方法：针对编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物，通过反转录PCR技术，从雌性成年牛蛙肝脏中，扩增出编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白的基因序列，并将其克隆入栽体pUCm-T中，通过酶切及序列测定鉴定重组栽体。结果：经序列测定证实，重组栽体含有正确编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列。结论：获得的阳性克隆含有374bp的重组片段，为进一步深入研究其生物学活性及其抗肿瘤功能莫定了基础。     

核糖核酸酶抑制因子基因在人乳腺癌中的表达及突变分析

目的　通过核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor,RI)基因在人乳腺癌中的表达及其是否突变的分析 ,进一步探讨RI与肿瘤细胞生长的关系。方法　采用Westernblotting方法检测人乳腺癌组织中RI的表达量 ;采用SSCP的方法分析肿瘤细胞RI基因中是否有突变。结果　人乳腺癌组织中RI的表达明显低于同体癌旁正常组织 ,但用MboI酶切及SSCP分析未发现人乳腺癌组织中RI基因有突变。结论　乳腺癌的生长可能与RI表达的下降有关 ,从而可能使癌组织周边新血管的形成未受到有效抑制的结果。     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的:构建人胰腺核糖核酸酶(hpRNase)原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础.方法:针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX-HTb;在大肠杆菌B121中经IPTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性.结果:经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆入pPROEX-HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20 kD的蛋白产物,经Western blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA.结论:成功构建hpR-Nase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础.     

核糖核酸酶抑制因子基因的克隆及序列测定

目的 探讨核糖核酸抑制因子基因的克隆及意义。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从传代的人肝细胞中扩增了Ｒ１基因，并将其克隆以ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ－Ｖｅｃｔｅｒ上。顷ＰＣＲ筛选和限制酶切鉴定，得到了正向，反向插入的阳性克隆。结果 序列分析表明，反向克隆与报道的人胎盘Ｒ１基因序列一致。结论 用ＲＴ－ＰＣＲ产物直接克隆法，得到了与人胎盘ＲＩ序列一致的阳性克隆。ＲＩ基因的成功克隆，为研究ＲＩ的表达与调控及制备基因工     

特异性抗肝癌单链抗体的优化表达与纯化及其生物学活性鉴定

目的:制备有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体.方法:以ITPG诱导大肠埃希茵HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap抗E Tag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以Bradford检测法测定其浓度,ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性.结果:在培养基中加入0.4mol/L蔗糖,以IPTG 1mmol/L于30℃诱导12h,抗肝癌scFv可溶性表达量较多,纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325mg/L,相对分子质量为29×103.与肝癌细胞结合效价为1:64,与肝癌组织结合阳性率为75%,具有良好的生物学活性.结论:成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体,为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础.     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

核糖核酸酶抑制因子在结肠癌中的表达

目的检测核糖核酸酶抑制因子（Ribonuclease Inhibitor,RI）基因在人结肠癌及同体切缘组织中的表达情况,初步探讨RI与结肠癌生长及临床分期之间的关系。方法分别使用Western blotting法和RT-PCR法,检测28例结肠癌组织、切缘组织中RI蛋白和RI mRNA的表达情况。结果结肠癌组织中RI蛋白及mRNA的表达均明显低于切缘组织,不同临床分期之间的表达无明显差别。结论 RI的表达下降可能与结肠癌生长有关,但与结肠癌的临床分期无关。     

抗肝癌hdsFv融合RC-RNase重组免疫毒素的表达、纯化及活性测定

目的制备有临床应用前景的特异性高、稳定性强的新型抗肝癌重组免疫毒素。方法利用IPTG诱导抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素在大肠杆菌中表达。表达产物经Ni-NTA亲合层析法纯化并复性,应用免疫细胞化学和MTT的方法分别检测其对人肝癌细胞的特异性结合和杀伤活性。结果重组免疫毒素以可溶性形式在大肠杆菌中获得表达。免疫细胞化学和细胞毒实验表明其能够特异性地结合并杀伤肝癌细胞,并且能够保持较强的稳定性。结论我们抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素的成功制备,为其进一步的临床应用研究奠定了一定的实验基础。     

抗肝癌单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase的导向治疗作用

目的：观察抗肝癌重组单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase对荷人肝癌裸鼠移植瘤的导向治疗作用，并探讨其临床应用价值。方法：将原核表达载体TIG-hdsFv-RC-RNase转化E.coli BL21（DE3）plys中，利用IPTG大量诱导表达抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组单链免疫毒素。表达产物在非变性条件下经Ni-NTA Agarose亲合层析法纯化并体外复性，利用细胞ELISA法检测其特异性结合体外培养的人肝癌细胞的免疫活性。建立荷人肝癌裸鼠移植瘤动物模型，初步评估其对荷人肝癌裸鼠移植瘤的导向治疗作用。结果：工程菌经IPTG诱导后，出现一条相对分子质量约为41000的新生蛋白带，且主要以可溶性形式表达。纯化后表达产物的纯度达到基本均一。细胞ELISA检测结果显示，纯化产物复性后能够与体外培养的人肝癌细胞特异性结合，而对正常肝细胞的结合能力非常弱，两者具有非常显著的差异（P〈0．01）。导向治疗结果表明，其对荷人肝癌裸鼠移植瘤治疗有效率为100％，与生理盐水组相比具有非常显著的差异（P〈0．01），抑瘤率达到79．38％。结论：成功获得了特异性强的有活性的抗肝癌重组单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase，其对荷人肝癌裸鼠移植瘤具有一定的导向治疗作用，可能成为抗肝癌导向治疗药物。     

抑癌基因P53在中晚期肝细胞癌中的表达及预后意义

目的探讨抑癌基因P53在中晚期肝细胞癌中的表达及其预后价值。方法应用免疫组化法(LSAB法)检测P53在45例肝癌组织中表达。结果P53在肝癌细胞中的阳性表达率为44.4%(20/45),癌旁组织无表达;P53在肝癌细胞高中分化组中阳性率为34.3%(12/35),而低分化组中为80%(8/10),两者差异显著(P<0.05);肝癌术后生存期≤1年组中P53阳性率为65%(11/17),而>1年组为32%(9/28),两者差异显著(P<0.05)。结论抑癌基因P53的突变是部分肝细胞癌变原因之一,且P53的检测可为临床评价肝癌细胞分化程度和患者的预后提供客观参考     

PTEN基因在肝细胞肝癌中的表达及其意义

目的：研究PTEN基因在肝细胞肝癌（human hepatocellular carcinoma，HCC）中的表达，探讨其在HCC发生发展中的作用及意义。方法：应用免疫组化（SP法）和半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测58例HCC及对应癌旁组织中PTEN蛋白及PTEN mRNA的表达情况，分析PTEN基因的表达与HCC临床病理参数的关系。结果：PTEN蛋白明确定位于肝细胞胞质内。PTEN mRNA和PTEN蛋白在HCC中的阳性率分别为41．38％（24／58）、44．83％（26／58），明显低于癌旁肝组织的阳性率100%（58／58），差异具有统计学意义，P〈0．01。统计学分析显示，在HCC中PTEN基因的低表达与肿瘤分期分级、门静脉有无癌栓、血清中甲胎蛋白表达水平、是否合并HBV感染等有关，P＜0．05，与患者年龄、性别、肿瘤大小等因素无关。结论：PTEN基因可能在HCC的发生发展中起着重要作用，其表达有望成为HCC的重要分子生物学指标。     

E-cadherin和PCNA在肝细胞癌中表达关系的研究

目的 :研究肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)中上皮钙黏附素 (epithelialcadherin ,E cadherin)和增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearantigen ,PCNA)表达的关系。方法 :采用免疫组织化学方法检测 4 9例HCC病人手术后的存档石蜡切片组织中E cadherin、PCNA的表达情况。结果 :5 7 14% (2 8/ 4 9)的HCC病例E cadherin的表达减弱 ,4 2 86 % (2 1/ 4 9)的病例E cadherin的表达正常。4 8 97% (2 3/ 4 9)的HCC病例PCNA呈高表达 ,5 1 0 3% (2 6 / 4 9)的病例PCNA呈低表达。二者的表达有相关性 (P <0 .0 5 )。结论 :E cadherin表达正常对HCC细胞增殖有抑制作用 ,E cadherin的表达减弱后细胞增殖能力增加 ;E cadherin对HCC细胞增殖的抑制作用是不完全的。     

肝细胞癌中Lumican和Parkin的表达及意义

目的探讨肝细胞癌组织中Lumican蛋白及Parkin蛋白的表达及意义,并分析两者的相关性。方法应用免疫组织化学S-P法检测62例肝癌患者癌组织及62例癌旁组织中Lumican及Parkin蛋白的表达并分析其与临床病理因素之间的关系。结果 (1)肝癌组织中Lumican、Parkin的阳性表达率分别为35.5%、32.3%,与癌旁组织的阳性表达率比较(66.1%、72.6%),差异具有统计学意义(P<0.05);(2)Lumican蛋白的表达与Edmondson分级及是否伴有门静脉癌栓相关(P<0.05),而与性别、肿瘤大小、HBsAg、肝硬化和AFP无关(P>0.05);(3)Parkin蛋白的表达与患者肝癌Edmondson分级、AFP水平、是否伴有门静脉癌栓相关(P<0.05),而与性别、肿瘤大小、HBsAg和肝硬化无关(P>0.05);(4)Lumican与Parkin呈正相关(r=0.450;P<0.05)。结论 Lumican与Parkin蛋白在肝细胞癌组织中表达率均较低,可能与肝癌的发生、发展有关,联合检测两者对肝癌的诊断和预后有着重要意义,有望成为肝癌治疗的新靶点。     

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及其在MKN-45细胞中的表达

目的克隆大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因并构建真核表达载体pcDNA3.1-EPNP,将重组质粒转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆。方法根据Gen-bank中大肠杆菌PNP基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物定向插入pMD-18T克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pcDNA3.1,利用脂质体将重组质粒转染MKN-45细胞。结果PCR扩增出716bp大小的片段,测序结果与已报道的EPNP基因序列一致;亚克隆经酶切鉴定正确;RT-PCR证明经G418筛选得到的转基因MKN-45细胞克隆中存在大量EPNPmRNA,前体药MePdR对转染EPNP的MKN-45细胞有较强的细胞毒作用。结论成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体,获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆,为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。     

食管癌相关基因NGAL四种融合表达载体的构建及其蛋白表达产物的比较分析

目的 :筛选出能高效表达且可溶性好的NGAL(neutrophilgelatinase associatedlipocalin)融合表达载体。方法 :将NGALcDNA全长片段分别定向克隆到表达载体的BamHI +EcoRI位点 ,构建NGAL基因的 4种融合表达载体 ,然后分别转化大肠杆菌并进行IPTG诱导小样表达 ,监测各NGAL融合蛋白在不同诱导时间内的表达量及其可溶性等。选择pHis NGAL和pDsbA2 0 NGAL进行IPTG诱导大样表达 ,通过SDS PAGE比较表达产物的量与可溶性。结果 :成功构建出 4种NGAL融合表达载体。经IPTG诱导小样表达后 ,4种载体的表达水平及其可溶性明显不同 ,DsbA2 0 NGAL、His NGAL和Trx NGAL融合蛋白表达量分别占菌体总蛋白的 33 3%、32 3%、2 8 7% ,而它们的可溶性部分分别占各自总NGAL融合蛋白的96 8%、95 3%和 6 3 0 %。对pDsbA2 0 NGAL和pHis NGAL进行IPTG诱导大样表达后发现 ,DsbA2 0 NGAL融合蛋白的表达量与可溶性较好。结论 :pDsbA2 0 NGAL表达载体是能高效表达且可溶性好的NGAL融合蛋白表达载体。     

lncRNA-ATB在人肝癌组织中的表达及意义

目的:探讨lncRNA-ATB在肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及意义.方法:收集2009年4月至2011年10月期间手术切除的肝癌组织以及对应的癌旁组织标本,采用real-time PCR技术分别检测lncRNA-ATB在肝癌组织与癌旁组织中的表达情况,并分析其与临床病理参数以及预后的关系.结果:lncRNA-ATB在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05);lncRNA-ATB在肝癌中的表达与淋巴结转移有关(P<0.05);lncRNA-ATB高表达组患者的预后比低表达组差.结论:lncRNA-ATB在肝癌中显著性高表达且促进肝癌的发生发展.