转染人诱导型一氧化氮合酶基因对鼠颈动脉新生内膜增生的抑制作用

目的 研究腺病毒介导的人诱导型NO合酶基因经内膜转染对球囊损伤后鼠颈动脉新生内膜的抑制作用及对血一氧化氮(NO)浓度的影响。方法 建立鼠颈动脉球囊损伤模型，将LacZ重组腺病毒(AdLacZ)和人诱导型一氧化氮合酶基因重组腺病毒(Adinos)在体内分别转染损伤动脉节段，以HE染色、计算机图像处理方法观察转染动脉节段新生内膜增生情况；用硝酸还原酶法测定动脉血中NO浓度。结果 与AdLacZ转染组及未转染组比较，Adinos基因转染组鼠颈动脉血中NO浓度在转染后7天和14天都显著提高；转染4周后未转染组、AdLacZ转染组、Adinos基因转染组的新生内膜面积分别为0．78mm^2、0．75mm^2及0．17mm^2；管腔狭窄率分别为74．9％、79．5％及24。6％。结论 转染Adinos基因可显著提高NO浓度并显著抑制损伤动脉节段新生内膜增生及管腔狭窄。     

自体血管移植后内膜增生与eNOS mRNA表达关系的实验研究

目的探讨自体血管移植后内膜增生的机制以及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和内膜增生的关系。方法建立自体动脉静脉血管搭桥模型,分成静脉组、游离动脉组和非游离动脉组,分别于移植后1-10周切取移植段血管,进行组织形态学检查观察内膜增生情况,以及运用原位杂交分子生物学方法检测血管壁eNOS mRNA的表达。结果静脉组内膜增生最为明显,而非游离动脉组无明显内膜增生。同一时间点静脉组eNOS mRNA表达信号明显低于游离动脉组（6周内）（P〈0.01）,而非游离动脉组eNOS mRNA表达信号与正常血管无差别。静脉组和游离动脉组血管壁eNOS mRNA表达与血管搭桥后内膜增生显著相关。结论静脉桥eNOS mRNA表达比动脉桥弱是静脉桥内膜增生明显的重要机制。     

联合转染eNOS基因和反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的：探讨联合转染eNOS基因和反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响。方法：制作20只自体颈静脉腹主动脉移植Wistar大鼠模型，实验组、对照组各10只，实验组移植血管行腺病毒介导的eNOS溶液泡和反义ET核酸凝胶涂布，对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。要后2周取出植物血管，利用病理学、免疫组织化学、RT－PCR方法检测移植血管内膜厚度、管腔狭窄度、内膜VSMC数及PCNA阳性表达、血管ETmRNA、eNOS、mRNA表达情况。结果：实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减小或减少，PCNA阳性表达及ETmRNA表达较对照组减少，而eNOSmRNA表达则明显增加。结论：联合传染eNOS基因和反义ET核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生，是一种有效的防治移植静脉再狭窄的基因疗法。     

腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

腺病毒介导的eNOS基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC)的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 :构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC ,应用聚合酶链 (PCR)、逆转录PCR(RT PCR)技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率 ;应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果 :外源性eNOS基因成功导入了VSMC ;VSMC中有eNOS基因mRNA的表达 ;外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后 ,可显著抑制VSMC的生长 ,DNA合成减少。结论 :腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC ,并可有效抑制细胞生长。     

内皮型一氧化氮合酶基因转染在兔颈静脉移植血管桥中的表达

目的:研究腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因在兔自体移植颈静脉中的表达,寻找预防移植血管再狭窄的方法.方法:建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,18只兔随机等分为3组,A:对照组,B:空载腺病毒液感染组,C:eNOS基因转染组.在兔颈外静脉颈总动脉旁路移植术中,分别应用空载腺病毒液或AdCMVeNOS血管桥内注入法感染移植静脉1 h.术后4 wk,应用多聚寡核苷酸探针原位检测方法检测外源性基因mRNA的表达;免疫组织化学染色方法检测eNOS蛋白的定位;HE及弹力纤维染色后,应用计算机图像分析系统检测移植静脉内膜、中膜增生情况.结果:人内皮型一氧化氮合成酶基因在自体移植静脉中表达出相应的mRNA和蛋白质;术后4wk,与对照组相比,空载腺病毒液感染组移植静脉内膜和中膜厚度无明显变化;eNOS基因转染组移植静脉内膜和中膜厚度分别减少42.3%,13.5%,内膜厚度/中膜厚度比值(I/M)减少34.6%.结论:腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因成功转染兔自体移植颈静脉中并有效表达,eNOS基因具有防治移植静脉内膜增生作用.     

eNOS基因转染治疗兔肺动脉高压及肺动脉高压危象

目的 探讨复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMVeNOS）介导内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染对左向右分流所致的肺动脉高压及肺动脉高压危象兔的影响。方法 18只肺动脉高压模型兔分成实验组（n=9）和对照组（n=9）,实验组气管内滴入AdCMVeNOS病毒转染液（5×109PFU/mL）2mL,对照组滴入生理盐水2mL。4d后结扎左向右分流,同时气管插管吸入10％氧气,检测两组肺动脉收缩压(SPAP)、肺动脉平均压（MPAP）和平均动脉压（MAP）的变化;同时采用硝酸还原酶法测定肺组织一氧化氮（NO）浓度,检测外源性eNOS基因mRNA的表达。结果 实验组肺动脉压较转染前明显下降（P<0.01）,而对照组肺动脉压无明显改变,与实验组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。缺氧60min后,实验组仅4只兔出现肺动脉高压危象,而对照组全部出现肺动脉高压危象。两组缺氧后均出现氧分压（PaO2）降低,二氧化碳分压（PaCO2）升高, SPAP、MPAP升高,MAP降低。恢复供氧后,实验组各测得值恢复至正常水平,对照组SPAP和MPAP高于基础值,MAP低于基础值(P<0.01),实验组SPAP、 MPAP和PaCO2的升高幅度以及MAP和PaO2的降低幅度均低于对照组（P<0.01）。免疫组化染色显示实验组肺泡内皮细胞、肺中小血管的平滑肌细胞和内皮细胞的eNOS表达均较对照组明显增加,而且肺组织的NO浓度也明显高于对照组(P<0.001)。琼脂糖凝胶电泳显示,实验组在3.77kb处扩增出特异条带,而对照组在3.77kb处未扩增出特异条带。结论 AdCMVeNOS转染左向右分流所致的兔肺动脉高压动物模型,可有效降低肺动脉压和肺动脉高压危象的发生率。     

降钙素基因相关肽转基因对同种异体移植血管病变的防治作用

目的 研究降钙素基因相关肽(CGRP)转基因对同种异体移植血管病变(AV)的防治作用,探讨其作用机制.方法 大鼠分3组:(1)转染Ad5-CGRP-EGFP组(A组),(2)转染Ad5-EGFP组(B组),(3)未转染基因组(C组).分别于术后4周、8周取标本,行病理、细胞凋亡检查,观察CGRP、EGFP基因及VCAM-1、iNOS表达.结果 A组术后4周CGRP表达阳性,A组、B组术后4周EGFP基因表达阳性.A组术后4周、8周管腔闭塞指数低于B组和C组.A组术后4周细胞凋亡指数(AI)低于B组和C组.免疫组化显示,A组术后4周VCAM-1表达低于B组和C组,A组iNOS表达仅术后4周内膜低于B组和C组.结论 CGRP基因转染后有效地防治了术后4周AV.     

eNOS基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓来源内皮祖细胞中的表达分析

目的探讨eNOS基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPCs）中的表达与作用。方法将eNOS基因插入载体PSUCMV中构建重组质粒PSUCMVeNOS,经酶切、插入、转染后包装扩增成腺病毒颗粒;大鼠胫骨获取骨髓,制备EPCs,鉴定正确后传代纯化,将三代细胞随机分为PBS对照组（C组）、Lac基因转染组（L组）和eNOS基因转染组（N组）。分别于干预后第1天、第3天、第7天观察各组细胞形态的变化,检测培养液中NO含量和各组细胞eNOS表达的变化。结果AdCMVeNOS病毒DNA成功包装成完整的病毒颗粒,测其滴度为1．58×10^10 PFU／mL;将其转染鉴定正确的EPCs,结果于体外转染后1d内,即可检测到eNOS转基因产物的表达增加;N组同一时点eNOS含量明显高于L组、C组,组间比较差异显著;组内比较,N7、N3与N1组比较差异显著。随时间延长NO生成量递增,第3天与第7天结果差异有显著性。结论eNOS基因可在大鼠EPCs中高效表达,并可促使培养液中NO含量明显增高。     

磁性壳聚糖纳米介导eNOS基因转染受损平滑肌细胞初探

目的:探讨磁性壳聚糖(后简称磁聚糖)纳米载体对血管平滑肌细胞的毒性及介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因对受损血管平滑肌细胞的转染效率、表达及对细胞增生的影响。方法:原位共沉淀法制备磁聚糖并耦合eNOS质粒;MTT法检测磁聚糖对血管平滑肌细胞生长的毒性;分别以重组腺病毒表达载体(AdCMV-eNOS)、磁聚糖-eNOS和磁聚糖空载体在外加磁场下转染受损血管平滑肌细胞,免疫荧光染色及RT-PCR测定eNOS表达,流式细胞术检测转染效率及血管平滑肌细胞周期和凋亡情况。结果:在浓度低于20 mg.ml-1时,磁聚糖对血管平滑肌细胞的生长无明显毒副作用;磁聚糖-eNOS组转染效率[(58.7±3.6)%]较AdCMV-eNOS组[(78.1±2.5)%]低,但两组均检测到eNOS mRNA和蛋白表达,且两组受损血管平滑肌细胞G0/G1期细胞较磁聚糖空载体组明显增多(P<0.01),S/G2-M期细胞减少(P<0.01),3组的细胞凋亡无显著差异(P>0.05)。结论:正常浓度的磁聚糖对血管平滑肌细胞生长无抑制作用,该载体能成功介导eNOS基因的转染,延缓受损后血管平滑肌细胞增生周期。     

腺病毒介导的TIMP-4基因转染抑制血管损伤后新生内膜形成

目的 :应用腺病毒介导的转基因方式转染人组织型金属蛋白酶抑制剂 4 (TIMP 4 )基因 ,以观察TIMP 4对球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法 :体外培养血管平滑肌细胞 (VSMC)并转染含有TIMP 4基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdTIMP 4 ) ,采用单层培养细胞刮片法 ,观察TIMP 4对细胞迁移的影响 ;以大鼠颈总动脉球囊损伤模型为研究对象 ,损伤后即刻经血管外膜分别转入盐水、空载腺病毒载体和含有TIMP 4基因的腺病毒载体 ,观察细胞迁移和新生内膜形成情况。结果 :培养的VSMC转染AdTIMP 4后 ,细胞迁移明显受到抑制 ,与对照组相比抑制率为 6 3.9% (P <0 .0 1) ;在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中 ,转基因后 4d时生理盐水组、空载腺病毒组和转染AdTIMP 4组内弹力板内的细胞数依次为 (32 .5± 4 .8)个细胞、(33.8± 7.0 )个细胞和 (8.2± 2 .4 )个细胞 ,转染TIMP 4可以显著抑制血管损伤后细胞向内膜的迁移 ;血管损伤后 2 8d时 ,转染TIMP 4组新生内膜面积与中膜面积比值与对照组相比降低了 6 6 .5 % (P <0 .0 1) ,空载腺病毒组与生理盐水组之间差异无显著性。结论 :TIMP 4可以抑制培养的VSMC的迁移 ,局部干预可以明显抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后细胞的迁移和血管新生内膜的形成。     

TNF-α对人脐静脉内皮细胞中NO和eNOS的影响

目的 讨论肿瘤坏死因子-α（TNF—α）对内皮细胞一氧化氮（NO）产生及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性的影响。方法 以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为实验材料，检测与不同浓度TNF—α作用不同时间后．细胞培养上清液和细胞中NO水平的变化，以及细胞eNOS活性的改变。结果 （1）随着TNF—α浓度的升高，eNOS的活性减弱，而细胞和上清液中NO的含量增加；（2）随着干预时间的延长，eNOS的活性减弱；而细胞和上清液中NO的含量在作用24h后升高，且明显高于对照组；（3）L一单甲基精氨酸（L—NMMA）和地塞米松（DXM）均能阻断TNF-α引起的细胞和细胞上清中NO的表达增加。结论 TNF-α降低eNOS活性，却在高浓度和长时间作用后增加NO的合成，可能与激活诱导型一氧化氮合酶有关，因为NO的变化可以被L—NMMA和DXM阻断。     

蛋白激酶C对脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶基因表达的调控作用

目的　探讨脂多糖 (LPS)诱导单核 巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)基因表达的分子机制。方法　用LPS刺激诱导RAW2 64 .7细胞 ,观察其对蛋白激酶C(PKC)的激活 ,用Griess还原法测定PKC抑制剂对LPS诱导的一氧化氮 (NO)生成作用 ,并用逆转录PCR(RT PCR)研究其对iNOS基因表达的影响 ;构建iNOS荧光素酶报告基因载体 ,用基因转染及报告基因检测等方法研究LPS刺激RAW2 64 .7细胞对iNOS启动子活性的诱导作用及PKC对其影响。结果　LPS刺激RAW2 64 .7细胞引起PKC磷酸化激活和膜移位 (P <0 .0 1 ) ;LPS刺激RAW2 64 .7细胞 1 2h后即可明显诱导NO生成 (30 .1μmol L± 5 .4μmol L ,P <0 .0 1 )和iNOS基因表达 ;PKC抑制剂H 7可抑制NO的生成 (P <0 .0 1 )和iNOS基因表达 ;LPS刺激诱导iNOS启动子的转录活性 [(2 5 .3± 4 .6)相对荧光素酶活性单位 ,P <0 0 1 ] ,用H 7和钙离子通道阻滞剂异搏定均可抑制其转录活性 (P <0 .0 1 )。结论　LPS刺激RAW2 64 .7细胞 ,通过引起细胞内钙增加和PKC激活诱导iNOS基因表达 ,使NO生成增加 ,这是内毒素休克时NO增加的一个重要的信号机制     

诱导型一氧化氮合酶基因在3T3细胞中的转染和鉴定

目的 :观察人诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)基因转染 3T3成纤维细胞的可能性。　方法 :用阳性脂质体将含人iNOS基因的真核表达载体pcDNA3.0 iNOS转染至 3T3成纤维细胞 ,用G4 18筛选 ,通过RT PCR、免疫组化的方法鉴定。　结果 :pcDNA3.0 iNOS基因转染的 3T3细胞有人iNOS基因mRNA和iNOS蛋白的表达。　结论 :iNOS基因能在 3T3成纤维细胞得到稳定转染和表达 ,能为模拟体内一氧化氮 (NO)作用提供有力的工具。     

溶栓前后PTE患者血浆上调内皮细胞eNOS基因表达

目的 观察急性肺血栓栓塞（FFE）患者溶栓前后血浆一氧化氮（NO）水平的变化,以及对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表达的影响。方法 采用硝酸还原酶法测定PTE患者溶栓前及溶栓4h后血浆NO浓度,溶栓前后患者血浆孵育HUVEC,RT—PCR检测eNOS mRNA的表述变化,western blot检测eNOS蛋白的表达变化。结果 急性肺血栓栓塞溶栓前后患者血浆NO水平均高于正常人血浆NO水平,且差异均有显著性（P〈0．05）;而患者溶栓前后血浆NO水平相比,差异无显著性（P〉0．05）;患者溶栓前后血浆孵育HUVEC,随时间变化,其eNOS mRNA及蛋白表达均逐渐增强,相同时间点两组eNOS mRNA及蛋白的表达差异均无显著性（P〉0．05）,但均高于正常血浆孵育组（P〈0．05）。结论 PTE患者血浆NO水平显著上升,溶栓后4h内其NO水平无明显变化,P1E患者血浆能够上调HUVEC的eNOS基因表达。     

一氧化氮合成酶基因多态性与冠心病的关系

目的：测定中国汉族人群内皮型一氧化氮合成酶基因（eNOS）G894T多态性,研究其在中国汉族人群中的分布以及与冠心病的关系。方法：对127例冠心病患者和110例正常人检测eNOS基因多态性。结果：中国汉族人群eNOS基因有GG、GT、TT三种基因型,GT＋TT型与GG型和G、T等位基因频率在正常人和冠心患者中比较无差异（P〉0.05）。结论：中国汉族人群eNOS基因多态性与冠心病无关。     

辐射诱导性自杀基因在胰腺癌细胞中的表达

目的 利用辐射敏感的早期生长反应基因1(Egr-1)启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK),观察其在胰腺癌细胞中的表达效果.方法 以细菌内同源重组法构建含绿色荧光蛋白(GFP)做标志基因的TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胰腺癌细胞系PC-3 60Co-γ射线照射后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析各不同照射剂量组TK基因的mRNA表达.Western印迹法分析60Co-γ射线照射后转染pAdEgr-1-TK细胞中TK蛋白质的表达量.结果 重组腺病毒载体pAdEgr-1-TK转染胰腺癌细胞系PC-3,不同剂量60Co-γ射线照射后,经RT-PCR半定量分析,TK mRNA表达结果分别为0 Gy(67.3±2.1)%、5 Gy为(89.3±1.0)%、7.5 Gy为(114.7±5.7)%、10 Gy为(140.5±3.1)%、15 Gy为(134.5±4.0)%、20 Gy为(117.4±3.4)%,各照射组TKmRNA表达均明显高于对照组0 Gy(均P<0.01),尤以剂量为10.0 Gy时最为显著.Western印迹分析结果分别为0 Gy为(5.4±0.7)%,5 Gy为(7.6±0.9)%,7.5 Gy为(21.5±1.5)%,10 Gy为(35.7±1.4)%,15 Gy为(32.1±1.2)%,20 Gy为(28.8±1.5)%,60Co-γ射线照射可明显提高转染pAdEgr-1-TK细胞中TK的蛋白质表达量,且蛋白质表达量与辐射剂量呈正相关性.结论 放射敏感性启动子Egr-1基因可驱动TK自杀基因在胰腺癌细胞中高效表达.     

腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)的表达。方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定;用Pme I线性化后去磷酸化的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ 5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。用重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP对MSCs进行转染,并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果:pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ 5183中成功地发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论:采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中,并得到有效表达,且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况,这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。