结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .     

Ag85B-MPT64融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的 研究Ag85B-MPT64(AM)融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护效果。方法C57BL／6小鼠63只,随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)、空质粒、卡介苗(BCG)、pcDNA／Ag85B、pcDNA／MPT64、pcDNA／Ag85B pcDNA／MPT64、pcDNA／AM组,采用肌肉注射法免疫小鼠,0、3、6周各1次,BCG组只在0周予皮内注射卡介苗1次。末次免疫后第5周用H37Rv经尾静脉注射实施攻击,攻击后6周处死部分小鼠,测血清总IgG,特异性脾淋巴细胞增殖、IFN-γ及IL4分泌水平;观测脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及剩余小鼠的存活时间。结果 AM基因疫苗组诱导的特异性的IgG、脾淋巴细胞增殖和IFN-γ的分泌以及肺、脾组织荷菌量、病理学改变和小鼠存活时间明显优于其他DNA疫苗单独免疫组。结论 AM DNA疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有明显的免疫保护作用。     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫

目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论　应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 .     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的：构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP／Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法：常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0．3mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG）诱导表达产生融合蛋白（MBP／Ag85B）,Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂（Amylose resin）对MBP／Ag85B融合蛋白纯化。结果：重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ／HindⅢ酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40％;Western blot显示,MBP／Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP／Ag85B融合蛋白的纯度可达95％以上。结论：成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。     

结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合基因的克隆表达及生物信息学分析

目的构建结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合表达载体,并进行抗原的生物信息学分析,为候选疫苗筛选奠定基础。方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中分别扩增出Ag85B基因,TB10.4基因,Ag85B-TB10.4;将Ag85B克隆入pET-28a(+)表达载体中,将TB10.4和Ag85B-TB10.4分别克隆入pET-SUMO表达载体中。上述重组质粒转化入大肠埃希杆菌BL21菌中(DE3),经IPTG诱导表达,并对其进行生物信息学分析。结果 (1)成功将结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4,Ag85B-TB10.4基因分别克隆入pET28a(+)和pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导蛋白表达后,对经超声裂解的菌液上清进行SDSPAGE电泳,表明获得了与预期蛋白大小一致的表达产物,重组融合蛋白pET-SUMO-Ag85B-TB10.4蛋白分子质量约为54kDa。(2)生物信息学分析显示Ag85B-TB10.4融合蛋白具有多个潜在抗原位点。结论成功构建了重组质粒pET-28a-Ag85B,pET-SUMO-TB10.4和pET-SUMO-Ag85B-TB10.4,并获得了Ag85B,TB10.4和Ag85B-TB10.4的可溶性原核表达产物;生物信息学分析在Ag85B与TB10.4蛋白加入一段蛋白linker后蛋白的亲水性增强,抗原决定簇面积增大,为后续的功能实验研究奠定了基础。     

融合表达Ag85B-ESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性

目的: 构建融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分泌蛋白Ag85B-ESAT6真核表达载体,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力. 方法: 设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与pGEM-T-easy载体连接后测序. 将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆,分别命名为AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF,将重组质粒电转CHO细胞,RT-PCR检测融合蛋白mRNA的表达,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达;用重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA测定特异性抗体的滴度. 结果: PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致. RT-PCR可检测融合基因转录出mRNA,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光,AZ-pcDNA3-EF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1000,EZ-pcDNA3-AF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1500. 结论: Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功,有望为结核病的预防提供有效的基因疫苗.     

小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

目的研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性。方法将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只。BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次。NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次。在免疫的第2周,4周及最后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平。同时,最后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应。结果构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究。     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后，定向插入pcDNA3.1( ）中，用脂质体法将pcDNA-MPT64转染COS-7细胞。采用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出的MPT64基因正确插入pcDNA3.1中，DNA序列测定无突变产生。重组质粒在COS-7细胞中表达MPT64。结论：成功地构建了pcDNA-MPT64质粒，其真核表达的蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究MPT64在抗结核菌感染中的预防作用奠定了基础。     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。     

结核杆菌抗原Ag85A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:将结核分枝杆菌Ag85A抗原基因克隆并在大肠杆菌中表达.方法:用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85A抗原基因,然后将其插入到原核表达载体pGEX5T中,构建成pGEX5T-Ag85A重组质粒.经IPTG诱导使该基因在E.coli k802菌中表达,亲和层析法纯化蛋白,Western印迹法验证表达蛋白的抗原性.结果:扩增出了约0.9 kb的单一条带,并成功地构建了pGEX5T-Ag85A重组子;经IPTG诱导后,Ag85A蛋白在k802菌中获得了表达,表达的蛋白条带大小约58 000,与预期结果相符;纯化后获得了较单一的蛋白条带.蛋白纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别.结论:成功地克隆了Ag85A抗原基因,并将其在大肠杆菌中进行了表达、纯化,为将其应用于结核病诊断和防治的研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。