水产品中无色孔雀石绿的悬液芯片检测方法研究

目的建立水产品中无色孔雀石绿(LMG)的悬液芯片检测法。方法向聚苯乙烯微球中加入14μg/100μl的LMG抗原,利用碳二亚胺法使抗原与微球偶联构成捕获抗原。加入含LMG的样品,使用1∶800倍稀释的LMG单克隆抗体及藻红蛋白标记的二抗,37℃孵育1 h后在悬液芯片仪上检测平均荧光强度值并计算样品中LMG的含量。结果在10~100ng/ml的线性范围内,所得体系的回归方程为ΔF=2 035.6c+22.4,r=0.999 8。方法的检出限为0.125 ng/ml,加标回收率在88.7%~93.6%之间,RSD为3.2%~7.6%。结论该方法的灵敏度高,特异性好,可作为一种高通量检测的新技术用于水产品中无色孔雀石绿残留的分析。     

编码微球悬浮芯片与改良ELISA鼠疫杆菌检测方法的比较研究

[目的]寻求快速、准确、简便的鼠疫杆菌检测方法。[方法]分别建立鼠疫杆菌编码微球悬浮芯片检测方法和改良ELISA方法,并进行比较。[结果]悬浮芯片对F1抗原最低可以检测到840 pg/ml,检测鼠疫杆菌到1×10~3cfu/ml；用改良ELISA法检测,对F1最低可以检测到53ng/ml,检测鼠疫杆菌到1×10~4cfu/ml。[结论]悬浮芯片检测比ELISA具有更高检测灵敏度,并且具有高效、快速、敏感、特异、低成本等优点。     

基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒核酸液相芯片检测方法的建立

目的建立基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒核酸液相芯片检测方法。方法建立探针偶联至荧光微球、多重PCR扩增方法、杂交检测方法,并对所建立的液相芯片检测方法的灵敏度和特异性进行评价。结果建立的液相芯片检测方法能对基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒中的任意1种、任意2种或者3种同时进行筛查检测,基孔肯亚热病毒检测的灵敏度为1×104copies/PCR,克里米亚-刚果出血热病毒检测的灵敏度为1×105copies/PCR,裂谷热病毒检测的灵敏度为1×103 copies/PCR。该方法对汉坦病毒、埃博拉病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、马尔堡病毒的检测结果均为阴性。结论该方法具有高通量、多重检测、快速、敏感、特异的特点,为基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒的筛查检测提供一种新方法。     

悬浮芯片法与生物素-亲和素ELISA法检测炭疽杆菌芽孢比较研究

〔目的〕建立快速、敏感、特异、高通量、同时检测多种病原体的技术方法。〔方法〕建立基于双抗体夹心免疫学检测的编码微球悬浮芯片和生物素-亲和素ELISA方法,比较2种方法对炭疽芽孢杆菌定量检测以及直接从＂白色粉末＂样品中检测的能力。〔结果〕悬浮芯片对炭疽杆菌芽孢检测具有很好的敏感性和特异性,最低检出限为4.2×103cfu/ml,动态范围为103-107cfu/ml;生物素-亲和素ELISA最低可以检测到1.4×104 cfu/ml,线性范围为104-107cfu/ml。〔结论〕悬浮芯片方法检测炭疽杆菌芽孢比ELISA方法具有更高的灵敏度和更宽的动态检测范围,在病原菌的早期识别、快速诊断、应对生物恐怖威胁、控制传染病爆发中具有广阔的应用前景。     

悬浮芯片技术在微生物核酸检测中应用进展

[目的]了解悬浮芯片技术在微生物核酸检测中的应用情况.[方法]对文献进行综述评价.[结果]悬浮芯片技术是基于编码微球技术和流式细胞仪技术的一个多功能生物芯片平台,它有机地整合了编码微球、激光技术、微流体技术、快速信号处理和数据分析系统,具有高通量、重复性好、灵敏度高、准确性好、易于标准化、同时定性定量分析等独特优点.[结论]悬浮芯片技术独具优势,在微生物核酸检测领域已经得到广泛的应用.     

A METHOD FOR RAPID DIAGNOSIS OF A(H1N1) INFLUENZA VIRUS BY USING SUSPENSION CHIP

目的 建立一种可快速诊断甲型H1N1流感病毒的悬浮芯片方法,为研制快速检测H1N1流感病毒试剂盒奠定基础.方法 针对HIN1特有的NA基因、HA基因、NS基因序列设计引物,在下游引物末端用生物素标记.根据3个基因扩增区内的核酸序列设计特异性探针,探针末端修饰氨基C12,以便把特异性的核酸探针共价结合到用彩色荧光编码的微球表面.采用液态悬浮杂交方法,将微球与生物素标记的目标物进行杂交,通过结合的链霉亲和素藻红蛋白,检测目标物.结果 所设计的探针没有交叉反应,单通道检测探针灵敏度HA基因为1.6 nmol/L,NA基因、NS基因均为8.0 nmol/L;多通道检测的探针灵敏度为1.6 nmoL/L.结论 该方法准确、灵敏度高,可以用于下一步悬浮芯片检测试剂盒的研制.     

悬浮芯片定量检测鼠疫菌的方法研究

目的利用编码微球悬浮芯片技术,探讨直接从"白色粉末"样品中检测鼠疫菌的可行性,为建立快速、敏感、特异、高通量、同时检测多种生物恐怖因子的技术平台奠定基础。方法用抗体包被编码微球作为反应载体,双抗体夹心法为反应模式,建立鼠疫菌F1抗原悬浮芯片检测方法,对"白色粉末"中的鼠疫耶尔森菌进行检测。通过盲样和标准实验室检测评估对现场样品的适用性。结果建立的定量检测鼠疫菌F1抗原的悬浮芯片方法具有较高的特异性和敏感性,并在0.154～4514ng/ml浓度范围内具有良好的动力学响应特性,比ELISA方法有较高的灵敏度和较宽动态检测范围。结论定量检测鼠疫菌的悬浮芯片方法能快速、敏感、特异地定量检测"白色粉末"中鼠疫菌,在早期识别、快速诊断和应对生物恐怖威胁、传染病暴发中具有广阔的应用前景。     

基于新型悬浮芯片的13种/型经呼吸道感染病毒高通量检测方法

目的基于目标特异性引物延伸(TSPE)技术的新型基因悬浮芯片,建立高通量、快速、准确、可同时检测多种呼吸道病原的方法。方法针对流感病毒A、B型,副流感病毒1、3型,冠状病毒SARS-Co V、Co V-NL63、呼吸道合胞病毒A、B型,腺病毒B、E型,鼻病毒、人偏肺病毒、肠道病毒共13种/型经呼吸道感染病毒的特异性基因序列,设计13对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增及TSPE反应,生物素标记对应基因片段,标记的片段与相应微球结合,悬浮芯片扫描仪检测。结果悬浮芯片检测体系能正确检测13种/型经呼吸道传播的病毒及其亚型,各探针间无交叉反应,特异性好、灵敏度高。结论建立了高通量、快速、准确的可同时检测多种呼吸道病原的技术平台,为突发呼吸道传染病的鉴定和检测提供技术储备,有利于及时应对传染病疫情。     

复合检测5种重要发热病原悬浮芯片筛查方法的建立

目的建立同时检测甲型流感病毒、人禽流感病毒、鼠疫耶尔森菌、SARS冠状病毒、结核分枝杆菌5种发热病原抗体蛋白悬浮芯片方法。方法分别用各病原体的诊断抗原耦联不同编码的微球作为反应载体,采用间接反应模式,建立蛋白悬浮芯片方法检测引起发热体征的5种病原的特异性抗体,在同一反应体系中对人血清中的流感、禽流感、鼠疫、SARS、肺结核等特异性抗体进行复合检测。结果建立的蛋白悬浮芯片5种病原抗体快速筛查系统具有较高的特异性和敏感性,同时检测鼠抗流感NPIgG、兔抗禽流感H5N1IgG、兔抗鼠疫F1IgG、兔抗SARSNIgG、兔抗结核分枝杆菌IgG的检测灵敏度分别为968.80ng/ml、69.40ng/ml、6.30ng/ml、15.50ng/ml、1.60ng/ml。结论重要发热病原悬浮芯片快速筛查系统能快速、敏感、特异、同时检测人血清中的5种病原抗体,对口岸出入境人员是否携带病原的快速筛查具有广阔的应用前景。     

8种重大烈性传染病病毒液相芯片检测方法的建立

目的建立基于多重PCR技术结合液相芯片技术同时检测汉坦病毒（HTV）、裂谷热病毒（RVFV）、黄热病毒（YFV）、西尼罗病毒（WNV）、克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）、拉沙热[下同]病毒（LFV）、埃博拉病毒（EBV）和马尔堡病毒（MBV）的方法。方法建立8种病毒同时扩增的多重PCR反应体系,分别用各种病毒特异的核酸探针偶联不同编码的微球,将获得的PCR产物与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,建立液相芯片检测方法,并对建立的液相芯片检测方法进行灵敏度及特异性检测评价。结果建立的8种重大烈性传染病病毒的液相芯片筛查方法具有较高的特异性和敏感性,能对8种病毒进行特异的检测。灵敏性实验结果表明,RVFV为10 ng/PCR、WNV为1 ng/PCR、EBV为10 ng/PCR、CCHFV为10 pg/PCR、MBV为1 ng/PCR、HTV为100 pg/PCR、LFV为1 ng/PCR、YFV为10 pg/PCR。结论本研究建立的病毒液相芯片筛查方法能快速、敏感、特异地同时检测8种重大烈性传染病病毒,对口岸入境人员是否携带重大烈性传染病病毒的快速筛查具有广阔的应用前景。     

蛋白质芯片检测血清铁蛋白条件的优化研究

目的优化蛋白芯片检测血清铁蛋白(serum Ferritin,SF)的技术条件。方法用芯片点样仪将血清铁蛋白的一种抗体点样于高分子三维基片G(PSG)芯片上,用其另一种抗体做为检测抗体,以Cy3标记的羊抗做为二抗进行检测。以双抗夹心原理对SF抗原进行检测。结果以SF单克隆小鼠抗体为固定探针,选择接触式点样进行芯片点样,点样数在40-200点之间可出现较好的点样一致性;SF的固定探针浓度选择为0.5 mg/ml,其检测抗体的浓度为5μg/ml;3%小牛血清白蛋白(BSA)和羊抗兔IgG被优选为封闭剂与第二抗体。SF检测下限与生物检测限分别为3.1 ng/ml和4 ng/ml;建立了对SF具有最佳相关系数的标准方程(SF相关系数0.9999)与标准曲线。结论此研究优化了蛋白芯片检测SF的检测条件,建立了定量检测SF的蛋白芯片平台。     

2013-2017年江苏省动物性食品中硝基呋喃类代谢物膳食暴露分析

目的 了解2013-2017年江苏省动物性食品中硝基呋喃类代谢物污染状况,分析其膳食暴露水平,为保障食品安全、加强监管提供科学依据。方法 根据国家食品安全风险监测工作要求,按照标准操作程序检测1682份样品硝基呋喃类代谢物残留,结合居民食物消费状况,使用@RISK软件建立污染物累积膳食暴露模型,分析其人体膳食暴露风险。结果 被硝基呋喃类代谢物污染的动物性食品主要为鸡蛋、鸡肉和水产品,污染物总体检出率为3.98%,其中鸡肉中AMOZ检出值高达144.0μg/kg,鱼肉中SEM最高检出值为41.0μg/kg。每人每天膳食中该类污染物平均暴露量为0.13μg,即2.03×10-3μg/kg BW,污染物P99暴露量为1.01μg,即1.59×10-2μg/kg BW。结论 膳食暴露评价结果显示此范围内硝基呋喃类代谢物对人体健康损害很小,但违规使用硝基呋喃类药物的现象比较严重,因此建立健全兽药监控管理体系,定期开展动物性食品兽药残留风险评估工作,构建动物性食品安全风险预警系统将有效降低人体污染物暴露水平。     

Screening and Analysis of Multiclass Veterinary Drug Residues in Animal Source Foods using UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS

A rapid, simple, and sensitive method of detecting veterinary drug residues in animal food sources, including poultry and pork, was developed and validated. The method was optimized for over 155 veterinary drugs of 21 different classes. Sample pretreatment included a simple solid-liquid extraction step with 0.2% formic acid-acetonitrile-water and a purification step with a PRiME HLB (hydrophile-lipophile balance) solid-phase extraction cartridge. Data were collected using ultra-high-performance liquid chromatography coupled to Quadrupole-Exactive Orbitrap mass spectrometry. The limits of detection of 155 veterinary drugs ranged from 0.1 µg/kg to 10 µg/kg. The recovery rates were between 79.2 and 118.5 % in all matrices studied, with relative standard deviation values less than 15% (n = 6). The evaluated method allows the reliable screening, quantification, and identification of 155 veterinary drug residues in animal source food and has been successfully applied in authentic samples.

     

呋喃西林涂层尿管的制作方法及药物缓释效果研究

目的 研制可预防尿路感染的呋喃西林洗脱可降解涂层硅橡胶导尿管(新型尿管).方法 以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体,呋喃西林为抗菌物质,使用浸涂提拉法制造尿管涂层；采用改良高效液相色谱法(RP-HPLC)测定呋喃西林浓度,评估新型尿管的药物缓释效果.结果 以374 nm为紫外检测波长,测得浓度为8.00、24.00、40.00、56.00、80.00 μg/ml呋喃西林溶液的色谱峰面积分别为3.6621×106、10.8524×106、18.3275×106、26.9443×106和36.6285×106,回归方程为:A=4.6464×105C-4.5961×104,r=0.9990,线性关系良好；以该法测得新型尿管涂层连续释放7d的色谱峰面积分别为29.673×105、23.562×105、16.851×10 5、14.524×105、9.562×105、7.395×105和4.231×105,药物释放曲线符合2阶多项式:y=38320×X2-720661×X+4×106,r=0.9969,药物释放的色谱峰面积及相对药物保留浓度都随时间的延长而减少.结论 以14d为界设计的尿管药物涂层缓释效果理想,有望用于预防短期留置尿管感染.     

百草枯完全抗原及多克隆抗体的制备

目的改造百草枯(Paraquat PQ)半抗原,制备百草枯完全抗原及多克隆抗体,为建立酶联免疫吸附方法及其在食品安全快速检测中的应用奠定基础。方法改造半抗原PQ-hap,混合酸酐法合成免疫原(PQ-BSA)和包被原(PQ-OVA),采用SDS-PAGE电泳和质谱对其鉴定,免疫家兔2只,制备多克隆抗体;间接ELISA对其进行效价、灵敏度和特异性检测。结果成功合成百草枯免疫原和包被原,6次免疫后2只家兔血清的效价分别达到1∶40 000和1∶160 000,抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为281.6 ng/ml和98.4 ng/ml,与百草枯类似物没有明显交叉反应。结论合成的百草枯完全抗原具有较好的免疫原性,产生的抗百草枯多克隆抗体具有较好的灵敏度和特异性。     

烟台市806份动物源性食品中违禁药物及兽药残留检测

目的 了解烟台市动物源性食品中违禁药物及兽药残留的污染情况。方法 采用随机采样的方法,于2012-2017年于烟台辖区内养殖环节、运输环节、流通环节和餐饮环节,采集动物源性食品806份,依据GB/T 22338-2008和《2013年国家食品污染和有害因素风险工作手册》中兽药及违禁药物检测的标准操作程序进行检测。结果 违禁药物及兽药残留总体检出率为261%(21/806)。13份样本中9种违禁药物检出,违禁药物样本检出率为161%(13/806)。其中2份鸡肉中均检出氧氟沙星和诺氟沙星,检出率分别为571%(2/35)和571%(2/35)。2份鸡蛋中检出强力霉素,检出率为8%(2/25)。2份猪肉、2份牛羊肉、1份动物内脏存在β-受体激动剂的检出,检出率分别为247%(2/81)、351%(2/57)和161%(1/62)。2份双壳类和2份鱼类水产品中有硝基呋喃代谢物检出,检出率分别为5%(2/40)和247%(2/81)。10份样本中4种兽药残留检出,兽药残留样品检出率为124%(10/806)。分别为8份鸡肉中检出达氟沙星和环丙沙星,检出率分别为2286%(8/35)和571%(2/35)。2份鸡肉中检出强力霉素和金霉素,检出率分别为8%(2/25)和4%(1/25)。结论 烟台市动物源性食品中违禁药物及兽药存在一定程度的残留污染,表明存在违禁药物及兽药滥用现象,建议强化规范生产和监督管理,保障食品安全。     

The influence of diisocyanate antigen preparation methodology on monoclonal and serum antibody recognition

Exposure to diisocyanates (dNCOs), such as methylene diphenyl diisocyanate (MDI) can cause occupational asthma (OA). Currently, lab tests for dNCO specific IgE are specific, but not sensitive, which limits their utility in diagnosing dNCO asthma. This may be due to variable preparation and poor characterization of the standard antigens utilized in these assays. The aim of this study was to produce and characterize a panel of antigens prepared using three different commonly employed methods and one novel method. The conjugates were examined for recognition by anti-MDI monoclonal antibodies (mAbs) in varying enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) formats, extent of crosslinking, total amount of MDI, the sites of MDI conjugation, relative shape/charge, and reactivity with human serum with antibodies from sensitized, exposed workers. Results indicate that while there are minimal differences in the total amount of MDI conjugated, the extent of crosslinking, and the conjugation sites, there are significant differences in the recognition of differently prepared conjugates by mAbs. Native and denaturing polyacrylamide gel electrophoresis demonstrate differences in the mobility of different conjugates, indicative of structural changes that are likely important for antigenicity. While mAbs exhibited differential binding to different conjugates, polyclonal serum antibodies from MDI exposed workers exhibited equivalent binding to different conjugates by ELISA. While differences in the recognition of the different conjugates exist by mAb detection, differences in antigenicity could not be detected using human serum from MDI-sensitized individuals. Thus, although dNCO conjugate preparation can, depending on the immunoassay platform, influence binding of specific antibody clones, serologic detection of the dNCO-exposure-induced polyclonal antibody response may be less sensitive to these differences.     

雌二醇完全抗原及多克隆抗体的制备

目的 改造雌二醇半抗原,合成雌二醇完全抗原,并经免疫家免得到抗雌二醇多克隆抗体,为建立雌二醇的酶联免疫吸附方法及其在动物性食品安全快速检测中的应用奠定基础.方法 改造雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME),碳二亚胺(EDC)法合成免疫原(E2-BSA)和包被原(E2-OVA),采用SDS-PAGE电泳和质谱(MS)对其鉴定,免疫家兔2只,制备多克隆抗体;间接ELISA测定效价、灵敏度和特异性.结果 成功合成雌二醇免疫原和包被原,6次免疫后E2-T1和E2-T2抗血清的效价分别达到1∶128000和1∶32000,E2-T1抗体和E2-T2抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为44.00 ng/ml和45.59 ng/ml,与雌二醇类似物没有明显交叉反应.结论 合成的雌二醇完全抗原具有较好的免疫原性,产生的抗雌二醇多克隆抗体具有较好的特异性.     

Nano- and microparticles as adjuvants in vaccine design: success and failure is related to host natural antibodies

Bovine serum albumin (BSA) and the surface A-layer protein (AP) of an atypical strain of fish bacterial pathogen Aeromonas salmonicida were covalently linked with polymeric nano- and microparticles, and antigenicity of the resulted conjugates was compared in mice and goldfish. Distinct albeit different levels of natural BSA and AP antibodies were present in both animal species. Significant stimulation of the anti-AP antibody response in mice strikingly contrasted to unresponsiveness or even suppression in fish. The results negatively correlate with the levels of respective natural antibodies in the host and are discussed in context of problems related to fish vaccination. The work reinforces the instructive role of natural antibodies in adaptive immune response.