人骨肉瘤甲氨蝶呤耐药细胞系的建立及其生物学特性

目的:诱导并建立耐甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)的人骨肉瘤细胞系,观察耐药细胞系(SOSP-9607/MTX)的生物学特性.方法:以MTX为诱导剂,采用逐步增加药物剂量冲击诱导方法,诱导建立人成骨肉瘤耐药细胞系SOSP-9607/MTX.利用光学显微镜观察细胞形态及其结构变化;MTT法检测原细胞株与耐药细胞株对MTX、顺铂(cisplatin,DDP)、卡铂 (carboplatin,CBP) 、阿霉素(doxorubicin,ADM)、异环磷酰胺(ifosfamide,IFO)、紫杉醇(paclitaxel,PTX)的药物敏感性;细胞生长曲线检测耐药细胞增殖能力;利用流式细胞仪检测细胞周期比例.结果:经12个月的诱导,建立SOSP-9607/MTX耐药细胞系,其对MTX的耐药指数(resistant index,RI)为原细胞株的4.63倍;耐药细胞系对ADM、DDP、IFO、PTX产生不同程度的耐药指数,对CBP敏感;光镜观察SOSP-9607/MTX细胞异型性与多核现象较原细胞株明显增加,细胞生长曲线显示耐药细胞株增殖能力下降,流式细胞仪检测表明,G2期细胞减少,G1和S期细胞增加(P<0.05).结论:建立了耐MTX人成骨肉瘤细胞株SOSP-9607/MTX,并观察了耐药株细胞的生物学特性,为进一步研究甲氨蝶呤的耐药机制提供了良好的实验模型.     

甲氨蝶呤对映体诱导的肺癌A549耐药细胞株中VEGF及其受体表达差异的研究

目的:通过探讨甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)对映体耐药细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体表达的差异,以反映MTX对映体耐药细胞在肿瘤中血管形成能力的不同.方法:采用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)技术分别检测D-(-)-MTX/A549组、L-(+)-MTX/A549组以及亲本细胞组中VEGF、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR) - 1和VEGFR - 2 mRNA的表达水平;皮下接种裸鼠,成瘤后取瘤体切片,行CD34免疫组织化学检测,新生微血管密度(microvessel density,MVD)计数;采用双层软琼脂克隆形成实验检测D-(-)-MTX/A549组、L-(+)-MTX/A549组细胞的克隆形成率.结果:RFQ-PCR检测结果显示,D-(-)-MTX/A549组VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2 Ct值/β-actin Ct值分别为1.668±0.127、1.872±0.133和1.919±0.107,L-(+)-MTX/A549组的比值分别为2.035±0.185、2.221 ±0.157和2.255 ±0.140,亲本细胞组的比值为2.057±0.123、2.291±0.138和2.354±0.131;3种细胞植入裸鼠成瘤后切片免疫标记CD34统计MVD显示亲本细胞为3.29±1.11,L-(+)-MTX/A549细胞为8.00±2.14,D-(-)-MTX/A549细胞为57.88±13.87;软琼脂实验检测克隆形成率发现D-(-)-MTX/A549组为(0.625±0.088)%,L-(+)-MTX/A549组为(1.050±0.095)%,亲本细胞组为(1.250±0.248)%.研究结果显示D-(-)-MTX/A549组和L-(+)-MTX/A549组以及亲本细胞组之间差异均有统计学意义(P<0.05),而L-(+)-MTX/A549组与亲本细胞组之间则差异无统计学意义(P>0.05).结论:D-(-)-MTX诱导肺腺癌A549耐药细胞在肿瘤血管形成上的能力大于L-(+)-MTX诱导的细胞.     

ULBP3基因转染提高人外周血NK细胞对人成骨肉瘤Saos-2细胞的杀伤活性

目的 观察ULBP3基因转染对人外周血NK细胞对Saos-2细胞杀伤活性的影响。方法 用RT-PCR方法从人成骨肉瘤组织中提取ULBP3基因，构建pcDNA3真核表达质粒，以Lipofectamine为载体转染人成骨肉瘤Saos-2细胞，用percoll密度梯度离心法分离人外周血NK细胞作为效应细胞，以Saos-2细胞和转染ULBP3基因的Saos-2细胞作为靶细胞，进行体外杀伤实验，比较两组的特异性杀伤率。结果 在效靶比为30:1时人外周血NK细胞对转染ULBP3基因的Saos-2细胞的特异性杀伤率明显高于对照组。结论 ULBP3基因转染能提高人外周血NK细胞对人成骨肉瘤Saos-2细胞的杀伤活性。     

人肺癌不同转移潜能细胞株的建立及其特性分析

目的:建立人肺癌不同转移潜能细胞株,并对其转移特性进行初步研究,为肺癌转移机制的研究提供模型. 方法:采用有限稀释单细胞克隆培养的方法,从已建立的人肺癌高转移细胞株SPC-A-1sci中分离出的不同单克隆细胞,通过体外损伤愈合、迁移与侵袭实验,体内皮下移植瘤自发性转移实验,比较分离出的不同细胞株之间以及与亲代高转移细胞株SPC-A-1sci之间运动、迁移、侵袭及转移能力的差异. 结果:从SPC-A-1sci细胞株中成功分离出3株单克隆细胞(命名为SPC-A-1sci-C5、SPC-A-1sci-F3、SPC-A-1sci-C2),均具有特异性形态学特征;与亲代高转移细胞株SPC-A-1sci相比,SPC-A-1sci-C5细胞株的体外侵袭能力明显增强,其他2株细胞的体外侵袭能力则明显降低;3株单克隆细胞在细胞形态和体外侵袭能力方面存在明显差异,SPC-A-1sci-C5的体外侵袭能力明显高于其他2株细胞.体内皮下移植瘤自发性转移试验显示,SPC-A-1sci-C5细胞不仅转移发生时间较早,而且肺转移程度(包括转移灶数量及大小)亦较其他2株细胞增多.结论:成功建立了具有相同遗传背景、不同转移潜能的3株人肺癌细胞,为肺癌转移的进一步研究提供了理想模型.     

MiR-300对骨肉瘤细胞增殖与凋亡作用研究

目的 骨肉瘤具有局部高度侵袭能力以及快速转移潜能,因而致死率较高.研究指出,miR-300的表达异常与多种肿瘤的发病相关.miR-300对骨肉瘤细胞是否存在调控作用却属未知.本研究探讨miR-300对骨肉瘤细胞Saos-2增殖与凋亡调控的作用.方法 将miR-300转染进骨肉瘤细胞Saos-2中,实现miR-300在Saos-2细胞内的高表达.通过荧光定量PCR测定miR-300在细胞内的表达水平;分别采用MTT活细胞测试,细胞周期实验和克隆形成实验检测骨髓瘤细胞的增殖情况;通过蛋白质印迹法测定Bcl-2、Bax和Bak,裂解型Caspase-3蛋白水平来鉴定细胞凋亡.结果 转染miR-300的Saos-2细胞,其miR-300表达量为对照组的(10.23±1.04)倍,t=3.613 8,P=0.000 6.MTT实验结果显示,在转染后24和48 h,miR-300组的Saos-2相对活细胞百分比相对对照组分别为[(174.35±28.46)％,t=2.219,P=0.03]和[(225.73±24.62)％,t=2.738,P=o.008].miR-300组Saos-2细胞处在G1期的百分比为39.42％,低于对照组的47.58％,t=2.366,P=0.021;而处在G2期的细胞百分比为19.12％,显著高于对照组的10.55％,t=2.987,P=0.004.miR-300组Saos-2细胞克隆形成率为(52.53±30.21)％,显著高于对照组的(24.67±2.05)％,t=2.711,P=0.008 6.miR-300组Saos-2细胞中Bax、Bak和裂解型Caspase-3表达水平分别为对照组的(0.25±0.02)倍(t=2.785,P=0.007)、(0.31±0.03)倍(t=3.223,P=0.002)和(0.36±0.03)倍(t=3.006,P=0.003 8),差异有统计学意义.Bcl-2蛋白水平为对照组的(6.32±0.57)倍,t=3.218,P=0.002.转染miRZip lent-shMiR-300的Saos-2细胞,其miR-300数量为对照组的(0.28±0.03)倍,t=3.531,P=0.000 78.转染24 h后,miR-300组Saos-2相对活细胞数为对照组的(64.46±5.32)％,t=2.324,P=0.024;48 h后为对照组的(48.14±4.38)％,t=3.009,P=0.004.miR-300组Saos-2细胞处在G1期的百分比为55.71％,高于对照组的46.78％,t=2.108,P=0.039;处在G2期的细胞百分比为2.81％,低于对照组的11.46％,t=3.224,P=0.002.miR-300组的Saos-2细胞的克隆形成率为(17.63±3.89)％,显著低于对照组的(26.84±2.94)％,t=2.989,P=0.004.miR-300组Saos-2细胞中Bax表达水平为对照组的(6.25±4.23)倍,t=3.138,P=0.002 6;Bak表达水平为对照组的(6.03±4.27)倍,t=3.395,P=0.001 2;裂解型Capase-3表达水平为对照组的(5.35±0.37)倍,t=3.017,P=0.003 7;而Bcl-2蛋白水平为对照组的(0.36±0.02)倍,t=2.769,P=0.007 4.结论 miR-300在骨肉瘤细胞的增殖与凋亡调控中具有重要作用,抑制miR-300表达可以一定程度上减少骨髓瘤细胞的增殖,促进其凋亡,为骨肉瘤的病理机制研究提供了新研究方向.     

骨肉瘤化疗中甲氨蝶呤血药浓度测定及影响因素分析

背景与目的:大剂量甲氨蝶呤(MTX)和亚叶酸钙解救仍然是目前治疗骨肉瘤最有效和最常用的辅助及新辅助化疗方案之一,由于MTX在体内代谢的个体差异较大,因此化疗风险很大,必须通过监测MTX血药浓度,及时调整MTX使用剂量和亚叶酸钙的解救剂量。本研究探讨骨肉瘤化疗中患者个体因素及化疗副反应与MTX血药浓度之间的相关性。方法:58例骨肉瘤患者,采用大剂量MTX静脉滴注后配合亚叶酸钙解救,化疗期间给予水化、碱化及利尿等处理并配合进行MTX的血药浓度监测。采用逐步回归变量筛选、Fisher确切概率法、行平均分检验等统计学方法分析患者个体因素及化疗副反应与MTX血药浓度之间的相关性。结果:骨肉瘤患者0、24、48、72 h MTX血药浓度分别为(242.08±107.31)、(2.86±2.21)、(0.47±0.67)和(0.09±0.17)mg/L,与测量时间成反比,与用药的次数、MTX用量成正比关系,与MTX和DDP的累积用量无明显相关性,48和72h MTX血药浓度与肝功能损害间有明显相关性。结论:MTX血药浓度监测对于指导MTX个体化用药、CF的及时解救及减少毒副反应的发生具有重要意义。     

银杏内脂B对人骨肉瘤Saos-2细胞的抑制作用研究

目的 探讨银杏内脂B（GB）对骨肉瘤（OS）细胞增殖、凋亡和迁移侵袭的影响以及潜在机制。方法 将人骨肉瘤Saos-2细胞分别在含300、600和1200 μmol/L GB的培养液中培养24、48和72 h,采用CCK-8法检测Saos-2细胞的增殖情况,流式细胞仪检测Saos-2细胞凋亡率,Transwell小室迁移与侵袭实验检测GB对Saos-2细胞迁移和侵袭能力的影响;提取GB处理后Saos-2细胞的mRNA和蛋白,采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9的基因及蛋白表达水平,Western blotting法检测Erk和Akt磷酸化及cleaved-caspase-3水平。结果 GB能明显抑制Saos-2细胞的增殖,且呈时间和浓度依赖性,600和1200 μmol/L GB可诱导Saos-2细胞凋亡,GB对Saos-2细胞的迁移及侵袭的抑制作用呈浓度依赖性;GB可升高Bax mRNA和蛋白水平,但降低Bcl-2、MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白水平;高浓度GB能抑制Erk和Akt的磷酸化且升高cleaved-caspase-3水平。结论 GB具有抑制Saos-2细胞增殖及迁移侵袭和诱导细胞凋亡作用,其机制可能与抑制Erk和Akt磷酸化有关。     

骨肉瘤凋亡与耐药相关机制的研究进展

骨肉瘤是骨科临床最常见的一种严重危害人类健康的恶性骨肿瘤,好发于青少年。常伴随截肢、肺转移、死亡等后果,其单纯手术治愈率仅15%~20%[1]。随着新辅助化疗的发展,骨肉瘤患者5年生存率已提高至70%左右[2]。凋亡异常以及耐药性的产生(尤其是多重耐药性)导致肿瘤迅速进展是骨肉瘤治疗失败的主要原因[3-4]。调控细胞凋亡异常,降低骨肉瘤的耐药性,从而提高骨肉瘤治疗效果,是降低骨肉瘤死亡率,改善患者远期预后的重     

胃癌多药耐药细胞株的建立及其生物学特征

胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免…     

奥美拉唑逆转人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP耐药性的研究

目的:探讨液泡ATPase[vacuolar (H+)-ATPase, V-ATPase]非特异性抑制剂奥美拉唑(omeprazole ,OME)逆转人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的耐药性及可能的作用机制.方法:以非细胞毒性浓度4 μg/mL的OME预处理A549/DDP细胞24 h,再用2 μg/mL顺铂(cisplatin, DDP)处理 A549/DDP细胞.MTT法检测细胞的增殖抑制率,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)法间接检测细胞内pH值的变化,FCM法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和PTEN的表达,RT-PCR法检测V-ATPase 、Bcl-2和PTEN mRNA的表达.结果:OME具有逆转A549/DDP细胞耐药性的作用,逆转倍数为1.45 (P<0.01);OME预处理后A549/DDP细胞内pH值明显降低,Bcl-2蛋白表达下降,PTEN蛋白表达增加(P<0.01).V-ATPase在亲本A549及A549/DDP细胞中相对表达量分别为0.88±0.00和0.99±0.00 (P<0.01);A549/DDP细胞中V-ATPase在有无OME预处理的情况下的相对表达量分别为1.09±0.00和1.05±0.02,差异无统计学意义.Bcl-2 mRNA相对表达量下降(P<0.01),PTEN mRNA相对表达量增加(P<0.01).结论:V-ATPase在A549/DDP细胞中高表达,OME能部分逆转A549/DDP耐药性,其作用机制可能与上调PTEN和下调Bcl-2 表达有关.     

人肝癌顺铂耐药细胞系的建立及其生物学特征

背景与目的：药物耐受性是当前肿瘤研究的热点,国内外普遍应用体外建立的耐药细胞系作为研究模型。为探讨肝癌对顺铂耐药的机理。本研究首次建立了人肝癌顺铂耐药细胞系并研究其生物学特性。方法：采用逐步递增顺铂浓度,间歇作用体外诱导法建立人肝癌顺铂耐药细胞系QGY/cDDP;MTT法测定药物敏感性,光镜,电镜,活细胞计数法,流式细胞仪及染色体分析等方法观察其生物学特征的改变。结果：历时3个月建成人肝癌顺铂耐药细胞系QGY/cDDP,其对顺铂的耐药指数为10.81,并且与5-氟尿嘧啶,表阿霉素等多种抗癌药有不同程度的交叉耐药性;QGY/cDDP的细胞形态及染色体数目发生改变;体外群体倍增时间较亲代细胞延长;细胞周期分析发现其S期与G2/M期细胞减少,G0/G1期细胞增多。结论：QGY/cDDP细胞具有耐药表型,且耐药性能稳定。     

人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214的建立及其生物学特性

目的 建立人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214,为子宫颈癌研究提供实验模型。方法 无菌切除人子宫颈癌的手术标本,用组织块贴壁法体外培养,连续传代稳定生长后,绘制细胞生长曲线。采用光镜、电镜观察细胞形态,并进行细胞周期和染色体核形分析。用免疫组化法测定细胞系肿瘤标记物的(ER、PR、Keratine、PCNA)表达情况。结果 组织块贴壁法体外培养获得人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214(简称H),细胞维持培养16个月,传代131代,生长稳定,群体倍增时间为35．48h,细胞呈上皮镶嵌状贴壁生长,趋向复层生长,无接触抑制。超微结构显示,具有典型的桥粒结构和较多的张力原纤维。染色体数目35—156条,主流范围58—80条(64．8％),结构为人类染色体。细胞的肿瘤标记物(ER、PR、Keratine、PCNA)检测呈高表达,DNA指数为1．931。裸鼠移植瘤组织病理形态学与患者原始肿瘤一致,无血清培养成功。结论 通过组织块贴壁法体外培养建立的人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC—0214,与原发癌保持相同的生物学特性,体外连续传代16个月以上,细胞形态不变,生长周期恒定,可望作为一个稳定的细胞系。     

结肠癌奥沙利铂耐药细胞系的建立及其生物学特性的研究

Background and Objective:Chemotherapy is the main treatment for colon cancer,while multidrugresistance is the main reason for chemotherapy failure and tumor relapse.This study was to establish two oxaliplatinresistant colon cancer cell lines and evaluate their biological characteristics.Met hods:Oxaliplatin-resistant colon cancer cell lines SW620/L-OHP and lovo/L-OHP were established in vitro by continuous exposure to oxaliplatin(L-OHP) of low and gradually increased concentration.Growth curve,cross-resista...     

人类卵巢癌顺铂耐药细胞株OV1228／cDDP的建立及其生物学特性

 目的　建立人类卵巢癌细胞顺铂耐药细胞株OV1228／cDDP,并对其生物学特性进行检测。方法　采用顺铂浓度梯度递增法,建立人类卵巢癌顺铂耐药细胞株。通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、药物敏感试验、mdr-1和PKC-α基因及蛋白表达水平的测定,来评价OV1228／cDDP的生物学特性。结果　成功建立了OV1228／cDDP耐药细胞株,耐药指数（RI）为5.97,对多柔比星和5-氟尿嘧啶具有一定的交叉耐药性。与OV1228相比,OV1228／cDDP细胞异型性增加、细胞倍增时间延长;mdr-1和PKC-α在基因和蛋白表达水平均明显增高。结论　OV1228／cDDP细胞对顺铂耐药性稳定,并呈现一定的多药耐药特性,为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。     

人骨肉瘤细胞株中类肿瘤干细胞的分离培养及鉴定

目的：从人骨肉瘤株U2-OS中分离并鉴定类肿瘤干细胞。方法：用无血清培养法从骨肉瘤细胞株中分离出肿瘤细胞球，流式细胞术检测骨肉瘤细胞株中Stro-1的阳性表达率，MTT法检测其增殖能力，免疫磁珠分选Stro-1阳性细胞，反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法研究Stro-1阳性细胞中Stro-1 mRNA的表达，并将Stro-1阳性细胞和阴性细胞分别接种于NOD／SCID小鼠。结果：U2-OS中CD44的阳性百分率为5．67％，Stro-1阳性细胞形成的细胞球具有增殖和分化的能力，Stro-1阳性细胞中呈现Stro-1 mRNA的高表达，Stro-1阳性细胞能形成骨肉瘤。结论：骨肉瘤细胞株中存在类骨肉瘤干细胞，并具有自我更新和多向分化的能力。     

凋亡素对R-OS-732细胞骨架的影响

目的 研究凋亡素(apoptin,VP3)对骨肉瘤OS-732多药耐株(R-OS-732)细胞骨架的影响及生长抑制作用。方法 将VP3基因克隆入载体pIRESI,获得重组质粒pIRV3;脂质体法转染R-OS-732细胞;制作细胞骨架标本。结果 实验组细胞骨架网状结构减少,浓聚,分布不均;对照组细胞骨架网状结构脉络清晰,舒展,分布也相对均匀。结论凋亡素对R-OS-732细胞生长具有抑制作用并导致细胞骨架破坏。     

人大细胞肺癌多药耐药株H460/cDDP的建立及其生物学特性

目的：建立人大细胞肺癌多药耐药株H460/cDDP．并对其生物学特性进行测定。方法：以人大细胞肺癌细胞株H460为亲本细胞．采用顺铂大剂量问歇诱导法建立多药耐药细胞株H460／cDDP。光镜下观察其形态学变化；MTT法测定药物敏感性；锥虫蓝拒染实验测定细胞生长曲线、倍增时间；进行染色体核型分析；棵鼠成癌实验测定其体内成瘤活性。结果：历时近6个月建成人大细胞肺癌多药耐药株H460／cDDP．经鉴定其对顺铂的耐药指数为10．21，对5-氟尿嘧啶，多柔比星(阿霉素)、依托泊苷(足叶乙甙)、甲氨蝶呤有不同程度的交叉耐药。H460／cDDP较亲本细胞分裂高峰延迟，倍增时间由20．78小时延长至3646小时．细胞形态改变，染色体变化不突出。经过反复冻存．复苏．上述特性保持稳定．并具有体内成瘤活性，成瘤时间较亲本细胞有所延迟。结论：新建大细胞肺癌多药耐药株H460／cDDP呈中等度耐药、多药耐药表型稳定且具有体内成瘤活性，可用于下游实验。     

肺癌细胞系XWLC-05的建立及其生物学特性研究

背景与目的:云南省宣威地区是我国肺癌高发地区之一,女性肺癌死亡率居全国首位,本研究旨在建立云南宣威女性肺腺癌细胞系,为肺癌高发区的防治研究提供理想的体外实验模型.方法:以手术切除的肺癌组织标本进行原代培养,通过光镜观察、电镜观察、绘制生长曲线、计算倍增时间、双层软琼脂培养、流式细胞仪、染色体及其显带分析、肿瘤标志物检测、异体移植实验及免疫组化检测等对其生物学特性进行分析鉴定,建立细胞系.结果:体外培养细胞生长稳定,细胞形态学、增殖动力学及浸润性生长结果表明该细胞系符合恶性细胞特征,染色体数目分布在55～69之间,众数为60～63;小鼠接种成瘤率为100%,瘤细胞形态与原患者的病理切片相似,命名为XWLC-05(Xuanwei Lung Cancer-05).结论:该细胞系符合建系标准,是一株新建的人肺腺癌细胞系.     

拓扑异构酶Ⅱ在化疗后患者骨肉瘤组织中的表达及其意义

目的 探讨DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）在化疗后患者骨肉瘤组织中的表达.方法 对30例骨肉瘤患者术前进行2个疗程化疗,手术切除肿瘤组织,通过免疫组织化学法检测骨肉瘤组织中TopoⅡ的表达,分析其与临床病理因素的关系.结果 30例骨肉瘤组织中TopoⅡ阳性表达8例（26.7％）.TopoⅡ蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤的恶性程度、发生部位、有无转移及Enneking分期均无关（P＞0.05）,21例生存患者中,TopoⅡ蛋白阴性18例,9例死亡患者中,TopoⅡ蛋白阴性4例,二者阴性表达率差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 TopoⅡ低表达的骨肉瘤患者可能预后较差.