染色体驱动蛋白KIF4A对胃癌细胞迁移和转移的影响

目的 前期的研究证实,染色体驱动蛋白KIF4A在胃癌组织中低表达, 过表达KIF4A抑制了胃癌细胞的增殖。本研究进一步研究KIF4A与胃癌细胞迁移与转移的关系,从而为胃癌临床治疗提供新的治疗靶点。方法 应用组织芯片和免疫荧光染色技术研究胃癌及其周围淋巴结组织中KIF4A蛋白分子的表达差异性;利用细胞小分子RNA干扰和Transwell迁移实验,检测KIF4A对细胞迁移运动能力的影响。结果 65%(26/40)的胃癌组织中KIF4A蛋白分子表达水平低于周围的淋巴结组织;KIF4A的表达水平与胃癌组织的TNM分期密切相关;KIF4A蛋白分子的表达随胃癌转移侵袭能力的增强而降低;抑制胃癌细胞内KIF4A蛋白分子的表达明显增强胃癌细胞的迁移运动能力。结论 染色体驱动蛋白分子KIF4A通过抑制胃癌细胞的迁移运动能力参与控制胃癌的临床转移过程。     

阿霉素对人乳腺癌细胞MCF-7表达KIF4A的抑制作用

目的：探讨阿霉素对人乳腺癌细胞MCF-7表达KIF4A的影响。方法：用Western blotting方法检测阿霉素处理MCF-7细胞后不同时间该细胞表达的KIF4A蛋白;用不同浓度的阿霉素处理MCF-7细胞96h后,检测KIF4A蛋白,并进行衰老相关半乳糖苷酶染色。结果：与未用阿霉素处理的MCF-7细胞相比,阿霉素处理的MCF-7细胞表达KIF4A蛋白降低;衰老相关半乳糖苷酶染色率由5%提高到42%,染色阳性的细胞形态亦呈衰老样变。结论：阿霉素处理MCF-7细胞可使KIF4A蛋白表达水平降低,KIF4A蛋白表达降低与阿霉素引起MCF-7细胞衰老的关系有待进一步研究。     

驱动蛋白4A:驱动蛋白超家族的新成员

马达蛋白(motor protein)为细胞内组分的运输提供动力,使其能够沿着肌动蛋白纤维和微管向两极运动.迄今为止一共发现了三种马达蛋白家族:肌球蛋白家族(myosin)、驱动蛋白家族(kinesin)和动力蛋白家族(dynein).分子马达中的驱动蛋白家族和动力蛋白家族负责细胞内沿微管的所有运动,动力蛋白为真核细胞中沿鞭毛和纤毛的弯曲运动以及胞质各种组分运输提供动力,驱动蛋白为这些组分的其它运输形式提供动力.驱动蛋白利用ATP水解释放的能量沿微管运输不同胞内组分.其沿微管的运动具有两个重要特征:首先,单个具有两个头部的驱动蛋白分子能够以0.5μm/s的速度运动很长距离.     

RNAi沉默HPC2对鼻咽癌细胞迁移侵袭的影响及分子机制

目的 探讨HPC2在鼻咽细胞迁移侵袭中的作用及机制。方法 选取鼻咽癌5-8F细胞,采用小RNA干扰技术沉默HPC2的表达后,分3组进行功能实验,即Scrambled阴性对照组、#1 siRNA-HPC2组和 #2 siRNA-HPC2组,运用划痕实验比较细胞迁移愈合速率,Transwell检测比较各组细胞侵袭能力,Western blot法检测EMT通路关键分子的变化。结果 与对照组比较,HPC2沉默组的细胞迁移愈合速率及侵袭能力降低,差异有统计学意义(P<0.05)。从机制研究上发现,HPC2沉默后,Snail下调,MMP9下调。结论 沉默HPC2表达能降低鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力,机制上可能通过HPC2/snail/MMP9轴发挥作用。     

Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响

目的研究RNA干扰Nek2表达对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响以及相关的分子机制。方法设计合成3条针对Nek2基因的siRNA,转染至SKOV3细胞中,采用Real-time RT-PCR和Western blot技术筛选出抑制效率最高的Nek2-siRNA序列,用Transwell方法检测转染该序列的SKOV3细胞侵袭能力的改变,并用Western blot方法检测Nek2-siRNA转染后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达的变化。结果①RNA干扰序列2对SKOV3细胞中Nek2的抑制效果最明显;②与未转染组和阴性对照组相比,转染了Nek2-siRNA的SKOV3细胞侵袭能力明显下降(P<0.01);③Western blot检测表明,与未转染组和阴性对照组相比,Nek2-siRNA转染48 h后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显下调,而TIMP-1的表达明显上调(P<0.01)。结论 Nek2-siRNA能有效得沉默SKOV3细胞中Nek2的表达,通过下调MMP-2、MMP-9的表达,上调TIMP-1的表达,从而抑制SKOV3细胞的侵袭转移。     

干扰乳酸脱氢酶A表达对ErbB2高表达乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 探讨体外干扰乳酸脱氢酶A（LDHA）表达对人类表皮生长因子受体2（ErbB2）高表达乳腺癌SK-BR-3和MDA-MB-453细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制。方法 用siLDHA转染（以转染scramble siRNA为阴性对照）SK-BR-3和MDA-MB-453细胞干扰LDHA的表达;Western blot法检测LDHA蛋白表达水平;Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力;采用乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒测定细胞的LDH活性;采用葡萄糖和乳酸检测试剂盒分别测定培养基中的葡萄糖浓度和乳酸浓度,计算细胞对葡萄糖的摄取量和乳酸生成量。结果 与阴性对照组比较,siLDHA下调SK-BR-3和MDA-MB-453细胞LDHA的蛋白水平（ P<0.01）;降低细胞的迁移和侵袭能力（ P<0.001）;下调SK-BR-3细胞的LDH活性,减少两种细胞葡萄糖摄取量和乳酸生成量,差异均有统计学意义（ P<0.05）。结论 干扰LDHA表达通过降低糖酵解从而抑制ErbB2高表达乳腺癌细胞的迁移和侵袭。     

VEGF的RNAi对卵巢癌细胞SKOV3生物学活性的影响作用

目的检测靶向血管内皮生长因子（VEGF）的短发夹RNA（shRNA）质粒载体对卵巢癌细胞株sKov3生物学活性的影响作用。方法构建携带有GFP报告基因的vEGF—shRNA质粒载体,脂质体转染方法转入卵巢癌细胞株SKOV3．通过流式细胞术检测细胞的转染效率,RT-PCR及Westem blot检测转染细胞内vEGF—mRNA及蛋白的表达变化,MTT法检测细胞增殖抑制率．人工基底膜侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果VEGF-ShRNA稳定转染后,SKOV3细胞内VEGF-mRNA及蛋白表达水平显著下降;VEGF—shRNA对SKOV3细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑增殖效应呈时间依赖性;VEGF—shRNA组可有效抑制SKOv3细胞的人工基底膜体外侵袭能力。结论VEGF在卵巢癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用,通过RNA干扰技术实现VEGF沉默在卵巢癌的生物治疗中具有较好的应用前景。     

KIF4A在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的：探讨人结直肠癌组织中染色体驱动蛋白KIF4A的表达及其临床意义。方法：收集110例手术切除的结直肠癌及相应癌旁5 cm以上结直肠黏膜组织标本,采用免疫组织化学方法检测其中KIF4A的表达情况,并分析KIF4A的表达水平与结直肠癌患者临床病理特征及其预后之间的关系。结果：结直肠癌组织中KIF4A的表达显著高于癌旁5 cm以上结直肠黏膜组织（P < 0.001）;KIF4A的表达水平与结直肠癌患者的分化程度（P=0.023）、淋巴结转移（P=0.020）、远处转移（P=0.032）、TNM分期（P < 0.001）和血清癌胚抗原（CEA）水平（P=0.014）有关,而与患者性别、年龄、肿瘤大小等无关（P > 0.05）。在随访的110例结直肠癌患者中,Kaplan?Meier生存曲线显示,KIF4A高表达组的5年生存率明显低于KIF4A低表达组（P < 0.05）。单因素生存分析显示,KIF4A表达程度、肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及血清CEA水平与结直肠癌患者术后生存时间相关。多因素COX比例风险回归模型进一步分析显示,KIF4A表达水平、TNM分期、淋巴结转移和远处转移为结直肠癌患者预后的独立危险因素。结论：KIF4A在结直肠癌组织中高表达,并且其高表达与结直肠的侵袭转移密切相关,KIF4A对于术后结直肠癌患者的预后评估具有参考价值。     

Clusterin基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞增殖与侵袭的影响

目的通过RNA干扰技术抑制卵巢癌SKOV3细胞分泌型clusterin(sCLU)基因的表达,研究其对卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法通过脂质体介导靶向sCLU基因的siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞,实验分为4组:实验组(sCLU-siRNA+脂质体)、阴性对照组Ⅰ(negative control siRNA+脂质体)、阴性对照组Ⅱ(sCLU-siRNA)、空白对照组(等体积的完全培养液)。RT-PCR和蛋白质印迹分析法检测sCLU表达;利用MTT法、Transwell小室体外侵袭实验及流式细胞仪AnnexinⅤ/PI法检测评价sCLU基因抑制后对卵巢癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。结果靶向sCLU基因的siRNA明显、特异性地抑制了sCLU mRNA和蛋白的表达水平;MTT实验结果显示实验组细胞增殖能力较各对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪AnnexinⅤ/PI法检测结果显示实验组细胞凋亡率较各对照组明显升高,达到(15.84±1.53)%,较空白对照组升高了约9%,差异有统计学意义(P<0.01)。侵袭实验结果提示实验组细胞侵袭能力受到明显抑制,实验组穿膜细胞数量为(26.52±6.22)个/视野,较各对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 sCLU基因沉默明显抑制了卵巢癌SKOV3细胞的增殖、侵袭能力,并增加了其凋亡率,sCLU基因有望成为卵巢癌治疗的新靶点。     

shRNA抑制外源绿色荧光蛋白在肝癌细胞株中的表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)的短发夹状RNA(shRNA)，观察其在哺乳动物细胞中抑制外源GFP的表达。方法：设计、合成含GFP编码基因片段，中间被4个bp间隔的反向重复序列，与转录载体pTZU6 1连接，构建pshRNA-GFP重组质粒，与pEGFP-C1共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721，检测其对GFP表达的影响。结果：pshRNA-GFP对共转染的pEGFP-C1中的绿色荧光蛋白有明显的抑制作用，抑制率达70％～85％。结论：构建的pshRNA-GFP重组质粒能有效地抑制GFP在哺乳动物细胞中的表达。     

消癥抑癌方对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移的影响

目的 探讨消癥抑癌方对人卵巢癌细胞SKOV3增殖和迁移的影响及潜在作用机制。方法 利用网络药理学分析消癥抑癌方抗卵巢癌的关键活性成分和核心靶点,并通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析筛选其相关生物学过程和通路。制备消癥抑癌方含药血清,用含药血清处理卵巢癌SKOV3细胞。采用CCK-8法和EdU染色法检测消癥抑癌方含药血清对SKOV3细胞增殖的影响;采用划痕实验和Transwell迁移实验检测消癥抑癌方含药血清对SKOV3细胞迁移的影响;采用Western blotting法检测消癥抑癌方含药血清对SKOV3细胞自噬蛋白(P62)、自噬相关蛋白3(ATG3)、微管相关蛋白1轻链3 B(LC3B)及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白的影响。结果 网络药理学研究显示,消癥抑癌方抗卵巢癌的关键活性成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素、汉黄芩素、柚皮素等,核心靶点是MAPK3、AKT1、SRC、MAPK1、TP53等。KEGG富集分析共得到171条通路(P<0.01),其中Degree值排名较靠前且与...     

Genistein对人卵巢癌细胞系SKOV3诱导内皮细胞迁移的作用及机制探讨

目的:研究Genistein对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3诱导人内皮细胞系ECV-304迁移的作用,以探讨Genistein抑制血管生成作用的机理.方法:采用微孔滤膜培养小室及双室联合细胞培养方法,观察在0.5%BS培养条件下,SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移以及Genistein对SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移的影响;用免疫组化方法检测血管生长因子VEGF、bFGF及TGFβ-l蛋白的表达水平.结果:SKOV3细胞或其条件培养基对内皮细胞均有较强的趋化作用,Genistein对SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移有呈剂量依赖性的抑制作用.20μmol/L Genistein处理ECV-304细胞48h后,VEGF、bFGF蛋白的表达水平降低,而TGFβ-1蛋白的表达水平升高.结论:GenIStein可明显抑制人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3及其条件培养基对人内皮细胞系ECV-304细胞的诱导迁移作用Genistein可能通过抑制促血管生成调节因子VEGF和bFGF的蛋白表达,增强血管生成的负性调节因子TGFβ-1的蛋白表达来抑制这种迁移诱导作用.     

Survivin—siRNA治疗膀胱移行细胞癌的动物实验研究

目的:构建survivin特异性短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并以其修饰人膀胱移行细胞癌细胞株T24,评价其在体内的抑制肿瘤生长增殖的作用.探讨其在膀胱移行细胞癌(TCCB)T24细胞中的作用.方法:设计、合成survivin特异性的短链寡核苷酸,克隆到PTZU6+1质粒载体中.构建survivin特异shRNA表达载体.转染T24细胞;通过PTZU6+1质粒载体介导.成功建立了表达survivin的膀胱移行细胞癌细胞株T24/survivin-siRNA,拟在体内研究survivin-siRNA对膀胱移行细胞癌生长、增殖的影响.建立裸鼠皮下种植瘤模型,观察肿瘤形成时间和观察肿瘤形成时间,以及计算抑瘤率;HE染色行组织学检查;SABC法测定survivin,评估survivin在PTZU6+1介导的survivin-siRNA治疗膀胱移行细胞癌后的表达.结果:未转染组、空载体组共发生肌肉侵润6例,可见肌纤维的溶解、断裂等;皮下注射含survivin-siRNA的转染组细胞所形成的种植瘤的时间显著地延长,与其它两组比较有显著性差异(P<0.01);含survivin-siRNA的转染组所形成的种植性膀胱癌的体积明显受到抑制,与未转染组、空载体组有明显差异(P<0.01);survivin-siRNA转染组的抑瘤率为68.93%,与未转染组、空载体组相比较有显著差异;survivin-siRNA转染组survivin的阳性表达率降低.结论:应用PTZU6+1质粒载体构建survivin的shRNA表达载体,成功建立了表达survivin的膀胱移行细胞癌细胞株T24/Survivin-siRNA,有效抑制了survivin蛋白的表达,在体内实验中表明可以抑制T24细胞移植瘤的生长,诱导T24细胞的坏死、凋亡.     

RNA干扰技术抑制鼻咽癌细胞内源性绿色荧光蛋白的表达

目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的鼻咽癌细胞株;观察不同转染浓度的短发卡状RNA对鼻咽癌细胞内源性GFP的抑制效率及细胞毒性.方法:转染pEGFP-N1至鼻咽癌细胞株HNE1,G418筛选获得稳定表达GFP的HNE1-GFP细胞株;利用针对GFP基因的短发卡状RNA表达载体shGFP,以不同浓度shGFP转染HNE1-GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,软件分析荧光抑制效率,MTT检测细胞毒性,RT-PCR检测GFPmRNA水平改变,Western Blot检测GFP蛋白水平改变.结果:绿色荧光稳定表达于传代HNE1细胞中;shGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达,抑制效率分别为49.7%,84.8%,86.7%且无细胞毒性;GFP在mRNA和蛋白水平的表达均有明显下降.结论:稳定表达GFP的鼻咽癌细胞株成功建立;RNA干扰载体可抑制鼻咽癌细胞中GFP的表达,其抑制效率有明显的浓度依赖性且无明显细胞毒性.该系统能够用于鼻咽肿瘤的RNA干扰机制研究中.     

沉默Nek2基因对卵巢癌SKOV3细胞周期的影响

目的：研究RNA干扰NIMA相关激酶2（Nek2）表达对卵巢癌细胞SKOV3细胞周期的影响及其相关的分子机制。方法将针对Nek2基因的siRNA转染至SKOV3细胞中,采用流式细胞技术检测SKOV3细胞周期变化,并用Westernblot技术检测Nek2‐siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48h后,与细胞周期相关的因子cyclinB1、CDK1及P27蛋白表达水平以及ERK1／2磷酸化水平的变化。结果空白对照组、阴性对照组和RNA干扰组中处于G2／M期的细胞比例分别为13．72％、12．27％和1．56％,与两对照组比较,处于G2／M期的干扰组细胞明显减少（P＜0．05）。Nek2基因沉默后,与两对照组比较,SK‐OV3细胞内cyclinB1和CDK1的蛋白表达水平明显下降,P27的蛋白表达水平明显上调,SKOV3细胞内ERK1／2磷酸化水平明显下降（P＜0．05）。结论沉默Nek2基因,可阻止卵巢癌SKOV3细胞启动有丝分裂,从而抑制其增殖。     

Rac1蛋白在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞株SKOV3增殖及迁移的作用

目的 研究Rac1蛋白在人卵巢浆液性腺癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞株SKOV3恶性增殖和迁移的影响.方法 Western blot检测人卵巢浆液性腺癌组织、卵巢良性浆液性囊腺瘤组织及卵巢正常组织中Rac1蛋白的表达水平;构建Rac1表达缺失的细胞株SKOV3-Rac1i;分别用细胞划痕实验、MTT及平板克隆实验检测SKOV3-Rac1i细胞迁移能力、细胞增殖及克隆形成能力.结果 卵巢浆液性腺癌组织中Rac1蛋白表达水平显著高于卵巢良性浆液性囊腺瘤组织[(0.89 ±0.17)vs(0.69 ±0.24),P＜0.05]和卵巢正常组织[(0.89±0.17) vs (0.72±0.12),P＜0.05];与亲代细胞相比,SKOV3-Rac1i细胞表现出迁移能力减弱(P＜0.05)和增殖能力明显受限(P＜0.05).结论 Rac1在人卵巢浆液性腺癌组织中呈高表达,其可能是通过影响细胞迁移能力及细胞的增殖而促进卵巢癌细胞的恶性生物行为.     

Survivin反义核酸对SKOV3细胞生长及Survivin基因表达的影响

目的 :观察Survivin反义核酸对人卵巢癌细胞系SKOV3的生长及Survivin基因表达的影响。方法 :应用基因重组技术 ,将在真核细胞中能稳定表达反义Survivin的pcDNA3 SVVas经脂质体LipofectamineTM2 0 0 0 介导转染人卵巢癌细胞株SKOV3,经G4 1 8筛选得到抗性克隆 (SKOV3/SVVas) ,同时以空载体pcDNA3转染SKOV3作为对照(SKOV3/neo) ;绘制细胞生长曲线 ;采用免疫组化、RT PCR和流式细胞仪检测SKOV3、SKOV3/neo及SKOV3/SVVas细胞的内源性SurvivinmRNA及蛋白的表达和凋亡细胞。结果 :与SKOV3及SKOV3/neo细胞比较 ,SKOV3/SVVas细胞增殖和代谢能力均明显降低 ,Survivin蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量明显降低 (P <0 .0 1 ) ,细胞凋亡率显著增加 (P <0 .0 1 )。结论 :稳定表达的反义Survivin能够有效抑制SKOV3细胞内源性Survivin蛋白的表达 ,诱导SKOV3细胞凋亡。