p16^INK4a、p19^ARF、p15^INK4b基因及其在急性T淋巴细胞白血病中的研究进展

p16^INK4a、p19^ARF、p15^INK4b基因是位于染色体9p21的相邻基因。它们均为肿瘤抑制基因，但是它们的肿瘤抑制机理各不相同。已发现在急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）中其失活率很高。且它们的失活与T细胞的TCR重排有关。本对近年来p16^INK4a、p19^ARF、p15^INK4b结构与功能及其在T-ALL中的改变的研究进展作一综述，以阐明它们对T-ALL的发生与发展有极其重要的作用。     

P15^INK4B基因甲基化与骨髓增生异常综合征

骨髓增生异常综合征(MDS)是一种造血干细胞的克隆性疾病，容易进展为急性白血病。P15^INK4B基因为人类肿瘤抑制基因，在负向调节造血细胞增生和阻止其恶性转换中起着重要的作用。近来研究显示P15^INK4B基因高度甲基化与MDS的发生、发展具重要关系，越是疾病进展期，P15^INK4B基因甲基化出现越频繁。5-氮杂胞苷(5-azacytidine)和5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶(decitabine)用于治疗MDS患者已取得一定效果，三氧化二砷的体外试验显示其具有抑制MDS细胞株生长和去甲基化作用。去甲基化治疗有望成为今后治疗MDS的有效方案之一。     

p16INK4a、p19ARF、p15INK4b基因及其在急性T淋巴细胞白血病中的研究进展

p16INK4a、p19ARF、p15INK4b基因是位于染色体9p21的相邻基因.它们均为肿瘤抑制基因,但是它们的肿瘤抑制机理各不相同.已发现在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中其失活率很高.且它们的失活与T细胞的TCR重排有关.本文对近年来p16INK4a、p19ARF、p15INK4b结构与功能及其在T-ALL中的改变的研究进展作一综述,以阐明它们对T-AlL的发生与发展有极其重要的作用.     

三氧化二砷诱导人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1细胞p15INK4B基因表达的研究

目的 探讨三氧化二砷（As2O3)去甲基化作用的机制。方法 采用甲基化特异PCR（MSP）检测p15INK4B基因甲基化，RT－PCR方法检测p15，甲基转移酶（DNMT）1，DNMT3A，DNMT3B的表达，MTT法检测As2O3对MUTZ－1细胞的生长抑制。结果 MUTZ－1细胞有p15INK4B基因甲基化，p15基因弱表达，As2O3作用后p15INK4B基因甲基化程度明显下降，p15基因表达增强，DNMT3A，DNMT3B mRNA的表达下降并呈浓度依赖性。结论 As2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A，DNMT3B，或（和）直接对p15INK4B基因去甲基化，使p15基因表达上调，恢复共活性。     

P15INK4B基因甲基化与骨髓增生异常综合征

骨髓增生异常综合征(MDS)是一种造血干细胞的克隆性疾病,容易进展为急性白血病.P15INK4B基因为人类肿瘤抑制基因,在负向调节造血细胞增生和阻止其恶性转换中起着重要的作用.近来研究显示P15INK4B基因高度甲基化与MDS的发生、发展具重要关系,越是疾病进展期,P15INK4B基因甲基化出现越频繁.5-氮杂胞苷(5-azacytidine)和5-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶(decitabine)用于治疗MDS患者已取得一定效果,三氧化二砷的体外试验显示其具有抑制MDS细胞株生长和去甲基化作用.去甲基化治疗有望成为今后治疗MDS的有效方案之一.     

白血病等恶性血液病中p15基因甲基化的检测及临床意义

p15基因位于染色体 9p2 1,是一种肿瘤抑制基因 ,其编码产物p15蛋白特异地抑制细胞周期素依赖激酶 4 6 (CDK4 6 ) ,使细胞不能通过G1 期和S期间的监测点 ,从而停留在G1 期。血液系统恶性肿瘤有高频率的p15基因失活[1 ] ,研究发现 5′启动子及转录启始区域内的CpG岛的异常甲基化是p15基因的主要失活方式[2 ] 。Herman等[3] 研究出甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法。对象和方法1　研究对象　急性白血病患者共 4 0例 ,男 2 2例 ,女 18例 ,年龄 14～ 76岁 ,均符合FAB诊断和分型标准 ;其中初治或…     

5′-杂氮-2′-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨 5′ 杂氮 2′ 脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine ,5 Aza CdR ,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征 (MDS)细胞体外作用的机制。以人MDS RAEB细胞株MUTZ 1细胞为研究对象 ,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率 ;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸 (PS)转位及细胞凋亡 ;用RT PCR检测 p15INK4B基因、甲基转移酶 (DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表达 ;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测 p15INK4B基因甲基化程度。结果表明 :5 Aza CdR对MUTZ 1细胞有生长抑制作用 ;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变。p15INK4B基因甲基化程度随 5 Aza CdR剂量增加而减弱 ,伴随 p15INK4B基因mRNA表达增加。经 3.2mmol/L 5 Aza CdR作用 4 8小时后 ,MUTZ 1细胞DNMT3A mRNA表达水平较未加药组明显下降 (灰度比为 0 .385∶0 .6 5 4 ,P <0 .0 5 ) ,DNMT1、DNMT3B mRNA表达水平与未加药组相比无明显改变。结论 :在 0 .4 - 6 .4mmol/L浓度范围 5 Aza CdR通过诱导MUTZ 1细胞凋亡而抑制该细胞生长 ,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一。 5 Aza CdR可能通过下调DNMT3A mRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降 ,从而恢复其表达。     

VPA和As2O3对Molt-4细胞的协同作用及可能机制

本研究探讨丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）单药或与亚砷酸（arsenie trioxide，As2O，3）联用对人急性T细胞白血病细胞株Molt-4增殖活力的抑制、去甲基化作用及其可能机制。用MTT法检测药物对细胞增殖的抑制作用，利用金氏公式观察两药联用体外抗癌的协同作用。采用半巢式甲基化特异PCR（hnMS—PCR）检测p15INK4B基因甲基化，RT—PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMT3B的表达。结果表明：VPA和As2O3均可明显抑制细胞增殖，二者联用在体外有相加作用（Q值均大于0．85），在5mmol／LVPA与10μmol／LAs2O3联用时抑制率达（70．31±2．54）％。Molt-4细胞p15基因因高甲基化而失表达，经VPA和As2O3联合作用后p15基因甲基化程度明显下降，p15基因表达增强，两药联用时DNMT-1、DNMT-3A、DNMT3B mRNA的表达都有下降。结论：VPA可能通过抑制DNA甲基转移酶DNMT-1和（或）DNMT3B使p15INK4B基因去甲基化，使p15基因表达上调，恢复其活性。VPA和As2O3均可明显抑制Mol-4细胞增殖，两药合用有协同相加作用，可减少砷剂的副作用。     

5''''-杂氮-2''''-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨5'-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征(MDS)细胞体外作用的机制.以人MDS-RAEB细胞株MUTZ-1细胞为研究对象,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)转位及细胞凋亡;用RT-PCR检测p15INK4B基因、甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测p15INK4B基因甲基化程度.结果表明5-Aza-CdR对MUTZ-1细胞有生长抑制作用;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变.p15INK4B基因甲基化程度随5-Aza-CdR剂量增加而减弱,伴随p15INK4B基因mRNA表达增加.经3.2mmol/L 5-Aza-CdR作用48小时后,MUTZ-1细胞DNMT3AmRNA表达水平较未加药组明显下降(灰度比为0.3850.654,P＜0.05),DNMT1、DNMT3BmRNA表达水平与未药组相比无明显改变.结论在0.4-6.4 mmol/L浓度范围5-Aza-CdR通过诱导MUTZ-1细胞凋亡而抑制该细胞生长,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一.5-Aza-CdR可能通过下调DNMT3AmRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降,从而恢复其表达.     

骨髓增生异常综合征发病机制的研究进展

骨髓增生异常综合征(MDS)是源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病。MDS的发生发展过程中,包含了骨髓细胞的凋亡、增殖及克隆扩张等多重机制。不同克隆的产生,可能与控制细胞凋亡或生长分化的基因有关。肿瘤坏死因子-α、Fas抗原以及增殖的T细胞克隆参与了MDS的发病机制。MDS向白血病的转化与p15INK4b基因的高度甲基化有关。     

p15^INK4B基因甲基化在急性普细胞白血病和慢性粒细胞白血病中的研究

为探索ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因在ＣｐＧ岛高甲基化对白血病发病机制的重要作用,应用敏感的甲基化特异的ＭＳＰ－ＰＣＲ的测定方法,测定了ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因在急性粒细胞白血病（ＡＭＬ）和慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中甲基化的表达变化,研究结果表明,ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因操纵区在ＡＭＬ和ＣＭＬ中的甲基化发生率分别为８３．９％（２６／３１）和０％（０／２８）。结论提示：甲基化是ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因在ＡＭＬ中主要的失活方式之一,并可在病程进展中出现甲基化,使病情加重,在ＣＭＬ中无基化的发生,说明ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因的功能在ＣＭＬ中可能是完整的。     

恶性血液病中的P15^INK4B基因甲基化

目的 探索特定基因操纵区ＣｐＧ岛高甲基化对人类造血系统恶性肿瘤的作用。方法 利用甲基化特异性聚合酶链反应（ＭＳＰ）的方法,用亚硫酸氢钠修饰后的ＤＮＡ为模板进行甲基化特异性聚合酶链反应（ＰＣＲ）,测定了２５例急性髓系白血病（ＡＭＬ）,１５例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）,１６例骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）和１２例多发性骨髓瘤（ＭＭ）患Ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因在操纵区５′－ＣｐＧ岛异常甲基化的发生率。结果 Ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因异常甲基化的发生率：ＡＭＬ为８４％,ＣＭＬ为０,ＭＤＳ为５０％,ＭＭ为７５％。高危型的ＭＤＳ较低危型更易发生甲基化,在ＭＭ中,Ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ甲基化一般发生在早期,与骨髓象的幼稚程度关系密切。结论 调节细胞生长和分化的Ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因高甲基化是使Ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因失活的主要原因之一,     

实时定量PCR检测骨髓增生异常综合征患者多个基因甲基化水平

目的 了解骨髓增生异常综合征(MDS)患者p15、CDH1、DAPK和HICI基因的甲基化情况,探讨其与临床特征的关系.方法 通过实时荧光定量PCR方法检测52例MDS、38例初诊AML患者和46名正常人骨髓或外周血4种基因的甲基化水平,并分析MDS患者基因的甲基化水平与其临床和实验室特征的关系.结果 MDS患者骨髓p15、CDH1、DAPK和HICI基因的甲基化水平分别为16.23±21.69、6.59±9.39、0.14±0.11和7.81±9.70,外周血为14.96±20.16、6.00±9.26、0.12±0.14和6.74±9.72,骨髓与外周血4种基因甲基化水平差异无统计学意义(P值均＞0.05).MDS-RAEB Ⅰ/Ⅱ患者骨髓或外周血p15及CDH1基因的甲基化水平(分别为14.70±18.17和6.61±8.79)较MDS-RCUD/RARS/5q-(分别为1.99±1.59,1.23±1.14)、MDS-RCMD(分别为3.02±3.42和1.53±2.06)和正常对照组(分别为1.69±1.82和1.01±1.12)显著升高(P值均＜0.05);各分型之间DAPK基因甲基化水平差异均无统计学意义;而HIC1基因甲基化水平仅在RAEB Ⅰ/Ⅱ(9.16±11.95)与对照组(2.49±2.26)差异有统计学意义(P=0.042).不同分型组间骨髓样本4种基因(p15、CDH1、DAPK和HICI)甲基化水平差异有统计学意义(P值分别为0.001、0.003、0.039、0.023);不同分型组间外周血样本p15及DAPK基因的甲基化水平差异有统计学意义(P值分别为0.013、0.006).p15基因甲基化水平与IPSS分型、原始细胞百分数、血小板计数有相关性;CDH1基因甲基化水平与IPSS分型、原始细胞百分数有相关性;DAPK基因甲基化水平仅与年龄有相关性;HIC1基因甲基化水平与各项指标均无相关性.结论 p15和CDH1基因是MDS中较为特征性出现的高度甲基化基因,HIC1甲基化水平从低危至高危组有升高趋势,DAPK基因虽然在各分型中均能检测到甲基化,但水平较低,而四种基因的甲基化水平与MDS疗效或预后的关系有待于进一步研究.

Abstract：

Objective To analyze the promoter methylation levels of p15、 CDH1、 DAPK and HICI genes of patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and explore the relationship between the level of methylation and clinical features. Methods DNA methylation levels of p15、CDH1 、DAPK and HICI in peripheral blood (PB) or bone marrow (BM) samples from 52 MDS patients were detected by real-time quantitative PCR. The correlation of the methylation level with clinical features and hematological findings was analyzed. 38 de novo AML patients and 46 normal individuals served as controls. Results The methylation levels of p15 、CDH1 、DAPK and HICI were 16.23 ± 21.69,6.59 ±9.39,0. 14 ±0. 11 and 7.81 ± 9.70 in BM,and 14.96 ± 20.16,6.00 ± 9.26,0.12 ± 0. 14 and 6.74 ± 9.72 in PB, respectively from 18 MDS patients,and the difference between BM and PB was not statistically significant (P ＞0.05). The methylation levels of p15 (14.70 ± 18.17) and CDH1 (6.61 ±8.79) genes in high risk (RAEB Ⅰ / Ⅱ) MDS were significantly higher than in low risk (RCMD/RARS/5q -, p15: 1.99 ± 1.59, CDH1: 1.23 ± 1.14 and RCMD, p15:3.02 ±3.42, CDH1:1.53 ±2.06) MDS or control (p15:1.69 ± 1.82, CDH1: 1.01 ± 1.12) (P ＜0.05).The methylation levels of DAPK gene had no difference among subtypes of MDS, and that of HIC1 gene only differed between RAEB Ⅰ / Ⅱ (9.16 ± 11.95) and control (2.49 ± 2.26) (P = 0. 042). The difference of methylation levels of p15 、CDH1 、DAPK and HICI in BM was statistically significant among subtypes of MDS (P=0. 001, 0. 003 ,0. 039,0. 023 , respectively). And so did of p15 and DAPK in PB (P=0. 013, 0.006,respectively). The methylation level of p15 and CDH1 was significantly correlated with IPSS classification and blasts percentage in BM. Conclusions p15 and CDH1 genes are special hepermethylation genes in MDS.Methylation level of HIC1 gene showed an upward tendency from low risk to high risk MDS.     

骨髓增生异常综合征向急性髓系白血病转化相关基因的研究进展

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组起源于造血干细胞的高度异质性、高风险向急性髓系白血病转化的恶性克隆性疾病。随着分子生物学技术的不断发展,发现了多种基因与MDS向急性髓系白血病转化（转白）密切相关。SRSF2是与RNA剪接相关的基因,该基因突变提示患者可能预后不良,并较未突变者有更高向AML转化的几率;与DNA甲基化密切相关的DNMT3A,其突变多预示较差的总生存率,并可能更快地向AML转化;调节组蛋白合成的ASXL1,其框移突变是预后不良的分子标志,并且较无突变者有更快向AML转化的现象;与三羧酸循环密切相关的IDH又可分为IDH1与IDH2,前者多提示较短的生存时间以及较高的转白率,而有部分报道发现后者在低危组患者中提示不良的预后;另一与DNA甲基化状态密切相关的基因TET2,是目前MDS中最常见的基因突变,有学者认为它可能是一种抑癌基因,但目前其对MDS患者预后影响的观点尚未统一,有报道提示其突变与MDS较快向AML转化有明显关联。因为研究对象人种、地域、临床特点等众多因素的不同,各家报道结果仍存在差异。本文就这五个基因进行综述。     

ZD1839 induces p15INK4b and causes G1 arrest by inhibiting the mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase pathway

Inactivation of the retinoblastoma protein pathway is the most common abnormality in malignant tumors. We therefore tried to detect agents that induce the cyclin-dependent kinase inhibitor p15(INK4b) and found that ZD1839 (gefitinib, Iressa) could up-regulate p15(INK4b) expression. ZD1839 has been shown to inhibit cell cycle progression through inhibition of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3'-kinase-Akt and mitogen-activated protein kinase (MAPK)/extracellular signal-regulated kinase (ERK) cascades. However, the mechanism responsible for the differential sensitivity of the signaling pathways to ZD1839 remains unclear. We here showed that ZD1839 up-regulated p15(INK4b), resulting in retinoblastoma hypophosphorylation and G(1) arrest in human immortalized keratinocyte HaCaT cells. p15(INK4b) induction was caused by MAPK/ERK kinase inhibitor (PD98059), but not by Akt inhibitor (SH-6, Akt-III). Moreover, mouse embryo fibroblasts lacking p15(INK4b) were resistant to the growth inhibitory effects of ZD1839 compared with wild-type mouse embryo fibroblasts. Additionally, the status of ERK phosphorylation was related to the antiproliferative activity of ZD1839 in human colon cancer HT-29 and Colo320DM cell lines. Our results suggest that induction of p15(INK4b) by inhibition of the MAPK/ERK pathway is associated with the antiproliferative effects of ZD1839.     

A novel highly informative polyA microsatellite on the telomeric side of the INK4a/ARF locus

The INK4a/ARF locus encodes two cell cycle-regulatory proteins, p16(INK4a)and p14(ARF). Inactivation of the p16(INK4a)(MTS1) tumor suppressor gene by mutations, promoter methylation or gene deletions is a common event in the development of many different human tumors. The present report describes a novel polyA mononucleotide repeat situated 7.2 kb on the telomeric side of the INK4a/ARF locus. This highly polymorphic microsatellite marker (heterozygote frequency: 0.78) proved to be efficient for p16 allele loss and microsatellite instability analyses in human colon cancer.     

应用X连锁HUMARA基因多态性分析血细胞群的克隆性

目的：探讨血细胞克隆性分析的方法。方法：采用ＰＣＲ和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法对Ｘ连锁人雄激素受体（ＨＵＭＡＲＡ）基因在我国女性中的杂合率以及该基因甲基化位点与Ｘ染色体灭活的相关性进行了研究，并采用ＨＵＭＡＲＡ基因多态性为标志分析了２０名正常女性和３０例女性急性髓系白血病（ＡＭＬ）未治患者的血细胞克隆性。结果：我国女性ＨＵＭＡＲＡ基因的杂合率为８８％，并且其甲基化方式与Ｘ染色体灭活稳定相关，１７名杂合子正常女性中１５名为多克隆性造血，２名呈现假性单克隆造血。２７例杂合子ＡＭＬ患者均为单克隆性造血。结论：Ｘ连锁ＨＵＭＡＲＡ基因多态性是一个很实用的克隆性标志，可用于血细胞的克隆性分析。     

采用甲基化特异性聚合酶链反应研究急性白血病p15基因CpG岛甲基化

目的　探讨ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化作为各型急性白血病通用的基因标志物的可行性。方法　采用甲基化特异性聚合酶链反应（ＭＳＰ）法检测４０ 例初治或复发急性白血病、５ 例完全缓解期白血病及８ 例（ 份） 正常骨髓的ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化,并对ＭＳＰ产物进行序列测定。结果　急性白血病患者ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化阳性率为８０％ ,ＡＭＬ与ＡＬＬ的阳性率（分别为８３％ 和７３％） 差异无显著性;５ 例完全缓解期白血病患者中１ 例ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化阳性（该例患者不久白血病复发）;正常骨髓８ 例均为阴性,表明ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化为白血病细胞所特有;ＭＳＰ产物测序结果与理论结果相符合,ＭＳＰ敏感度可达１０ －３。结论　ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化在各型急性白血病中均有很高的发生率,可以作为各型急性白血病通用的微量残留病（ＭＲＤ） 指标;白血病完全缓解期ｐ１５ ＣｐＧ 岛甲基化仍为阳性可能预示着复发;ＭＳＰ法ＤＮＡ需要量极少,不需要有特异性酶切位点,无同位素污染,对标本要求不高,敏感度高,是甲基化研究的一个简便、敏感、特异的新手段。