超声声学造影剂介导肝细胞生长因子基因转染的体外实验

目的 研究超声声学造影剂促进肝细胞生长因子(HGF)基因在大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)中的转染效果.方法 将HSC-T6接种在24孔板中,随机分为5组:①空白对照组(C);②单纯质粒组(P);③载基因超声声学造影剂组(M);④质粒+超声组(P+U);⑤载基因超声声学造影剂+超声组(M+U).荧光显微镜及流式细胞仪检测pIRES2-EGFP/HGF在细胞内的表达及转染效率;MTT法检测该方法 对HSC-T6生长活性的影响;Western Blotting检测HGF蛋白的表达.结果 M+U组的绿色荧光强度及转染率均高于其他各组,并对细胞活性无明显影响,且HGF蛋白的表达均高于其他各组(P＜0.05).结论 超声声学造影剂可提高基因在体外培养HSC-T6的转染效率,并对细胞活性无明显影响,为提高非病毒载体的转染效率提供一个新策略.     

超声微泡促进TDL复合物介导基因转染的体外实验

目的 研究超声微泡促进TDL复合物介导的肝细胞生长因子(HGF)基因在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的转染效果.方法 将HUVEC接种在24孔板中,随机分为以下5组:(1) 空白对照组;(2) TDL复合物组;(3) TDL复合物 微泡组;(4) TDL复合物 超声组;(5) TDL复合物 微泡 超声组.荧光显微镜及流式细胞仪检测pIRES2-EGFP/HGF在细胞内的表达及转染效率.MTT法检测该方法对HUVEC生长活性的影响.RT-PCR及Western Blot检测HGF的mRNA及蛋白的表达.结果 TDL复合物 超声 微泡组的绿色荧光强度及转染率均高于其它各组,并对细胞活性无明显影响.TDL复合物 超声 微泡组的HGF mRNA及HGF蛋白的表达也均高于各组.结论 超声微泡可提高TDL复合物介导的基因在体外培养HUVEC的转染效率,并对细胞活性无明显影响,该方法为提高非病毒载体的转染效率提供一个新策略,可能成为缺血性心脏病基因治疗的有效手段之一.     

超声辐照联合PEI介导基因转染的实验研究

目的 探讨超声联合聚乙烯亚胺(PEI)在促进肝癌细胞(HepG2)的基因转染中有无协同作用.方法 选用工业用和实验用PEI为研究对象.用锥虫蓝拒染法检测细胞成活率,选取合适的PEI浓度与绿色荧光蛋白基因(EGFP)质粒DNA共孵育,制备阳离子复合物(PEI/DNA)导入HepG2细胞中和/或辐照超声.24 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪定量分析转染率.结果 超声可促进质粒DNA在HepG2细胞的基因转染.PEI对细胞有毒性,当PEI浓度为0.001%时细胞成活率约为70%,选此浓度用于基因转染实验.2种PEI复合物均能显著促进质粒DNA基因转染,其转染率高于单纯辐照超声介导的基因转染,差异有统计学意义(P＜0.01),2种PEI的转染率工业用组(15.42士4.71)%、实验用组(12.27±3.58)%之间的差异无统计学意义(P＞0.05),加入PEI联合辐照超声后转染率下降(P＜0.01).结论PEI和超声均能促进HepG2细胞基因转染,但PEI联合辐照超声后转染率明显下降,二者没有协同作用.工业用与实验用PEI一样具有促进基因转染的作用.     

不同超声辐照时间和微泡剂量介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 探讨不同超声辐照时间和微泡剂量与基因转染效率之间的关系,初步摸索适宜转染的参数条件.方法 质粒DNA用增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP),以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象.超声频率1 MHz.声强0.5 W/cm2,对加入pEGFP和不同剂量微泡的HepG2细胞辐照不同的时间,24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测基因转染率,台盼蓝染色检测细胞存活率.结果 各实验组均可见不同程度荧光蛋白表达,辐照时间为20 5和微泡剂量为60μl时可达到较理想的转染效率.结论 在超声频率和声强一定的条件下,不同超声辐照时间和微泡剂量有不同的基因转染效率,20 s、60 μl是一个较理想的参数,为基因治疗进一步研究提供了参考.     

超声辐照微泡介导肝细胞生长因子基因逆转大鼠肝纤维化

目的 探讨超声辐照载肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因的超声微泡造影剂逆转大鼠肝纤维化的可行性. 方法 将成模后的40只Wistar大鼠随机分为5组,即(1)超声+载基因超声微泡造影剂组(HGF+ US/MB),(2)超声+单纯质粒组(HGF+ US),(3)质粒+超声微泡造影剂组(HGF+MB),(4)单纯质粒组(HGF),(5)单纯模型组(MA).经股静脉注入超声微泡造影剂,同时超声基因转染治疗仪辐照肝区,辐照条件为300 kHz,2 W/cm2,辐照10 s,间隔10 s,共20 min.于超声辐照后14 d行磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)检查;然后处死各组大鼠,取肝组织HE染色,观察肝纤维化恢复情况;Western Blot检测HGF蛋白在大鼠肝脏中的表达. 结果 HGF+ US/MB组的表观弥散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值明显高于其他各组;相反地,指数表观弥散系数(exponential apparent diffusion coefficient,EADC)低于其他各组;病理组织片可见HGF+ US/MB组汇管区纤维结缔组织增生,但肝小叶结构完整,其余各组纤维组织增生程度强于HGF+US/MB组.同时,HGF+US/MB组的HGF蛋白的表达均高于其他各组(P＜0.05). 结论 超声靶向破坏微泡能够介导HGF基因在肝组织内高效表达,并产生抗纤维化效应,为肝纤维化的基因治疗提供一种新的基因转移途径.     

聚酰胺纳米分子介导survivin反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞凋亡

背景:传统的病毒载体及非病毒载体在基因治疗中均存在明显的缺点,采用纳米材料作为反义寡核苷酸载体有望获得更好更安全的基因转导,提高基因治疗的有效性和安全性.实验拟采用聚酰胺纳米分子介导反义寡核苷酸阻断survivin表达,诱导大肠癌凋亡.目的:探讨聚酰胺树形分子高聚合物介导survivin反义寡核苷酸(survivin antisense oligonucleotide,survivin-asODN)转染结直肠癌SW620细胞的可行性以及对结直肠癌SW620细胞survivin表达、细胞凋亡的影响.设计、时间及地点:肿瘤基因治疗体外实验,于2007-09/2008-05在上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室及南方医科大学珠江医院中心实验室完成.材料:人结直肠癌细胞株SW620购自中国科学院上海细胞研究所,聚酰胺树形分子由上海交通大学微纳米研究院生物纳米工程研究室崔大祥教授提供,转染试剂脂质体LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司.survivin-asODN由上海生工公司合成.方法:采用300 μg/L survivin-asODN和4.06 μg/L聚酰胺制备聚酰胺反义基因复合物,同时制备阳离子脂质体反义基因复合物作为对照.透射电镜观察复合物的形态,激光散射粒径分析仪测定粒径,zeta电位分析仪测定zeta电位,离心法和紫外分光光度仪测定复合物的的包封率、载药率和体外DNA释放速度.将上述两种基因转染复合物转染结直肠癌细胞,测定其转染效率;Western blotting检测转染后细胞中survivin蛋白的表达:流式细胞术检测两组细胞的凋亡率.主要观察指标:阳离子脂质体-survivin-asODN复合物及聚酰胺-survivin-asODN复合物的粒经,zeta电位,基因载药率,包封率,释放率,转染后survivin表达率及对凋亡的诱导率.结果:聚酰胺-survivin-asODN复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径(P<0.01),但zeta电位高于后者(P<0.05);基因载药率、包封率两组差异无显著性意义:聚酰胺对DNA持续释放14 d,但脂质体只持续5 d.聚酰胺-survivin-asODN转染结直肠癌细胞的效果强于脂质体survivin-asODN(P<0.05).转染后结直肠癌细胞survivin蛋白的表达低于脂质体复合物(P<0.05),细胞的凋亡率高于脂质体复合物(P<0.05).结论:聚酰胺能将survivin-asODN高效递送到结直肠癌SW620细胞,降低survivin蛋白表达并诱导结直肠癌细胞凋亡.     

小干扰RNA对鼻咽癌CNE-2细胞Bcl-2基因的放射增敏研究

目的:探讨Bcl-2基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对鼻咽癌细胞的辐射增敏作用.方法:构建Bcl-2基因的特异性siRNA的真核表达载体,并借助脂质体将其转入鼻咽癌CNE-2细胞.荧光显微镜观察转染效率;流式细胞仪检测Bcl-2蛋白在鼻咽癌细胞的表达,并检测CNE-2细胞的凋亡率;流式细胞仪检测Bcl-2基因的特异性siRNA真核表达载体联合X射线照射后CNE-2细胞的凋亡率.结果:流式细胞仪检测结果显示:转染组明显降低了Bcl-2蛋白在CNE-2细胞的表达,且转染组的细胞凋亡率明显增加.转染联合X射线照射后细胞凋亡率也明显增加,且明显高于阴性对照+X射线组和单纯X线照射组.结论:siRNA可以有效干扰鼻咽癌CNE-2细胞内Bcl-2基因的表达,可明显增强鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性.     

超声靶向微泡破碎联合半乳糖聚乙烯亚胺介导凋亡素基因诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的:探讨超声靶向微泡破碎(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)联合半乳糖聚乙烯亚胺(PEI-Gal)介导凋亡素基因(VP3)诱导肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法:体外培养HepG2细胞,随机分为4组:(1)对照组;(2)PEI-Gal组;(3)PEI-Gal+超声组;(4)PEI-Gal+超声+微泡组。转染24h后荧光显微镜观察pEGFP-VP3在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Western blot分别检测VP3 mRNA和蛋白表达水平,AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡率。结果:流式细胞仪、RT-PCR和Western blot分析表明,PEI-Gal+超声+微泡组的转染效率为(28.83±2.07)%、VP3 mRNA水平为0.92±0.02,蛋白水平为1.65±0.06,HepG2凋亡率为(37.40±2.12)%,均显著高于其他各组(均P<0.01)。结论:UTMD联合PEI-Gal可明显提高VP3基因转染HepG2细胞的效率及在HepG2细胞内的表达,增加HepG2细胞的凋亡率。     

超声联合微泡增强脂质体介导基因转染RPE细胞的实验研究

目的 比较声诺维联合超声与脂质体法介导基因转染RPE细胞的转染率和安全性,探讨超声联合微泡增强脂质体转染率的可行性.方法 RPE细胞培养在24孔板,质粒用量2 μg/孔,分为对照组、超声辐照组、超声联合微泡组(包括2 W/cm2和3 W/cm2两个亚组)、脂质体组、脂质体+超声+微泡组5组,每组10孔细胞.荧光显微镜观察基因转染情况,流式细胞仪检测基因转染率,Annexin Ⅴ-FITC和PI双染流式细胞法检测凋亡率.结果 单纯超声辐照组基因转染率为(1.06±0.13)%,超声联合微泡组分别为(15.81±1.70)%和(20.86±2.63)%,脂质体组为(30.06±3.49)%,明显高于超声联合微泡组(P<0.05).脂质体+超声+微泡组为(44.51±1.28)%,明显高于脂质体组(P<0.05).结论 脂质体介导EGFP转染RPE细胞的效率高于超声联合微泡的转染率.超声联合微泡能明显提高脂质体的转染率.     

超声造影剂联合超声介导耐药基因反义寡脱氧核苷酸转染肝癌细胞逆转多药耐药效应的研究

目的 探讨超声造影剂联合超声介导mdr1、mrp基因反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染QGY耐药肝癌细胞对多药耐药(MDR)的逆转.方法 分别将mdr1、mrp-ASODN+超声造影剂+超声辐照转染QGY/CDDP肝癌细胞,检测转染后细胞贴壁率、药物敏感性、耐药基因mRNA表达和相应耐药蛋白表达变化.结果 mdr1-ASODN转染后,细胞贴壁率和耐药基因mRNA表达变化大(P＜0.05),细胞药物敏感性和耐药蛋白P-gp、MRP表达变化小(P＞0.05).实验组(2组)作用更大(P＜0.05).mrp ASODN转染后,细胞贴壁率、药物敏感性、耐药基因的mRNA表达和耐药蛋白P-gp、MRP表达均变化明显(P＜0.05),实验组(2组)作用更大(P＜0.05).结论 mdr1、mrp-ASODN+超声造影剂+超声辐照能够低毒部分逆转肝癌细胞MDR,是潜在肿瘤基因治疗方法.     

超声联合阳离子微泡造影剂体外增强基因转染

目的探讨超声介导自制阳离子微泡破坏、增强基因转染的效果,并与普通脂质微泡对比,寻找一种更可靠、完善的基因载体工具。方法采用水浴机械震荡法,加入DC-胆固醇制备阳离子微泡,观察其物理特性并检测其体外载基因能力。将微泡和质粒DNA加入人脐静脉血管内皮细胞后分为6组,观测不同微泡浓度对细胞存活率的影响,应用荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测基因转染率,MTT法分析细胞存活率。结果自制阳离子微泡形态规整、分散度好,最大载基因率为39.7%。超声联合阳离子微泡能够增强基因转染,与普通脂质微泡组相比差异有统计学意义;随着微泡浓度增加,细胞损伤增大。结论采用自制阳离子微泡可在体外实现较高效率的基因转染。     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

Targeted tissue transfection with ultrasound destruction of plasmid-bearing cationic microbubbles

The aim of this study was to assess the relative efficacy and mechanism of gene transfection by ultrasound (US) destruction of plasmid-bearing microbubbles. Luciferase reporter plasmid was charge-coupled to cationic lipid microbubbles. Rat hindlimb skeletal muscle was exposed to intermittent high-power US during dose-adjusted intra-arterial (IA) or IV administration of plasmid-bearing microbubbles via the carotid artery or jugular vein, respectively. At 4 days, luciferase activity in US-exposed skeletal muscle was 200-fold greater with IA than with IV administration of plasmid-bearing microbubbles, and was similar to transfection achieved by IM injection of plasmid (positive control). No transfection occurred with US and IA injection of plasmid alone. Intravital microscopy of the cremaster muscle in mice following administration of microbubbles and US exposure demonstrated perivascular deposition of fluorescent plasmid, the extent of which was twofold greater for IA compared to IV injection. Electron microscopy demonstrated a greater extent of myocellular microporations in US-exposed muscle after IA injection of microbubbles. We conclude that muscle transfection by US destruction of plasmid-bearing cationic microbubbles is amplified by IA, rather than IV, injection of microbubbles due to greater extravascular deposition of plasmid and to greater extent of myocellular microporation. (E-mail: jlindner@virginia.edu)     

超声联合载卡莫司汀脂质微泡诱导大鼠C6细胞凋亡

目的 探讨低频超声介导载卡莫司汀脂质微泡诱导大鼠神经胶质瘤C6细胞凋亡的机制.方法 采用MTT法检测各实验组不同时间点的细胞抑制率,确定实验参数;流式细胞仪分析C6细胞的凋亡率及细胞周期;透射及扫描电镜观察C6细胞超微结构的变化.结果 超声+10%载卡莫司汀微泡组在6 h时段细胞抑制率、细胞凋亡率均最高,与其他实验组及对照组相比差异均有显著统计学意义(P<0.01).超声破坏载药微泡使增殖期(S期)细胞比例减少,电镜观察超声联合载药微泡可使C6细胞出现凋亡.结论 低频超声介导载卡莫司汀脂质超声微泡能诱导C6细胞凋亡,可能成为胶质瘤治疗的一种新方法.     

超声辐照联合微泡造影剂介导人血管生成素-1基因体外转染293T细胞的研究

目的 探讨超声辐照联合微泡造影剂的基因转染系统介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的转染效率.方法 将六孔板中的293T细胞悬液分为4组:A组,超声+质粒组,每孔加入10 μg目的 基因质粒;B组,超声+微泡+质粒组,每孔加入微泡和质粒混合液,终浓度分别为质粒10 μg/孔,微泡200 μl/孔;C组,脂质体+质粒组,每孔加入4 μl脂质体和5 μg质粒;D组,对照组,每孔仅加入10 μg目的 基因质粒.A组和B组均接受超声辐照,照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,作用时间为30 s.转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量观察基因的转染效率.结果 48 h后,荧光显微镜下观察到转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组、D组的基因转染效率分别为(3.5±0.4)%、(20.8±1.2)%、(18.0±0.9)%和(0.2±0.1)%.结论 超声本身即有促进基因转染的作用,超声辐照联合微泡造影剂后则增强了这种作用,明显增加了基因的转染效率.     

核转录因子-κB在肝细胞生长因子介导的肝干细胞抗凋亡效应中的作用

目的:研究核转录因子-κB(NF-κB)在肝细胞生长因子(HGF)介导WBF-344细胞凋亡信号转导调控中的作用。方法:为明确HGF对肝干细胞的抗凋亡作用,在加或不加HGF情况下WBF-344细胞用放线菌素D(ActD)20ng/mL、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导细胞凋亡,DNA电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡。为检测NF-κB的活性,用NF-κB报告基因质粒BD Great EscA PeTMSEAP vector瞬时转染WBF-344细胞,通过BD Great EscAPeTMSEAP荧光检测系统检测NF-κB的转录活性。为明确NF-κB活化在HGF介导抗凋亡效应中的作用,我们用NF-κB抑制剂如BAY-11-7082和aspirin(ASA)预处理WBF-344细胞,然后用HGF刺激,再通过ActD20ng/mLTNF-α诱导细胞凋亡效应。为证实这一结论,我们用NF-κB抑制质粒转染WBF-344细胞,筛选稳定表达株。转染细胞用HGF刺激48h,然后检测抗凋亡效应。结果:TNF-α可以诱导ActD致敏的WBF-344细胞凋亡。HGF对WBF-344细胞的凋亡具有保护作用。HGF能够明显促进NF-κB活...     

超声辐照SonoVue增强脂质体介导pEGFP-N1转染乳腺癌细胞

目的 探讨超声辐照SonoVue介导增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)转染乳腺癌MCF-7细胞的最优条件以及超声联合微泡造影剂增强脂质体转染的效果.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,按照不同的辐照条件分组:不处理组,超声辐照十质粒组,微泡浓效组,超声声张组,辐照时间组及工作周期组.分别进行超声辐照,辐照后以MTT法测细胞存活度,流式细胞仪测pEGFP-N1瞬时转染率,取得最佳的辐照条件.重新准备细胞后先以脂质体转染细胞,2 h后加入超声微泡并以最佳条件辐照,用同样的方法测细胞存活率及转染率.结果 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期(占空比)为超声辐照SonoVue介导pEGFP-N1转染MCF-7细胞的最优条件,转染率为(14.21±2.55)%,细胞存活率为(84.60±2.85)%.在增强脂质体转染的实验中,超声微泡脂质体组的转染率最高(22.15±2.69)%,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05),此时细胞存活率为(80.13±3.61)%.结论 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期是MCF-7细胞的最佳转染条件,超声联合微泡能够增强脂质体转染的效果.