雌激素受体β1对乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮间质转化影响的初步研究

目的将雌激素受体ERβ1真核表达质粒转染到人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,观察外源性ERβ1基因转染MDA-MB-231细胞后对E-cadherin、Vimentin等基因表达和细胞上皮间质转化的影响,探讨ERβ1在乳腺癌发生发展中的生物学作用机制。方法应用脂质体法将ERβ1真核表达质粒转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别用实时荧光定量PCR、Western Blot检测转染前后细胞中ERβ1、E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达的变化;并用细胞增殖曲线显示转染后细胞增殖能力的改变。所有数据以±s表示,多个样本均数间的比较用单因素方差分析,组间比较采用SNK法。细胞生长曲线变化采用重复测量方差分析。结果外源性ERβ1真核表达质粒转染组MDA-MB-231细胞较未转染组ERβ1、E-cadherin mRNA和蛋白水平明显增强（P〈0.010）,Vimentin mRNA水平明显减少（P〈0.010）,细胞增殖能力明显减弱。结论 ERβ1可能参与抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的上皮间质转化过程。     

雌激素受体β1对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的观察雌激素受体β1（ERβ1）被阻断后对Bax和Bcl-2表达的影响,探讨ERβ1在乳腺癌中的生物学作用机制。方法应用脂质体法,将针对人ERβl基因的siRNA转染人类乳腺癌细胞株MDA—MB-231。分别用Real time-PCR、Western Blot检测ERβ1被干扰前后细胞中ERβ1、Bcl-2、Bax等基因mRNA和蛋白表达水平的变化;通过细胞增殖曲线观察ERβ1基因被干扰后细胞增殖活性的变化;采用流式细胞仪分析细胞凋亡率的改变。计量资料的比较采用t检验或单因素方差分析。结果RNA干扰技术阻断乳腺癌MDA—MB-231细胞ERβ1基因的表达后,ERβ1 mRNA和蛋白水平显著下降（P〈0．05）,生长曲线显示细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）;pSilencer—ERβ1转染组细胞的Bax基因mRNA及蛋白水平显著下降（P〈0．01）,Bcl-2基因的表达未发生变化,Bcl-2／Bax比值明显上升;pSilencer-ERβ1转染组细胞凋亡率较未转染组明显减少（t=6．22,P=0．00）。结论ERβ1可通过调控细胞凋亡相关基因Bax而促进细胞的凋亡,是ERβ1抑制细胞增殖的原因之一。     

ERβ1对乳腺癌MCF-7细胞Efp基因表达的抑制作用

目的 了解雌激素受体β1（ERβ1）对雌激素敏感性指状蛋白（Efp）基因的调节作用,为进一步探讨ERβ对Efp基因的调控机制奠定基础.方法 应用脂质体法将ERβ1真核表达质粒转染至乳腺癌MCF-7细胞中,再用Western blot检测转染细胞中Efp蛋白表达的变化.MTT比色试验观察ERβ1真核表达质粒转染后MCF-7细胞增殖活性的变化.结果 外源性ERβ1真核表达质粒组MCF-7细胞较未转染组MCF-7细胞Efp蛋白表达明显减弱.ERβ1基因转染后的MCF-7细胞的增殖活性降低.结论 ERβ1基因的表达可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞中Efp基因的表达,并抑制MCF-7细胞的增殖能力,可能在乳腺肿瘤发生、发展机制中具有重要的作用.     

外源性FHIT基因对人乳腺癌MDA-MB-436细胞恶性表型的影响

目的:研究外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达对乳腺癌MDA-MB-436细胞增殖的影响并探讨其机制.方法:通过脂质体将外源性FHIT基因的真核表达质粒PEGFP-FHIT和空载体分别转染FHIT表达缺失的乳腺癌细胞MDA-MB-436.MTT法分析细胞增殖,流式细胞术观察细胞的凋亡,蛋白质印迹法检测外源性FHIT基因及凋亡相关基因Caspase-3、-8、-9的蛋白表达.结果:PEGFP-FHIT组细胞的生长抑制率和凋亡率明显高于空载体组和对照组,PEGFP-FHIT组细胞Caspase-3、-9活性片段表达上调.结论:外源性FHIT基因表达能抑制MDA-MB-436细胞增殖,其机制可能是通过激活Caspase途径从而诱导细胞凋亡.     

小分子RNA干扰 MTA1基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物活性及相关蛋白表达的影响

目的:采用短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中转移相关基因(metastasis-associated gene 1,MTA1)的表达,并观察其对15-脂氧合酶-2(15-lipoxygenase-2,15-LOX-2)、p53及bcl-2表达的影响.方法:将shRNA-MTA1载体质粒稳定转染MDA-MB-231细胞,MTT法检测细胞增殖抑制情况,FCM法检测细胞周期及凋亡情况,RT-PCR和Western印迹法检测MTAl、15-LOX-2、p53及bcl-2 mRNA和蛋白表达情况.结果:shRNA-MTA1能明显降低MTA1基因在MDA-MB-231细胞中的表达量;抑制MDA-MB-231细胞的增殖,诱导其凋亡,并使细胞被阻滞在G1期,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01).转染shRNA-MTA1可使MDA-MB-231细胞中15-LOX-2和p53 mRNA及蛋白的表达明显增强(P<0.01),而 MTA1和bcl-2 mRNA表达明显减弱(P <0.01).结论:MTA1基因可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖,诱导其凋亡,该作用可能与上调细胞中15-LOX-2和p53的表达,下调bcl-2的表达有关.     

KOZAK序列对乳腺癌MDA-MB-231细胞CCNL1基因表达的影响

目的:探讨KOZAK序列对细胞周期调节蛋白1(CCNL1)基因在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达的影响。方法:构建pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K(含有KOZAK序列)的真核重组表达质粒,采用Fugene HD转染试剂将重组表达质粒转染入MDA-MB-231细胞,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K重组质粒在MDA-MB-231细胞中表达的差异。结果:在MDA-MB-231细胞中质粒pcDNA3.1-CCNL1-K比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量要高;而质粒pcDNA3.1-CCNL1比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量也高。结论:在MDA-MB-231细胞中,质粒pcDNA3.1-CCNL1-K较pcDNA3.1-CCNL1的mRNA和蛋白表达水平均存在差异,KOZAK序列能够提高CCNL1基因在MDA-MB-231细胞中的表达。     

外源性TGFBI抑制乳腺癌细胞生长的体内外实验

目的 研究转化生长因子β诱导基因 (transforming growth factor-β induced gene, TGFBI) 是否能抑制人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)的体内外增生。方法 将外源性TGFBI稳定转染到人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中,测定细胞增殖率、细胞周期、软琼脂克隆形成率及P21、P53蛋白表达变化,检测乳腺癌细胞的致瘤性。结果 外源性TGFBI在人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中能够稳定地高表达;外源性TGFBI可以明显地抑制乳腺癌细胞因血清生长因子刺激的增生;与转染空质粒的对照组细胞V23101比较,外源性TGFBI相对软琼脂克隆形成数减少了90.89%; TGFBI可以使人乳腺癌细胞阻滞在G1期,延缓其进入S期的时间。外源性TGFBI可以延长裸鼠肿瘤发生的潜伏期,并降低肿瘤发生率。结论 TGFBI能够抑制人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)的体内外增生。     

NRP-1过表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3生物学行为的影响

目的 通过上调乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3中NRP-1的表达,观察NRP-1对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法 构建pcDNA3.1-NRP-1表达载体,脂质体介导NRP-1 表达质粒转染MDA-MB-231、SK-BR-3细胞,用G418筛选出稳定转染的乳腺癌细胞株。利用RTqPCR、Western blot法分别检测NRP-1基因mRNA及其蛋白表达;CCK-8法、AnnexinⅤ-APC/7-AAD法、Transwell小室分别检测转染细胞增殖率、凋亡率及侵袭、迁移能力。结果 成功构建pcDNA3.1- NRP-1表达载体,转染MDA-MB-231、SK-BR-3细胞并筛选稳定表达系。与对照组相比,过表达组细胞的NRP-1 mRNA及蛋白表达水平明显升高（均P<0.05）;NRP-1过表达组的细胞较对照组增殖率增加、凋亡率降低、侵袭及迁移能力增强（均P<0.05)。结论 NRP-1在乳腺癌发展、浸润、转移中起着一定的作用,它可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。     

KOZAK序列对乳腺癌MDA-MB-231细胞CCNL1基因表达的影响

目的：探讨KOZAK序列对细胞周期调节蛋白1（CCNL1）基因在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达的影响。方法：构建pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K（含有KOZAK序列）的真核重组表达质粒,采用Fugene HD转染试剂将重组表达质粒转染入MDA-MB-231细胞,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K重组质粒在MDA-MB-231细胞中表达的差异。结果：在MDA-MB-231细胞中质粒pcDNA3.1-CCNL1-K比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量要高;而质粒pcDNA3.1-CCNL1比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量也高。结论：在MDA-MB-231细胞中,质粒pcDNA3.1-CCNL1-K较pcDNA3.1-CCNL1的mRNA和蛋白表达水平均存在差异,KOZAK序列能够提高CCNL1基因在MDA-MB-231细胞中的表达。     

ING4基因表达对乳腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的：研究人ING4基因对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用。方法：通过实时荧光定量-PCR（real-time fluorogentic quantitative-PCR，RFQ-PCR）检测3种乳腺癌细胞株中ING4 mRNA的表达水平；ING4基因的表达质粒转染MCF-7细胞；MTT法和FCM法检测ING4基因对MCFM细胞增殖的影响；Annexin-V／PI双染法观察细胞凋亡情况；RT-PCR法分析转染／NG4后p53、p21及bax基因的转录表达情况。结果：在3种乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-435和MDA-MB-231中ING4的表达均明显低于正常乳腺组织。转染ING4表达载体的MCF-7细胞较对照组细胞生长速度减慢（P〈0．05）；细胞周期中G1期比例增加，S期比例减少；细胞凋亡率升高。p53的表达未见明显变化，而p21和bax表达显著上调。结论：ING4与乳腺癌的发生发展具有一定相关性；高表达ING4基因能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长。     

沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞周期的影响

目的研究miRNA(microRNA)沉默p65基因后对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞周期分布的影响。方法用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体构建p65 miRNA表达质粒,转染MDA-MB-231细胞,用RT-PCR检测转染前后各组细胞中p65 mRNA表达变化;凝胶电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验研究转染前后细胞中NF-κB结合活性的变化;流式细胞术(Flow cytometry, FCM)观察转染前后细胞周期分布的变化;Westernblot法检测转染前后细胞周期相关因子cyclinD1、CDK4、p21蛋白表达的变化。结果p65 miRNA质粒明显下调MDA-MB-231细胞中p65 mRNA的表达水平,并显著抑制细胞中NF-κB的结合活性(P<0.05)。FCM结果显示,转染组细胞G₀/G₁期细胞比例显著增加,S、G₂/M期细胞比例明显下降(P<0.05);Western blot分析结果显示,沉默p65基因后细胞中cyclinD1蛋白表达下调,p21蛋白表达增加。结论p65 miRNA可以显著降低p65 mRNA的表达,诱导乳腺癌细胞发生G₀/G₁期阻滞,可能是通过降低cyclinD1蛋白,上调p21蛋白表达而实现的。     

Rac1蛋白调控乳腺癌MDA-MB-231细胞分泌血管内皮生长因子的研究

目的探讨Rac1蛋白对乳腺癌MDA-MB-231细胞分泌血管内皮生成因子(VEGF)的调控作用。方法在乳腺癌MDA-MB-231细胞中分别转染Rac1正显性真核表达质粒(V12Rac1组)及空白对照质粒(空白对照组)和Rac1小干扰RNA(siRac1组)及对照小干扰RNA(沉默对照组)后,通过ELISA分别检测转染后24、48、72 h由MDA-MB-231细胞分泌的VEGF蛋白水平;通过Western blot检测各组血管生成相关因子p53和VEGF表达的变化。两组Western blot定量分析数据比较采用t检验,VEGF分泌数据采用重复测量的方差分析。结果 ELISA分析结果显示:当MDA-MB-231细胞中高表达Rac1时,细胞分泌的VEGF水平随着时间的延长而逐渐升高,与空白对照组相比组间差异有统计学意义(组间比较:F=837.122,P0.001;不同时间点比较:F=57 806.374,P0.001;交互作用:F=7 663.095,P0.001);当MDA-MB-231细胞中低表达Rac1时,细胞分泌的VEGF水平随着时间的延长逐渐升高,但低于沉默对照组,差异有统计学意义(组间比较:F=511.891,P0.001;不同时间点比较,F=268.078,P0.001;交互作用:F=120.708,P=0.001)。Western blot结果显示,当MDA-MB-231细胞高表达Rac1,与空白对照组相比,p53蛋白表达降低(t=-6.392,P=0.003),VEGF蛋白表达升高(t=7.497,P=0.002);当MDA-MB-231细胞中低表达Rac1,与沉默对照组相比,p53蛋白表达增加(t=5.307,P=0.006),VEGF蛋白表达降低(t=-7.395,P=0.002)。结论在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,Rac1表达高低可以引起细胞分泌VEGF的水平变化,Rac1可能通过抑制p53表达而增加VEGF表达。     

MAGE-A9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中P53转录活性及功能的影响

目的：探讨黑素瘤相关抗原-A9（melanoma-associated antigen,MAGE-A9）对人乳腺癌细胞中P53转录活性及功能的影响。 方法：通过LipofectamineTM 2000体外转染质粒pcDNA3.0、pcDNA3.0-p53、pCMV6-MAGE-A9 和pcDNA3.0-p53/MAGE-A9至人乳腺癌MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting检测细胞中 p21WAF1 mRNA和蛋白的表达,荧光素酶报告基因分析检测细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶表达活性,MTT法检测转染不同质粒对MDA-MB-231细胞增殖的影响。 结果： 转染pcDNA3.0-p53/MAGE-A9组MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 mRNA和蛋白表达水平均明显低于pcDNA3.0-p53组\[(0.15±0.01) vs (0.18±0.02),(0.03±0.00) vs (0.06±0.01);均P<0.05\]。转染pcDNA3.0-p53质粒可以增强MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶的表达\[(58.56±3.47) vs (1.00±0.12),P<0.01\],转染pcDNA3.0-p53/MAGE-A9后,MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶的表达较转染pcDNA3.0-p53组明显降低\[(22.02±4.91) vs (58.56±3.47),P<005\]。与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-p53组MDA-MB-231细胞增殖率明显明显降低\[(228.89±2239)% vs (337.23± 23.67)%,P<0.05\];而pcDNA3.0-p53/MAGE-A9组MDA-MB-231细胞增殖率明显高于pcDNA3.0-p53组\[(291.51±591)% vs (228.89±22.39)%,P<0.05\]。 结论： MAGE-A9可抑制MDA-MB-231细胞中P53的转录活性及细胞增殖。     

siRNA下调EIF4E基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和周期的影响

目的:应用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)乳腺癌MDA-MB-231细胞中真核细胞翻译起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor 4E, EIF 4E )基因的表达,探讨其对乳腺癌细胞增殖和生长周期的影响。方法:构建针对EIF 4E 基因的siRNA表达质粒,采用脂质体法将表达质粒pGPU6/GFP/Neo-EIF4E转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞;分别采用RT-PCR、Western 印迹法和免疫细胞化学法检测转染EIF4E siRNA后, 对MDA-MB-231细胞中EIF4E及cyclinD1 mRNA和蛋白的表达水平的影响;MTT法、平板克隆形成实验和FCM检测MDA-MB-231细胞增殖活性、克隆形成率及细胞周期。结果:成功构建EIF4E siRNA表达质粒。RT-PCR、Western 印迹法和免疫细胞化学法检测结果显示,MDA-MB-231细胞中EIF4E及cyclinD1 mRNA和蛋白表达均明显下降(P <0.05)。转染EIF4E siRNA组细胞生长缓慢,集落形成数明显减少,与空白对照组和转染空载体组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,EIF4E siRNA转染组G1期细胞所占百分比为(71.30±0.47)%, 较空白对照组的( 53.10±0.43)%明显增加,而S期细胞所占百分比为(12.53±0.13)%,较空白对照组的(26.47±0.38)%明显减少(P<0.05)。结论:EIF4E siRNA可显著下调EIF4E基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达水平,在一定程度上抑制乳腺癌细胞的增殖,有可能成为临床治疗乳腺癌的靶点之一。     

结缔组织生长因子转染对人乳腺癌细胞系生物学行为的影响

背景与目的:结缔组织生长因子(CTGF)是CCN家族成员之一,参与体内多种生理和病理生理过程。本研究探讨CTGF对人乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法:构建含有CTGF开放读码框的真核表达质粒,通过脂质体介导的方法将正义质粒转染MCF-7细胞,反义质粒转染MDA-MB-231细胞。观察CTGF不同表达水平与乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期分布和体外侵袭等生物学行为的关系。结果:转染正义质粒使MCF-7细胞CTGF表达上调,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,细胞发生G0G1期阻滞,体外侵袭能力下降。转染反义质粒使MDA-MB-231细胞CTGF表达下调,促进细胞增殖,减少细胞凋亡,增强细胞体外侵袭能力,但对细胞周期无影响。结论:CTGF具有抑制乳腺癌细胞生长和侵袭的功能。促进细胞凋亡是CTGF抑制乳腺癌细胞体外生长的机制之一。CTGF可能对细胞周期有一定的影响。     

过表达外源FUT7对乳腺癌细胞黏附及迁移能力的影响

目的 观察过表达外源岩藻糖基转移酶VII（FUT7）对人乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附和迁移能力的影响。方法 构建以FUT7为靶基因的真核表达载体pEGFP-C1-FUT7,转染人乳腺癌MDAMB-231细胞,采用RT-PCR检测FUT7 mRNA的表达;Western blot检测FUT7及其催化产物sLeX蛋白水平;细胞黏附实验及Transwell小室检测转染后细胞与HUVECs细胞黏附、迁移能力。结果 转染细胞外源FUT7表达在mRNA水平和蛋白水平及sLeX含量均明显增加;转染的乳腺癌细胞黏附和迁移能力明显增强。 结论 过表达外源FUT7基因可增强人乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附和迁移能力。     

异黏蛋白调控三阴性乳腺癌细胞干性的机制研究

目的研究异黏蛋白(MTDH)对三阴性乳腺癌干性的调控机制,并探讨miR-30a-5p对MTDH的调控作用。 方法(1)回顾性分析2017年5月至2018年9月湖北医药学院附属太和医院手术治疗的37例三阴性乳腺癌患者的肿瘤组织标本及同期非三阴性乳腺癌手术切除标本37例。采用免疫组织化学方法检测所有标本中MTDH的表达。(2)用定量RT-PCR和Western blot检测MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468 4种细胞系中MTDH的mRNA和蛋白表达。(3)为了探讨MTDH对三阴性乳腺癌细胞干性、细胞增殖及Wnt/β-catenin信号通路的影响,用MTDH的siRNA转染三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468(siMTDH组),无效干扰RNA转染的细胞作为对照组。用Western blot检测MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞系中干细胞标志物sox2、Nanog及CD133相对表达量,用细胞克隆实验观察细胞克隆数,用Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Myc和cyclin D1的表达。(4)荧光素酶报告实验：为评估miR-30a-5p能否靶向调控MTDH,用MTDH的3′-UTR和miRNA-30a-5p合成含有MTDH 3′-UTR野生型和突变型荧光素酶报告质粒,分别转染HepG2细胞,pGL3空载体转染细胞作为空载体组,24 h后观察荧光。三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌组织中MTDH蛋白表达比较用t检验。4种细胞系中MTDH mRNA及蛋白表达比较用方差分析。对照组与siMTDH组中sox2、Nanog、CD133、β-catenin、Myc、cyclin D1蛋白表达及细胞克隆数比较用t检验。细胞相对荧光比值比较采用方差分析。组间两两比较采用LSD法。 结果(1)三阴性乳腺癌组织中MTDH蛋白相对表达量为2.82±1.37,而非三阴性乳腺癌组织为5.65±2.02,差异有统计学意义(t＝-7.046, P<0.001)。(2)在4种细胞系(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-10A)中,MTDH mRNA表达比较,差异有统计学意义(F＝7 155.320, P<0.001)。两两比较结果显示：与正常乳腺细胞(MCF-10A)比较,乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468)中MTDH mRNA表达增加(P均<0.001);与MCF-7比较,MDA-MB-231、MDA-MB-468中的MTDH mRNA表达量更高(P均<0.001);MDA-MB-468中的MTDH mRNA表达低于MDA-MB-231细胞(P<0.001)。4种细胞系中,MTDH蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(F＝90.053, P<0.001)。两两比较结果显示：与正常乳腺细胞比较,乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468)中MTDH蛋白相对表达量增加(P均<0.050);与MCF-7比较,MDA-MB-231、MDA-MB-468中的MTDH蛋白相对表达量更高(P均<0.050);MDA-MB-468中的MTDH蛋白相对表达量低于MDA-MB-231细胞(P<0.050)。(3)在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中,对照组与siMTDH组的干细胞标志物sox2、Nanog及CD133相对表达量比较,差异均有统计学意义(MDA-MB-231：1.19±0.10比0.52±0.05,1.16±0.13比0.34±0.03,1.19±0.06比0.54±0.08,t＝10.304、10.959、11.700,P＝0.001、0.005及P<0.001;MDA-MB-468：1.26±0.05比0.34±0.02,1.19±0.07比0.52±0.04,1.21±0.02比0.37±0.01,t＝31.185、15.584、75.001,P均<0.001);对照组与siMTDH组的细胞克隆数比较,差异均有统计学意义(MDA-MB-231：87.33±9.02比33.33±3.51,t＝9.664,P＝0.001;MDA-MB-468：70.67±4.73比24.33±3.21,t＝14.041,P<0.001);对照组与siMTDH组的Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Myc及cyclin D1蛋白表达比较,差异均有统计学意义(MDA-MB-231：0.26±0.06比0.08±0.01,0.74±0.03比0.32±0.00,0.72±0.01比0.26±0.04,t＝5.115、21.222、21.690,P均<0.050;MDA-MB-468：0.33±0.03比0.15±0.06,0.56±0.04比0.22±0.02,0.65±0.02比0.31±0.02,t＝4.973、13.969、21.897,P均<0.001)。(4)荧光素酶报告实验结果显示：3组细胞相对荧光比值比较,差异有统计学意义(F＝174.189,P<0.001),空载体组与突变型质粒转染组的相对荧光比值均高于野生型质粒转染组(P均<0.001)。 结论miR-30a-5p可靶向调控MTDH,参与三阴性乳腺癌细胞干性调控,miR-30a-5p/MTDH通路可能是一个新的治疗靶点。     

沉默UHRF1对乳腺癌细胞增殖和转移的影响

目的 探讨UHRF1对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖以及侵袭的影响及其相关机制。方法 采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测沉默UHRF1基因后对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力的影响;应用克隆形成实验检测沉默UHRF1后对乳腺癌MDA-MB-231细胞存活的影响;吖啶橙-溴乙锭(AO/EB)检测沉默UHRF1后对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响;Caspase-3活性试剂盒检测沉默UHRF1后乳腺癌细胞Casapse-3活性的变化;Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bad、p-Bad、XIAP、p53、p21^Cip1/Waf1和p16^INK4a的表达;应用Transwell实验研究沉默UHRF1对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响;Wound Healing实验研究沉默UHRF1后对其迁移能力的影响。结果 沉默UHRF1使乳腺癌MDA-MB-231细胞活力降低;克隆形成实验结果显示沉默UHRF1后MDA-MB-231细胞存活能力降低,AO/EB染色显示沉默UHRF1促进MDA-MB-231细胞凋亡。同时Caspase-3活性实验结果显示沉默UHRF1后乳腺癌MDA-MB-231细胞Caspase-3的活性增加;Western blot结果显示,沉默UHRF1后,能够使凋亡蛋白Bad、XIAP和Bax的表达上调,同时抗凋亡蛋白p-Bad,Bcl-2的表达下调,也使p53,p21Cip1/Waf1,p16^INK4a蛋白表达升高;Transwell以及Wound Healing实验证明沉默UHRF1能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和迁移。结论 沉默UHRF1能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞活力和存活,并抑制乳腺癌MDA-MB-231的侵袭和迁移。沉默UHRF1通过调控p53,p21Cip1/Waf1,p16^INK4a信号发挥作用。     

着丝粒关联蛋白1在乳腺癌中的过度表达及其对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖克隆和凋亡的影响

目的 研究着丝粒关联蛋白1(KNTC1)在乳腺癌组织和细胞中的表达、功能及其发挥功能的潜在机制。方法 下载癌症基因组图谱乳腺癌中的RNA-seq数据,一般线性模型估算KNTC1在不同组间的差异。qRT-PCR检测人乳腺癌细胞MDA-MB-231、T-47D、MCF-7中KNTC1的mRNA表达水平。使用含有目的基因RNA干扰序列的慢病毒技术敲减MDA-MB-231细胞中KNTC1表达,用qRT-PCR和Western blot检测细胞中KNTC1 mRNA和蛋白质表达水平。Celigo细胞计数和克隆形成试验检测细胞生长和增殖状况;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 KNTC1在乳腺癌组织中高度表达。KNTC1在MDA-MB-231、T-47D和MCF-7细胞中的表达丰度均为高,在MDA-MB-231细胞表达最高。与对照组比较,实验组MDA-MB-231细胞中KNTC1表达后,细胞生长与增殖能力显著下降(7.82±0.73、0.89±0.04;t=17.259,P=0.003),细胞的克隆形成能力显著降低(75±2、5±2;t=121.244,P<0.001),细胞凋亡明显增加[(4....     

蛋白激酶SGK3过表达对乳腺癌细胞株MDA-MB-231影响的研究

目的 血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3 (serum and glucocorticoid-inducible protein kinase 3,SGK3)参与细胞增殖、分化和物质转运等生命活动,在某些肿瘤形成中担任重要角色.本研究设计观察SGK3过表达对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖和存活的影响,并初步探讨其作用的分子机制.方法 免疫组化方法检测乳腺癌组织中SGK3蛋白的表达;通过GenEscortTMⅠ介导用重组质粒pEGFPN1-SGK3瞬时转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,荧光显微镜和蛋白质印迹法鉴定转染细胞中融合蛋白SGK3-GFP的表达;细胞增殖实验观察转染细胞的生长增殖情况;流式细胞术分析转染细胞的细胞周期时相变化;蛋白质印迹方法检测细胞增殖与存活相关基因的表达.结果 SGK3在乳腺癌组织中的表达量明显高于癌旁组织和正常乳腺组织(F=29.672,P＜0.001),与二者组间比较,均P＜0.01.荧光显微镜下可见转染细胞因外源基因的表达而发出绿色荧光,且蛋白质印迹法检测可见融合蛋白SGK3-GFP的表达;过表达SGK3的MDA-MB-231细胞,其细胞生长速度加快,细胞倍增时间缩短(F=19.557,P-0.001),与亲本细胞及转染空载体细胞组间比较均P＜0.01.与亲本细胞和转染空载体组比较,SGK3过表达使细胞凋亡比例明显下降(F=12.156,P=0.008),与前两者组间比较P值分别为0.019和0.030;细胞内源性Bad的表达量降低(F=11.152,P=0.010),与前两者组间比较P值分别为0.008和0.005;而Bcl-xL(F=8.810,P=0.016,与前两者组间比较P值分别为0.014和0.009)以及p-GSK3β(F=42.253,P＜0.001,与前两者组间比较P值分别为＜0.001和0.009)的表达量均升高.结论 乳腺癌组织高表达SGK3,SGK3过表达可促进MDA-MB-231细胞的增殖与存活,影响细胞增殖与存活相关基因的表达可能是其发挥作用的主要分子机制.