黄葵素对结核分枝杆菌的抑杀作用研究

目的评价黄葵素(huangkuisu,HKS)抗结核分枝杆菌的活性。方法①采用人型结核分枝杆菌标准菌株(H37RV)、多药耐药结核菌株,分别接种于含有不同浓度黄葵素、空白对照和阳性药物的结核菌培养基,观察结核分枝杆菌的生长情况,评价其体外抗菌活性。②尾静脉注射一定数量的结核分枝杆菌标准株H37Rv和耐药株菌液,建立小鼠结核分枝杆菌感染模型。随机将模型小鼠分成利福平治疗组、黄葵素治疗组,持续治疗6周,对照组给予生理盐水治疗。以各组小鼠的肺组织和脾组织病理变化、组织荷菌量,比较各组治疗效果,评价其体内抗菌活性。结果①模型组菌落生长情况正常,黄葵素(100 mg/mL)、利福平(5 mg/mL)组结核分枝杆菌(H37RV)培养终止期未见菌落生长;恢复培养40 d仍无结核菌生长。黄葵素在100 mg/mL时显示出对临床多耐药株的较好的抑杀作用,与利福平组比较,各时间点均显示出统计学意义(P<0.05)。②结核杆菌H37Rv感染小鼠,各治疗组肺组织和脾组织的病理变化较轻,肺和脾组织荷菌量明显降低,与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05)。结核杆菌耐药株感染小鼠黄葵素治疗组小鼠组织器官的病理变化较轻,肺组织和脾组织的荷菌量明显减少,与利福平组、模型对照组比较有统计学意义(P<0.05)。结论黄葵素在体内外对结核杆菌有抑杀作用,可以作为治疗耐药株感染的候选药物进一步研究。     

重组结核分枝杆菌1600O蛋白抗原(rPA16)豚鼠皮肤试验效果的研究

目的以豚鼠为动物模型,分析重组16000蛋白抗原rPA16能否引起迟发型超敏反应(DTH)。方法连续3次皮下注射结核分枝杆菌H37Rv热灭活菌体,使豚鼠致敏后进行皮肤试验。以生理盐水为阴性对照,PPD为阳性对照组,重组蛋白则设置0.1,0.2,0.4μg三个剂量,分别进行背部皮内注射,注射后24～72h观察豚鼠注射局部皮肤的皮痘、硬结程度。结果0.1～0.4/0.2ml的重组蛋白抗原rPA16在48～72h阳性反应平均直径与PPD相比均无显著差异(均P＞0.1),3种浓度的重组蛋白豚鼠皮肤反应的阳性率之间也无显著差异(P＞0.1)。48h为rPA16引起豚鼠皮肤反应的较佳测量时间。结论重组结核分枝杆菌16000蛋白抗原与PPD相比,所引起的豚鼠皮肤DTH的反应能力基本相似,具有皮肤试验的潜在应用价值。     

结核分枝杆菌感染小鼠的脾脏和肺脏组织荷菌量与病理变化

目的分析结核急性感染小鼠脾脏和肺脏的组织荷菌量以及病理的动态变化。方法以3×105CFU结核分枝杆菌标准株H37Rv尾静脉途径感染雌性C57BL/6J小鼠,测定感染后1 d、1周、2周、3周、4周、6周和8周肺脏及脾脏组织的荷菌量,脾脏和肺脏组织经HE染色分析病理变化。结果感染动物的脾脏荷菌量在前3周逐步提高,在4～8周脾脏荷菌量维持稳定,肺脏组织在2～8周组织荷菌量逐步升高。病理分析显示动物感染3周后肺脏和脾脏出现肉芽肿,在6～8周病理损伤加重。结论小鼠经尾静脉感染高剂量结核分枝杆菌在8周前表现为急性感染状态,适用于抗结核药物的体内药效学评价。     

北京基因型结核分枝杆菌感染THP-1细胞系表达谱的研究

目的通过分析不同结核分枝杆菌感染巨噬细胞后表达谱的改变,探讨结核病(tuberculosis,TB),尤其是北京基因型结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis M.tb)感染的结核病免疫发病机制。方法具有IS6110 DNARFLP和Spoligotyping基因分型结果的265株北京基因型结核分枝杆菌(简称M.tb Beijing genotype)鉴定自2000年中国结核病流行病学抽样调查(简称2000年流调),采用平均连锁方法计算北京基因型结核分枝杆菌中心菌。结核分枝杆菌(M.tb H37Rv)、牛分枝杆菌(M.bovis)标准菌株和M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞,采用基因芯片分析其表达谱的改变。结果输入MAS系统,行进一步的分析。结果依据计算原则,相似系数最大为0.514,其对应菌株为结核分枝杆菌北京基因型中心菌株。分枝杆菌感染THP-1细胞后相应的芯片结果具有可靠性和可分析性。M.tb H37Rv、M.bovis、M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞的共同表达293个基因。共同表达基因的GO和pathway分析,发现一些不为人特别关注,但对结核免疫有一定作用的信号通路,例如B细胞受体信号通路。M.tb H37Rv、M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞差异表达基因包括:tnf,tnfrsf9,pim-1,icam-1和cd48。结论 2000年结核病流调以中国人口为整体,采用分层整群随机抽样。因此获得的M.tb Beijing genotype中心菌株具有中国代表性。293个基因可作为筛选用于菌阴结核病诊断的候选靶标。对这些差异表达基因涉及的信号通路,例如:JAK-STAT信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性以及TNF的深入分析,将对理解M.tb Beijing genotype免疫毒性特征有益。     

重组结核分枝杆菌16000蛋白抗原(rPA16)豚鼠皮肤试验效果的研究

目的 :以豚鼠为动物模型 ,分析重组 16 0 0 0蛋白抗原rPA16能否引起迟发型超敏反应 (DTH)。方法 :连续 3次皮下注射结核分枝杆菌H37Rv热灭活菌体 ,使豚鼠致敏后进行皮肤试验。以生理盐水为阴性对照 ,PPD为阳性对照组 ,重组蛋白则设置 0 .1,0 .2 ,0 .4μg三个剂量 ,分别进行背部皮内注射 ,注射后 2 4～ 72h观察豚鼠注射局部皮肤的皮痘、硬结程度。结果 :0 .1～ 0 .4μg/ 0 .2ml的重组蛋白抗原rPA16在 48～ 72h阳性反应平均直径与PPD相比均无显著差异 (均P >0 .1) ,3种浓度的重组蛋白豚鼠皮肤反应的阳性率之间也无显著差异 (P >0 .1)。 48h为rPA16引起豚鼠皮肤反应的较佳测量时间。结论 :重组结核分枝杆菌 16 0 0 0蛋白抗原与PPD相比 ,所引起的豚鼠皮肤DTH的反应能力基本相似 ,具有皮肤试验的潜在应用价值     

结核分枝杆菌对人急性白血病单核细胞株THP-1凋亡和死亡水平的影响

目的 通过对不同毒力的结核分枝杆菌感染细胞后的细胞凋亡和死亡程度的检测,以期发现结核分枝杆菌和细胞相互作用的新的方向和观点,以及对结核病免疫学发病机制的新认识.方法 选用不同毒力的结核分枝杆菌H37Ra、H37Rv及北京基因型敏感菌株(BJTB)分别感染人的巨噬细胞THP-1细胞株,模拟细胞体外感染的过程.以流式细胞仪检测细胞凋亡水平,免疫荧光检测细胞的凋亡蛋白的分布,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色检测细胞晚期凋亡的变化,台盼兰染色检测细胞死亡水平的变化.结果 H37Ra引起THP-1细胞的凋亡水平最高,H37Rv次之,BJTB引起的凋亡水平最低.BJTB引起的死亡水平最高,H37Rv次之,H37Ra最低.结论 毒力不同的结核分枝杆菌刺激细胞后和细胞的相互作用不同,毒力越高引起的凋亡水平越低,毒力越低引起的凋亡水平越高;对死亡水平的影响是毒力越高的结核分枝杆菌引起的死亡水平越高,毒力越低引起的死亡水平越低.     

间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型在结核分枝杆菌检测中的应用

目的 探讨间隔区寡核苷酸DNA微阵列法在结核分枝杆菌基因分型检测中的应用价值.方法 将结核分枝杆菌标准菌株(H37Rv)、卡介苗(BCG)菌株和97株临床结核分枝杆菌株的聚合酶链反应产物分别进行传统Spoligotyping和间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型,比较2种方法的一致性,并用H37Rv菌株检测间隔区寡核苷酸DN...     

再探结核分枝杆菌及结核病

结核杆菌属于分枝杆菌属，是专性需氧菌。由于细胞壁含大量蜡质和疏水性阿拉伯-半乳聚糖-分枝菌酶，难以用革兰染色着色，为抗酸阳性菌。通常寄生在细胞内，是一种兼性胞内寄生的人类致病菌，可引起结核病。结核菌是分枝杆菌属中对人类致病的主要病原菌，其中以人型结核菌感染发病率最高，占结核患者的90％左右，其次为牛型和非洲型结核菌。     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

小鼠结核分枝杆菌耐药模型的建立与评价

目的建立小鼠结核分枝杆菌耐利福平株静脉感染小鼠模型。方法 30只BALB/c雌性小鼠经尾静脉感染结核分枝杆菌耐利福平株每只106CFU,观察小鼠一般状况,并分别在感染后6周、10周、14周处死小鼠,进行脾、肺组织病理切片、抗酸染色、计脏器荷菌数。结果感染后小鼠体重呈逐渐上升趋势,脏器病理变化随时间推移由急性炎症逐渐转为慢性炎症反应,抗酸染色均为阳性,脏器荷菌数与感染剂量相对应,并至少可持续14周。结论成功建立了小鼠结核分枝杆菌耐利福平株静脉感染动物模型,为其进一步用于结核病防治研究奠定了一定的基础。     

结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定

目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 6 5kU基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP6 5的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3.1( )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒进行序列测定。结果 :重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP6 5。结论 :以HSP6 5编码基因为基础的真核表达载体构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础     

TNF对结核杆菌感染小鼠的保护作用及机制的研究

目的 :研究肿瘤环死因子 (TNF)对结核杆菌感染小鼠的保护作用及部分作用机制。方法 :小鼠给予不同剂量的基因重组TNF ,2 4h后感染结核杆菌H37Rv株 ,观察半数死亡时间 ,并测定巨噬细胞的吞噬活性、杀菌功能及NK细胞杀伤活性。结果 :高剂量TNF(1× 10 4 U/只 )缩短感染小鼠半数死亡时间 ,适当剂量 (2× 10 3U/只、5 0 0U/只 )能延长感染小鼠半数死亡时间 ;TNF能提高巨噬细胞的吞噬百分率及吞噬指数 ;提高巨噬细胞的杀菌功能 ;能增强NK细胞的杀伤活性。结论 :适当剂量的TNF对结核杆菌感染小鼠具有保护作用 ,其机制可能与增强MΦ的吞噬杀伤活性及NK细胞的杀伤活性有关。     

TFm·Tb对结核菌H_（37）R_v株感染小鼠脾脏NK细胞活性的影响

用结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ株感染小鼠制备动物模型，在观察感染性小鼠脾脏ＮＫ细胞活性的动态变化的同时，观察结核特异性转移因子（ＴＦｍ·Ｔｂ）对感染性小鼠脾脏ＮＫ细胞活性的影响。以了解ＴＦｍ·Ｔｂ辅助治疗结核病的免疫作用机制。结果表明：小鼠感染结核毒力菌株后，脾脏ＮＫ细胞活性呈现先增强后下降的动态变化，ＴＦｍ·Ｔｂ能增强感染性小鼠的脾脏ＮＫ细胞活性。     

关于结核分枝杆菌定量方法的研究

目的:比较荧光定量PCR法和培养法在结核分枝杆菌定量上是否有差异及探讨应用DNA拷贝浓度替代菌液浓度的可能性。方法:将6种不同浓度的H37Rv标准菌株悬菌液各分为两组:PCR法组和培养法组,并在同一个721型可见光分光光度仪上测定其OD600值。然后,采用荧光定量PCR法,建立结核分枝杆菌DNA拷贝浓度-OD标准曲线,同时对同一标本进行培养并行菌落计数,比较PCR方法和培养法对结核分枝杆菌定量结果是否一致。结果:两种方法对结核分枝杆菌定量无显著性差异(P>0.05)。OD值与DNA拷贝浓度和悬菌液浓度均呈正相关,相关系数分别为1,P<0.01。其回归方程PCR法为:C(H37Rv)=-0.0189+6.991OD,培养法为:C(H37Rv)=-0.0201+6.757OD,OD范围0.1~0.9。结论:荧光定量PCR法和培养法所得结果基本一致,是一种结核分枝杆菌定量新的方法,可替代菌液浓度法应用于动物实验。     

Toll样受体介导H37Rv诱导的单核细胞趋化蛋白-1表达

目的探讨Toll样受体2(TLR2)、TLR4介导的免疫调节信号通路在结核分枝杆菌感染诱导的单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemo attractant protein-1,MCP-1)产生中所起的作用。方法建立人型结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠模型,获取模型组及对照组小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺泡巨噬细胞(alveolar macro-phage,AM),对BALF中AM进行计数,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定BALF中MCP-1水平,Western免疫蛋白印迹(Western blot)方法检测肺组织中MCP-1蛋白含量,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定模型组及对照组AM中TLR2、TLR4mRNA的表达;抗体干预组的AM用TLR2、TLR4抗体预处理并与H37Rv菌株共培养,并设未予以抗体预处理的PBS组及未作任何处理的对照组,分别用ELISA、Western blot法检测AM培养液中及AM中的MCP-1水平,以观察TLR2、TLR4在H37Rv诱导MCP-1生成所起的作用。结果模型组BALF中AM计数及MC...     

应用流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验

目的建立流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验的方法。方法利用结核分枝杆菌水解FDA的特点,选用FDA作为荧光染料,用流式细胞术检测H37Rv标准株,临床分离到的20株结核分枝杆菌对RFP、INH、SM和EMB的敏感性,根据细菌培养物在不同浓度药物作用后所检测到的平均荧光强度与阳性对照的比值,从而推断MIC值,并于传统的绝对浓度法检测结果进行比较。结果20株结核分枝杆菌的流式细胞术所得药敏试验结果与绝对浓度法基本一致。结论所建立的流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验可以应用于临床,并有快速、准确、方便的优点。     

结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的生长抑制作用

目的探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞有生长抑制作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌RelE、RelB、RelBE基因,分别构建真核质粒PcDNA3.1-RelE、PcDNA3.1-RelB和PcDNA3.1-RelBE。经酶切分析和DNA测序证实重组质粒构建成功后,采用脂质体转染方法分别转入肺癌A-549细胞,经RT-PCR鉴定后,建立稳定表达相关蛋白的细胞株。通过细胞生长曲线、活细胞蛋白含量测定、MTT细胞增殖实验、HE染色观察细胞凋亡、流式细胞术检测瞬时转染细胞的凋亡率等,观察结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用。结果结核分枝杆菌RelE毒素蛋白组的肺癌A-549细胞增殖速度低于其他各组,对营养缺乏更为敏感,相同范围视野下凋亡细胞多于其他各组,瞬时转染细胞的凋亡率也高于其他组(P<0.05)。结论结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用。     

结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体。为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法 采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中．扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因．经相应限制性核酸内切酶消化后．插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞．用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果 获得正向插入的pcDNA3.1/ His-HSP65-G2重组表达质粒，表达产物的相对分子量为105kD．与理论预期大小一致．并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3．1／His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论 编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。