耐受性CD8~+ NKT细胞体外增殖能力的鉴定

目的:利用CFSE标记细胞,流式细胞术(FCM)检测法,解析超抗原SEB活化的耐受性CD8+ NKT细胞在体外增殖的情况。方法:利用CFSE标记新鲜分离的C57BL/J鼠脾细胞,分别与ConA和LPS共同培养3d,收集细胞进行荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69分子的表达率和增殖能力。CFSE标记的鼠脾细胞与SEB共培养5d和10d后,荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69的百分数和增殖能力。SEB活化的第10天细胞经CFSE标记后在IL-2的协同作用下继续培养10d,荧光染色,FCM解析这群细胞的增殖能力、活性分子CD69的表达率和NKT细胞亚群的变化情况。结果:ConA、LPS和SEB三者均可以刺激小鼠脾细胞增殖。ConA和LPS在3d内可以使细胞增殖3代,且CD69的表达率为74.19%和41.56%;SEB在5d和10d内分别可以使细胞增殖5代和7代,细胞表面CD69的表达率为32.09%和48.66%。SEB活化的10d细胞可以在IL-2的协同下继续传代培养10d,可以增殖7代;这群细胞中CD8+ NKT细胞亚群,由原始的0.36%增加到38.58%;细胞表面CD69分子由正常值的0.11%提高到83.74%。结论:超抗原SEB活化的CD8+ NKT细胞可以在体外进行增殖培养,且这些细胞是活性化的细胞。利用CFSE标记细胞,FCM可以检测耐受性CD8+ NKT细胞在体外的增殖水平。     

CFSE标记神经祖细胞方法的建立与验证

目的建立并验证羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)荧光探针标记神经祖细胞(NPCs)的方法。方法在胚胎期小鼠侧脑室注射CFSE以标记室周区(VZ)细胞,在注射后的1 h和3 h分别收集组织,通过免疫荧光方法检测其特异性。在注射后的1 h分离出背侧新皮质,通过流式细胞荧光分选术(FACS)分选强阳性细胞,并通过干细胞标志物、神经元标志物等验证。结果 CFSE能够瞬时标记VZ区细胞,标记窗在3～6 h。CFSE进行长时程标记会出现衰减。利用CFSE分选所得细胞70%为神经祖细胞,少量为神经元等。结论 CFSE能够用于瞬时及长时程在体标记。CFSE还可用于分选神经祖细胞,但尚需调整分选策略以提高特异性(FACS)。     

巯基丙酸修饰CdTe量子点光学性能及其生物相容性研究

目的:研究水相合成巯基丙酸(MPA)修饰的CdTe量子点(CdTe QDs)用于对细胞的标记,探讨其与活细胞的生物相容性.方法:水相中合成MPA CdTe QDs;透射电子显微镜、荧光分光光度计及紫外分光光度计表征MPA CdTe QDs;将MPA CdTe QDs与亲和素连接、纯化、制备成MPA CdTeQDs荧光探针;应用激光扫描共聚焦显微术观察MPA CdTeQDs荧光探针标记小鼠腹腔巨噬细胞(PM@)MHC Ⅱ抗原的表达;以黑色素瘤B-16细胞为靶细胞,应用细胞培养和MTT法观察MPA CdTe QDs的生物相容性.结果:水相中合成MPACdTe量子点粒径均匀,具备良好的光学性能,稳定性强;以量子点标记亲和素(QDs-Avidin)作为荧光探针标记小鼠腹腔巨噬细胞MHCⅡ抗原,在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下可见标记细胞具有较强的荧光表达;MPA CdTe QDs在高浓度时有一定的细胞毒性,但是,在用于对细胞进行荧光标记成像的浓度范围内,量子点对细胞活性的影响很小.结论:MPA CdTe QDs大小比较均匀且具有较好的光学性能,不易漂白淬灭,稳定性好,是一种新的良好的荧光标记物;MPACdTe QDs具有较好的生物相容性.     

建立以CFSE标记细胞微球为参照检测人外周血EPC数量的方法及其临床意义

建立以CFSE标记细胞微球做参照,以流式单平台检测EPC数量的方法并评价其临床应用效果。使用流式单平台计数,利用CFSE染色的荧光细胞微球作为内参照,分析标本中的EPC的数量,并与体外克隆计数相比较。基于流式单平台利用CFSE标记细胞微球参照检测人外周血EPC数量和体外克隆计数的结果一致,但是相对体外克隆方法来说,我们建立的方法实验时间和成本明显降低,技术要求也相应降低。基于流式单平台利用CFSE标记细胞微球参照检测人外周血EPC数量的方法能够更快更准确的检测EPC数量,节约时间和成本,更适合临床常规使用。     

Tubulin和HSP90在氧化应激预适应中的作用

目的：探讨热休克蛋白90和细胞骨架蛋白tubulin在氧化应激预适应中的作用。方法:应用不同浓度H2O2作用于HepG2细胞,建立HSP90不同表达量的模型后,MTT比色法检测细胞活力,Western blotting 定量检测各模型中HSP90、tubulin量,激光扫描共聚焦显微镜测定该两种蛋白在对照、预适应、氧化应激、预适应后氧化应激下的分布和共定位。 结果:MTT比色法结果提示预适应可提高应激状态下的细胞生存活力;Western blotting结果显示氧化应激预适应可提高细胞内HSP90 和 tubulin含量,减轻再次应激所致的HSP90 和 tubulin总量下降;激光共聚焦显示该两种蛋白有相似的细胞分布。结论:Tubulin可能协同HSP90在氧化应激预适应中起保护作用。     

流式细胞术检测细胞毒方法的建立

目的：建立一种用流式细胞仪测定细胞介导细胞毒活性的方法。方法：用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞，再用碘化丙碇(PI)标记DNA筛选细胞膜已破坏的靶细胞。效靶比为100：1—6．25：1，共孵育时间为1-6小时，流式细胞仪收集1000个靶细胞并测定被杀细胞的百分率。结果：CFSE是合适的标记靶细胞的荧光染料，18小时后也能很好地区分效靶细胞；靶细胞的自然死亡率低于5％；杀伤百分率随着效靶比和共孵育时间的增加而增加。最佳效靶比为50：1—25：1，共孵育时间为2—4小时。结论：CFSE／PI双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点：避免放射性试剂的应用，敏感性增强，单细胞水平的分析。     

流式细胞术测定淋巴细胞的分裂

为确立流式细胞仪检测淋巴细胞的分裂的新方法 ,利用CFSE标记新鲜分离外周及胸腺淋巴细胞后 ,加入PMA、ConA、抗TCR抗体等培养 3d ,染色进行FACS分析。结果 ,诱导T细胞活化分裂的 3种刺激剂 ,以PMA刺激作用最强 ,ConA次之 ,抗TCR抗体最弱。表明CFSE标记细胞 ,流式细胞仪分析法不仅可以检测单细胞水平上细胞的分裂 ,还可根据荧光强度判断细胞的分裂次数。     

羧基荧光素乙酰乙酸与四甲基偶氮唑盐法检测人脐血间充质干细胞刺激脾淋巴细胞增殖作用的比较

目的 比较羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)与四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测人脐血间充质干细胞(CB-MSCs)和神经分化的CB-MSCs对大鼠脾淋巴细胞(LCs)刺激作用的敏感程度. 方法 分别制备刺激细胞和LCs,将刺激细胞分为4组:1. CB-MSCs组;2. Dif-CB-HSCs组:脐血间充质干细胞培养7d后维甲酸(RA)处理4d诱导其神经分化细胞;3. SH-SY5Y组:人源SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞系)作为阳性对照组;4. Auto-LC组:自体大鼠LCs作为阴性对照组.分别将上述各组刺激细胞与LCs进行混合培养,分别通过酶标仪(MTT法),流式细胞术(CFSE法)检测LCs增殖情况( n =3). 结果 CFSE法和MTT法检测结果 均显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组刺激LCs增殖明显弱于阳性对照组(SH-SY5Y细胞组),但CFSE法检测结果 显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组细胞刺激LCs增殖百分率高于阴性对照Auto-LC组,MTT法检测结果 显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组的吸光度( A )值稍低于阴性对照Auto-LC组. 结论 CFSE法比MTT法能更加客观地反映淋巴细胞增殖情况,在实际应用中更具有优势.     

CIK细胞的生物学特性及荷瘤鼠体内分布特点研究

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)在荷瘤鼠体内的分布规律。方法:用MTT比色法测定CIK细胞对Hela-luc细胞的杀伤作用。以人宫颈癌细胞Hela-luc接种BALB/c裸鼠建立动物模型。体外培养CIK细胞后以荧光染料CFSE标记,经不同途径注射入荷瘤鼠体内。用激光共聚焦显微镜和流式细胞技术检测方法分析CIK细胞在各器官的分布情况。结果:CIK细胞在体外培养14～18天时,细胞数量生长达高峰,此时CD3+CD56+T细胞的数量也达最高值。以10∶1、20∶1、40∶1的比例将效、靶细胞作用48小时后,CIK细胞对Hela-luc细胞的杀伤率分别为(24.08±3.18)%、(51.16±2.64)%、(72.14±4.21)%。CIK细胞经腹腔注射,肿瘤组织24小时达到最高(20.56%),瘤旁注射,肿瘤组织3小时达到最高(25.75%)。结论:CIK细胞在体外对宫颈癌Hela-luc细胞有较强的杀伤作用。CIK细胞在体内分布于肺、肝、肿瘤部位,其分布在各脏器中浓度规律与不同的输注途径有一定关系。针对不同解剖部位的肿瘤可以选择不同的CIK细胞输注途径以最大限度地提高疗效。     

大鼠肝移植术后受体骨髓间充质干细胞输注肝内示踪与标记方法比较

目的采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescin diacetate succinimidyl ester,CFSE）与溴化脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu）两种细胞标记物观测肝移植术后受体骨髓间充质干细胞（MSCs）肝内分布情况,并对两种方法进行比较。方法在已构建的DA-Lewis大鼠原位肝移植模型及提取培养Lewis大鼠MSCs的基础上分别用CFSE和Brdu对Lewis来源的MSCs进行标记．术中经门静脉输注．通过荧光显微镜和免疫组织化学法观测术后2mo内各时间点受体肝组织内MSCs的分布情况。结果CFSE细胞标记率约为（94．1±1．4）％。受体肝组织第1、7、14天内有CFSE标记的MSCs聚集,对照组第5天肝组织内发布的CFSE标记MSCs消失。Brdu细胞标记率约为（90．3±3．5）％。受体肝组织第14天、1个月、2个月可见Brdu阳性的MSCs分布,对照组相应时间点肝组织内未发现Brdu阳性的MSCs。结论CFSE和Brdu均为MSCs的良好标记物。CFSE标记细胞后荧光迅速减弱,适用于短期示踪。Brdu标记细胞后可维持较长时间．适用于长期示踪。两种标记方法均是MSCs较为简单有效的方法,实验显示受体MSCs大部分分布于移植肝脏。     

运用图像处理软件将同视野两种单标记免疫荧光图像合成为双标记图像的方法研究

探讨以计算机图像处理技术将普通荧光显微镜采集的同视野单标记免疫荧光图像合成为双标记图像的方法。应用AdobePhotoshop7.0和ImageJ两个图像处理软件,将普通荧光显微镜采集的同视野单标记荧光图像叠加处理成双标记荧光图像,并同激光扫描共聚焦显微镜获得的同一双标记免疫荧光图像进行比较。普通荧光显微镜采集的单标记荧光图像在分辨率及清晰度上逊于激光扫描共聚焦显微镜采集的单标记图像,但显示的脊髓室管膜细胞形态更为完整,细胞突起较长且更连续。因此,在没有激光扫描共聚焦显微镜时,可用AdobePhotoshop7.0或ImageJ图像处理软件将普通荧光显微镜采集的同视野两种单标记免疫荧光图像合成为保持原有特点、简便而清晰的双标记荧光图像。     

超顺磁性氧化铁和DAPI双标记骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞目前已经成为重要的组织工程种子细胞,而若想深入研究其在体内外增殖、分化的规律,首先需要解决如何能高效、安全地标记骨髓间充质干细胞。 目的：观察超顺磁性氧化铁及DAPI对大鼠骨髓间充质干细胞的双标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用超顺磁性氧化铁及DAPI双标记后分别用普鲁士蓝染色法和激光共聚焦显微镜观察其铁标记率及荧光标记率。用锥虫蓝检测细胞活力;MTT法检测标记干细胞增殖力;Calcein-AM/PI以及AO/PI双染细胞,检测细胞存活率以及凋亡率。 结果与结论：超顺磁性氧化铁及DAPI在体外双标记大鼠骨髓间充质干细胞效率高,可达100%;锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现双标记干细胞组的活力以及增殖力与未标记干细胞组相比差异均无显著性意义(P > 0.05);Calcein-AM/PI染色,未标记细胞及双标记细胞的存活率分别为96%和95%;AO/PI染色,未标记及双标记细胞的凋亡率均为1%。提示超顺磁性氧化铁和DAPI双标记大鼠骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及凋亡无影响。     

一种新的细胞计数方法--磺基罗丹明B染色法

目的:比较磺基罗丹明B(SRB)法与二苯基溴化四氮盐(MTT)比色法细胞计数的灵敏性和稳定性。方法:取4种不同类型对数生长期的细胞,调整细胞的密度为1×106/L,并按比例稀释为0.039×105~10×105个细胞的梯度。(1)用SRB法与MTT比色法测定各细胞梯度相应A值,分别分析两种方法测到的A值与相应细胞梯度细胞数的相关性。(2)SRB法与MTT比色法各随机取100个A值,测量其在2、16、24h及7d后的A值,比较这两种方法的稳定性。结果:SRB法和MTT比色法测定的A值与不同细胞系的细胞数目均有极好的相关性。SRB法测定的结果几乎不随时间而变化;而MTT法测定的结果受时间影响较大。结论:SRB法与MTT比色法相比较更适于进行大规模的细胞计数。     

基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立

目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法.方法:用终浓度分别为3、6、9和12 μg/ml的刀豆素A(ConA)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析.结果:不同浓度ConA刺激后,猪PBMC增殖能力不同,ConA浓度为6 μg/ml时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT试验也获得相似结果.对PBMC刺激5天后进行分析相对较好.结论:建立了一种基于活细胞染料CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平.     

聚焦超声对卵巢癌细胞株COC1细胞凋亡和Bcl-2/bax基因表达的影响

目的:研究低频脉冲的聚焦超声对人卵巢癌细胞株COC1的抗肿瘤作用,并探讨其诱导细胞凋亡的分子机制.方法:以低频脉冲聚焦超声(超声频率0.8 MHz,声强83.6 W/cm2,脉冲持续时间50μs)辐照卵巢癌COC1细胞10秒,采用MTT法观察超声对COC1细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪(FCM)、TUNEL法、荧光染色和光、电镜检测细胞凋亡;应用FCM免疫荧光技术观察Bcl-2、bax基因蛋白表达的变化.结果:低频脉冲聚焦超声可明显抑制存活卵巢癌COC1细胞株的增殖,辐照后12 h、24 h、36 h和48 h,COC1细胞MTT光吸收值与对照组相比显著降低;FCM检测超声辐照后6 h的COC1细胞凋亡率达(23.57±4.62)%;Bcl-2蛋白的荧光指数(FI)降低,而bax蛋白FI升高.同时TUNEL法观察到棕褐色着染的凋亡细胞;荧光显微镜和电镜下观察到凋亡小体形成等典型的形态学改变.结论:低频脉冲聚焦超声辐照对人卵巢癌细胞株COC1具有细胞毒作用,其机制为诱导辐照后存活的人卵巢癌细胞株COC1凋亡,bcl-2和bax蛋白可能参与了COC1细胞凋亡过程.     

135Hz极低频电磁场对HepG-2细胞内Ca^2＋浓度的影响

目的:研究135 Hz(电场强度为80 V·m-1)极低频电磁场(ELF)暴露对HepG-2细胞内Ca2+浓度的影响.方法:采用荧光探针Fluo-3/AM标记细胞内Ca2+,135 Hz ELF照射HepG-2细胞1 h后,利用激光扫描共聚焦显微镜技术测定细胞内Ca2+浓度,加入L-型Ca2+通道拮抗剂硝苯地平,探讨135 Hz ELF影响HepG-2细胞内Ca2+浓度变化的具体机制.结果:未暴露组细胞荧光强度较弱,ELF暴露组细胞荧光强度增高,与未暴露组有统计学意义(P<0.01);用硝苯地平干预组细胞荧光强度减弱,与未干预组有统计学意义(P<0.01).结论:135 Hz ELF可能通过引起L-型Ca2+通道的开放造成HepG-2细胞发生Ca2+超载.     

活体染料CFDA-SE在淋巴细胞增殖研究中的应用

目的 :探讨活体染料CFDA SE在淋巴细胞增殖研究中的应用价值。方法 :利用CFDA SE染色、荧光抗体标记和流式细胞术 ,检测淋巴细胞及其亚群在多克隆刺激剂作用下荧光强度的变化 ,并应用相关软件分析其增殖情况。结果 :PDB ion omycin或ConA刺激 4 8h后均出现淋巴细胞分裂 ,表现为CFSE荧光强度的系列减半。环孢菌素A(CsA)可抑制ConA促进淋巴细胞增殖的作用 ,CFSE荧光无减半。ConA刺激4 8h后 ,出现CD4 T细胞和CD8 T细胞增殖不同步的现象 ,72h后这一现象更加明显。经ModFitTM 软件拟合后 ,得到的各项增殖指标显示 ,ConA对CD8 T细胞的促增殖作用强于对CD4 T细胞的作用。结论 :CFDA SE染色结合荧光抗体标记和流式细胞术 ,是分析淋巴细胞增殖的有力工具     

实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠嗅鞘细胞移植排斥反应研究

目的研究嗅鞘细胞(OECs)的免疫原性及移植实验性免疫性脑脊髓炎(EAE)后颈淋巴系统的反应。方法用新生ICR小鼠嗅球培养出OECs,流式细胞术(FCM)检测其表面主要组织相容性抗原I、II类(MHC-I、MHC-II)诱导型和组成型表达情况。将经荧光染料CFSE标记OECs悬液或PBS注入EAE发病大鼠,收集注射7d后颈部淋细胞,FCM检测CFSE+、抗原提呈细胞标志物CD83+及CFSE+CD83+的表达率,混合淋巴细胞培养检测淋巴细胞增殖率(PI)。结果 OECs组成型表达少量MHC-I分子但几乎不表达MHC-II分子,但能在IFN-γ作用下能显著上调这二类分子。移植实验显示移植OECs的EAE大鼠颈部淋巴结中CD83+、CFSE+及CD83+CFSE+检出率及OECs诱导的PI值均高于对照组或正常大鼠(P<0.05)。同时,PBS注射的EAE大鼠,较正常大鼠亦有较高的CD83+检出率及PI值(P<0.05)。结论 OECs组成型或诱导型表达的MHC分子提示OECs有一定免疫原性,移植后局部淋巴系统可出现针对OECs的抗原引流、提呈及T细胞的活化,进一步分析提示这种免疫反应的启动依赖于EAE的炎性环境。     

流式细胞术检测NK 细胞的细胞毒作用的两种方法比较

目的:比较并优化流式细胞术检测人NK细胞体外细胞毒功能的方法。方法:采用Calcein-AM释放法或CFSE/7-AAD法分别对靶细胞进行标记,按10∶1和20∶1效靶比与7例NK细胞在37℃5%CO2培养箱共培养4 h,流式细胞术测定两种不同标记方法的靶细胞死亡率。结果:各实验组中CFSE/7-AAD法检出的靶细胞死亡率均高于Calcein-AM释放法,在低效靶比、弱细胞毒作用条件下,差异具有统计学意义。细胞毒作用较弱时,Calcein-AM释放法平均荧强度变化不显著、结果误差较大;而CFSE/7-AAD法则能更加敏感地检出靶细胞的死亡率。结论:CFSE/7-AAD法能够特异、灵敏地检出NK细胞的细胞毒活性,所获得的结果更为可靠。     

流式细胞术检测体内细胞毒效应方法的研究

目的 建立一种用流式细胞仪检测体内细胞毒效应的方法.方法 用不同浓度的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞和非靶细胞,以1:1的比例混合靶细胞和非靶细胞,尾静脉回输小鼠,16h后取小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞仪检测CFSE标记靶细胞和非靶细胞的比例,测定体内被杀伤靶细胞的百分率.结果 荧光染料CFSE能有效标记靶细胞,16h后流式细胞仪能很好地检测到体内被杀伤靶细胞的百分率.结论 CFSE荧光染料标记靶细胞并结合流式细胞仪分析的方法能有效地检测到体内细胞毒效应,该技术有望在肿瘤免疫和移植排斥的体内监测中得到广泛应用.