使体外培养的恶性疟原虫同步发育效果的观察

恶性疟原虫体外培养使其与体内发育规律同步是筛选和研究抗疟药的重要方法。Trager等报道恶性疟原虫红内期体外连续培养成功后,Rieckmann又改进了体外微量测定方法,为体外培养的疟原虫用于抗疟药研究创造了条件。Lambros(1979)报道用5％山梨醇处理后达到同步发育。我们采用Lambros的方法,观察其同步发育的效     

体外测定抗氯喹恶性疟原虫方法的改进

近年来,我国云南省及广东省海南岛均发现对氯喹有抗药性的恶性疟原虫。为调查抗性虫株的分布及其抗性程度,并寻找新药,我们采用液氮冻存法将海南岛一恶性疟原虫虫株带回实验室复苏,参照Trager及Jenaen的蜡烛缸培养法培养,用微量法以减虫率作观察指标,测定原虫对药物的敏感性。证明该株对氯喹已产生抗药性,体外培养两个月左右仍有明显抗药性,经连续转种培养3～4个月,抗性自行消失。现将结果     

低温保存的红细胞在体外培养恶性疟原虫上的应用

疟原虫红内期体外培养需供以正常红细胞才能支持原虫生长繁殖,习用ACD或CPD血,置4C下备用。Jensen及Trager报道血库过期的ACD血可供体外培养恶性疟原虫之用,并认为对大量生产恶性疟原虫抗原有很大的现实意义。郭盛琪等介绍制备血浆后的压积红细胞加“706”代血浆,在4C下存放20天仍可用于培养。但上述     

恶性疟原虫抗药性的体外培育

最早报告恶性疟原虫对抗疟药产生抗性的,是1910年Nocht等报告在巴西发现对奎宁(quinine)产生抗药性。以后又发现对乙胺嘧啶(Pyrimethamine)产生抗药性。60年代初期,在哥伦比亚、南美洲、泰国和东南亚地区又分别报道发现恶性疟原虫对氯喹(Chloroquine)产生了抗药性。其后,抗氯喹虫株出现的范围不断地扩大,同时,产生抗药性的药物也不断增多。我国自70年代以来,已先后证实粤、桂、滇、黔、闽、苏,皖、豫等八省(区)均有恶性疟原虫抗氯喹株存在,其中尤以海南岛和云南南部地区最为严重。海南岛近年还出现了恶性疟原虫对喹哌(Piperaqui     

体外连续培养FCC-1/HN株恶性疟原虫红内期超微结构改变的透射电镜观察

将1979年正式定名建株到现在,其间经历了9年反复冻存、复苏、培养的FCC-1/HN株恶性疟原虫,用培养效果明显优于成人血清的10%脐带血清进行体外培养。60天后取培养物用透射电镜观察了疟原虫和其宿主细胞——红细胞近期的超微结构情况。观察结果表明与以往已报道的同株疟原虫相比,除见到了仍有相似之处外;还发现有某些不同的特征性改变:①疟原虫寄生的红细胞,其表面结节完全消失;也未见到典型的茂氏裂隙。②疟原虫虫体胞质内空泡结构和胞质裂隙增多。提示:疟原虫和被寄生的红细胞的超微结构在外界环境条件改变时,也会随之发生一些变化。这些变化,应引起我们今后在以体外培养研究疟原虫的生物学、生理生化和药物筛选中的重视,尤其是免疫学的重视。     

用兔血清培养恶性疟原虫的实验报告

恶性疟原虫体外培养在国内外均已成功,其培养液除含RPMI1640培养粉、HEPES缓冲剂,并用5％NaHCO_3调节pH外,必须添加入血清。因人血清来源困难,且价格昂贵,故寻找代用晶就显得极为重要。我们自1979年8月开始,用兔血清代替人血清连续培养恶性疟原虫400多天,原虫繁殖旺盛,其感染率可高达20％以上,与用人血清同时进行比较无明显差异。兹将实验结果     

恶性疟原虫单克隆抗体保护性机制的实验研究

用体外抑制试验、调理试验和细胞毒试验等方法,对抗恶性疟原虫红内期McAb之功能特性进行了研究。17株McAb中有7株对同步化培养的恶性疟原虫的体外增殖具有明显的抑制作用;抑制强度取决于剂量和作用时间。在McAb—IgG浓度为0.6mg/ml时,上述7株McAb的抑制活性均在94％以上。在6株McAb中,有4株能促进巨噬细胞吞噬疟原虫而发挥调理作用。在7株McAb中,有4株能加强腹腔细胞杀伤和杀死疟原虫而表现出细胞毒活性。结果提示,恶性疟原虫McAb似有“多功能”、“双功能”和”单功能”之分,用“多功能性McAb”纯化的疟疾抗原,在制备疟疾亚单位疫苗方面可能更有意义。     

利用Lifeact法检测恶性疟原虫F-actin的研究

目的通过构建游离表达绿色荧光蛋白融合Lifeact多肽（Lifeact-GFP）的转基因虫株,在不影响恶性疟原虫actin动态平衡的前提下特异标识纤维状肌动蛋白（F-actin）,为研究F-actin在恶性疟原虫中的特性及其对毒力基因的转录调控作用打下基础。方法构建重组转染质粒Lifeact-GFP/p LN,经电转化方法将质粒转入恶性疟原虫3D7标准虫株中,BSD药物筛选获得携带游离Lifeact-GFP/p LN质粒的转基因虫株,并经免疫印迹（Western Blot）和活细胞荧光检测,证实Lifeact-GFP融合基因的细胞内表达,以期通过免疫共沉淀实验（Co-IP）检测Lifeact与恶性疟原虫F-actin的相互作用。结果成功获得了恶性疟原虫Lifeact-GFP转基因虫株,并通过W estern Blot和荧光检测证实Lifeact-GFP成功获得表达;但是,免疫共沉淀实验结果初步显示,Lifeact不能直接结合恶性疟原虫F-actin。结论虽然Lifeact多肽能在酵母等细胞中特异结合F-actin,但是不能直接识别恶性疟原虫F-actin。     

恶性疟原虫氯喹抗性机制研究进展

目的目前疟原虫抗药性已成为全球性严重的公共卫生问题,现有的抗疟药物大部分已产生程度不同的抗药性。研究药物抗性产生的分子机制对研制新型抗疟药、降低抗性产生速率以及对抗性实施监测都具有重要意义。氯喹作为最早发现和使用的最为有效抗疟药物,在大规模用于疟疾治疗后,恶性疟原虫陆续产生对氯喹的抗药性,并且抗性虫株在全球范围迅速播散。近二十年来对氯喹作用机制和抗药性产生的分子机制的研究已取得很大进展。本文将讨论近年来有关氯喹抗性产生相关的分子机制,尤其是与抗药性密切相关的两个基因,即恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因（Pfcrt）与恶性疟原虫多药物抗性基因-1（Pfmdr1）的研究进展。     

恶性疟原虫红内期的体外培养及其影响因素

液氮内保存的FCC—1株恶性疟原虫红内期用蜡烛缸—平皿法体外连续培养40天。疟原虫复苏后培养的第3天原虫密度开始上升.第11天达到最高峰,其中一皿的红细胞含虫率高达20.56%。影响恶性疟原虫体外培养的有关因素如RPMI—1640培养液,血清和红细胞,本文进行了讨论。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的 建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法 采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗,利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条,以镜检和PCR法为对照,用GICA条检测门诊"四热"病人血样,评价其敏感性和特异性,并对其稳定性进行了初步研究。结果 筛选出4株抗LDHpf单抗,间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应,而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western-blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准,GICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37%和86.67%,GICA与镜检法的符合率均为91.55%。结论 GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高,无需特殊仪器设备,有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

恶性疟原虫对S—P抗药性流行病学及机制研究进展

疟疾是世界上危害人类健康最严重的感染性疾病之一。疟原虫尤其是恶性疟原虫对治疗药物产生抗药性是有效治疗疟疾面临的主要问题。恶性疟原虫对氯喹的高水平抗性使许多国家把磺胺多辛-乙胺嘧啶作为一线抗疟药。随着该药的使用，恶性疟原虫的抗性迅速发展。各疟区已有使用该复方治疗失败的报道。本文综述该复方抗药性流行病学的研究、抗药性产生的机制及促使抗药性产生发展的因素。     

虫库FCC_1/HN恶性疟原虫分离株某些生物活性鉴定

为了便于进行疟疾疫苗保护性观察及建立恶性疟原虫克隆株的需要,对虫库保存的恶性疟原虫FCC1/HN分离株进行某些生物特性鉴定。通过体外培养条件变更以观察现存FCC1/HN分离株恶性疟原虫的生长特性,以体外微量法测定该株原虫对氯喹的敏感性及用套式PCR/RFLP分析方法对该株原虫二氢叶酸还原酶基因型进行鉴定。结果显示,现存FCC1/HN株恶性疟原虫对体外培养条件适应性强,对氯喹高度敏感,DHFR基因的第108号编码为AAC突变型。建议对虫库保存的恶性疟原虫FCC1/HN分离株的生物活性定期进行鉴定。     

恶性疟原虫HRPⅡ基因多态性分析

采用ＰＣＲ方法扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）与海南株（ＦＣＣ－１／ＨＮ）富含组氨酸蛋白Ⅱ部分基因序列，对扩增片段进行了限制性内切酶分析及部分基因序列测定，用ＰＣＧＥＮＥ软件对恶性疟原虫ＰＦＤ－３／ＹＮ、７Ｇ８及Ｄ１０３个虫株部分ＨＲＰⅡ基因序列进行了比较分析。结果显示ＨＲＰⅡ在３个虫株间存在不同程度的差异，我国疟原虫虫株无ＨＲＰⅡ基因缺失突变现象。     

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因 Pfmdr1多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫：Pfmdrl基因中的关键性点突变是否与海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性有关。方法采用套式PCR法分别扩增Pfmdrl基因中含有第86位和1246位氨基酸的多态性片段,并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析,观察是否存在突变位点。结果45个样本中,Pfmdrl基因第86位氨基酸均未发生点突变,即86位密码子是Asn而非突变型的Tyr;Pfmdrl基因发生D1246Y突变的样本有3个,其中1个是抗性株,2个为敏感株。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与Pfmdrl基因的多态性无显著关系。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗，利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，以镜检和PCR法为对照，用GICA条检测门诊“四热”病人血样，评价其敏感性和特异性，并对其稳定性进行了初步研究。结果筛选出4株抗LDHpf单抗．间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应，而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western—blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准，CICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37％和86．67％．DICA与镜检法的符合率均为91．55％。结论GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高，无需特殊仪器设备，有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

恶性疟原虫地理株体外培养及vat基因转录方法的建立

目的建立恶挫疟原虫地理株连续体外培养方法,并采用荧光定量PCR技术分析培养虫株var基因转录类型。方法采用常规RPM11640培养基和添加AlbumaxIl等成分,建立2株恶性疟原虫地理株的体外培养,并采用荧光定量PCR技术检测中晚期虫体var基因转录变化。结果成功体外连续培养2株恶性疟原虫野生株,并建立了荧光定量PCR检测var基因转录的方法,用该方法检测出该虫株var基因优势转录类别。结论建立的疟原虫体外培养方法和var基因转录检测技术可用于我国恶性疟原虫var基因致病作用的分析。     

恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序

目的克隆、测定恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)成熟疟原虫感染红细胞表面抗原(MESA)基因序列，并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫palo-alto株MESA基因已知序列，设计合成四对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列，拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因片段，酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明，FCC1／HN株MESA全基因编码区长4102bp，A T含量为72．11％，G C含量为27．89％，有1个内含子；编码1323个氨基酸残基，分子量为154470u。序列分析表明，FCC1／HN株与Palo-aho、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性，序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析，有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因序列。FCC1／HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

恶性疟原虫体外连续培养

美国洛克菲勒大学寄生虫学系主任、国际著名的寄生虫学家Traget教授与Jensen合作研究恶性疟原虫(P. falciparum)体外连续培养于1976年获得成功。他们的培养方法很快在美国和欧洲的其他实验室内得到证实。恶性疟原虫体外连续培养的成功对疟原虫各方面的研究有重大的意义。为了介绍Trager体外连续培养恶性疟原虫的方法,最近中华民人共和国卫